駱 婷， 許學(xué)勤， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

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酶解法提取白鰱魚(yú)油的工藝研究及品質(zhì)分析

駱 婷， 許學(xué)勤， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

[目的]為淡水魚(yú)加工副產(chǎn)物的綜合利用及淡水魚(yú)油的提取提供方法和依據(jù)。[方法]采用酶解法對(duì)白鰱腹部進(jìn)行魚(yú)油提取，研究酶的種類、液固比、酶解溫度、pH和酶用量等因素對(duì)魚(yú)油提取率的影響，并對(duì)得到的粗魚(yú)油進(jìn)行理化性質(zhì)和脂肪酸組成分析。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，堿性蛋白酶對(duì)腹部魚(yú)油的提取效果最好，在液固比1.0∶1mL/g的條件下進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳的工藝參數(shù)為：酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此條件下酶解3h得到魚(yú)油提取率為64.32%，魚(yú)油過(guò)氧化值為5.48mmol/kg，碘價(jià)為1 204.20g/kg，皂化價(jià)為169.21mg/g，酸價(jià)為3.56mg/g，其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量分別為6.54%和4.53%，n-3/n-6值為2.89。[結(jié)論]所得魚(yú)油的各項(xiàng)指標(biāo)符合1級(jí)粗魚(yú)油標(biāo)準(zhǔn)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，應(yīng)用前景廣闊。

魚(yú)油；酶解；提??；脂肪酸組成

作為全球淡水魚(yú)生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó)，我國(guó)的淡水漁業(yè)一直處于持續(xù)增長(zhǎng)階段。根據(jù)中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2015年我國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為2 935.76萬(wàn)t，占淡水產(chǎn)品產(chǎn)量的92.74%[1]?，F(xiàn)有的淡水魚(yú)深加工主要集中于魚(yú)糜及魚(yú)糜產(chǎn)品的加工，其綜合利用率只有30%～50%，要提高淡水漁業(yè)的綜合產(chǎn)值、降低淡水魚(yú)制品的成本，就要對(duì)其加工下腳料進(jìn)行充分的加工與利用[2]。

目前淡水魚(yú)加工下腳料主要用于低值魚(yú)粉的加工，并產(chǎn)生魚(yú)油等加工副產(chǎn)物，這兩者主要用于制作飼料和飼料添加物，魚(yú)油的綜合產(chǎn)量低且品質(zhì)較差、附加產(chǎn)值低。與海水魚(yú)相比，淡水魚(yú)油的應(yīng)用和研究較少，主要是因?yàn)榈~(yú)魚(yú)體組織中的魚(yú)油含量較低。根據(jù)GuipuLi等的研究，在對(duì)29種淡水魚(yú)、海水魚(yú)以及蝦的脂肪含量和脂肪酸組成進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)淡水魚(yú)的n-3/n-6值要小于1，n-3多不飽和脂肪酸含量低于n-6，但還有一些大宗淡水魚(yú)，例如白鰱、鳙魚(yú)等具有接近海水魚(yú)油的n-3/n-6值[3]。

現(xiàn)在研究較多的魚(yú)油提取方法有蒸煮壓榨法、溶劑提取法、水酶法以及淡堿水解法等。研究工藝改進(jìn)的主要目的在于提高提取率、減少加工過(guò)程中雜質(zhì)對(duì)環(huán)境的污染[4]。采用添加外源酶的方法分解蛋白獲得魚(yú)油的方法稱為酶解法。酶解法一般采用商業(yè)經(jīng)濟(jì)的食品級(jí)蛋白酶，是一種十分具有發(fā)展前景的提取方法，也是現(xiàn)在研究最為廣泛的提取方法之一。與其他提取方法相比，酶解法在提取效率以及能源重復(fù)利用率方面都具有一定的優(yōu)勢(shì)。筆者選擇大宗淡水魚(yú)之一的白鰱作為試驗(yàn)原料，研究不同酶解條件對(duì)白鰱腹部魚(yú)油提取率以及相關(guān)品質(zhì)的影響，并對(duì)所得魚(yú)油進(jìn)行性質(zhì)分析和脂肪酸組成分析，為開(kāi)發(fā)高價(jià)值的魚(yú)油產(chǎn)品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。原料：白鰱，購(gòu)于華潤(rùn)萬(wàn)家超市(2.5～3.0kg),選用部位為腹部。主要試劑：乙醇、氯仿、碘化鉀、淀粉、冰醋酸、氫氧化鉀等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試劑均為分析純；堿性蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備。JB5374-91電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司；UV1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；UltraScanPro1166高精度分光測(cè)色儀，美國(guó)Hunterlab公司。

1.2方法

1.2.1原料預(yù)處理工藝。取新鮮的白鰱腹部，清洗干凈、去膜、打碎，冷凍備用。

1.2.2酶解法魚(yú)油提取工藝。取冷凍的魚(yú)腹部下腳料，于4 ℃條件下低溫解凍，按照一定的液固比加入蒸餾水進(jìn)行打漿。將其水浴加熱到規(guī)定反應(yīng)溫度后，添加稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)整pH，加入一定量的酶，并在反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解。到規(guī)定時(shí)間后，在95 ℃水浴下加熱10min進(jìn)行滅酶，冷卻后在5 000r/min條件下離心20min，分離上層清油以及中層乳化層，將乳化層按照1∶3的比例加入正己烷并在35 ℃條件下靜置分層，將分離得到的有機(jī)相進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到魚(yú)油，合并兩部分魚(yú)油，進(jìn)行提取率的計(jì)算以及相關(guān)品質(zhì)分析。

1.2.3提取率計(jì)算。魚(yú)油提取率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中,R為魚(yú)油提取率(%)；m1為所得魚(yú)油質(zhì)量(g)；m2為原料中魚(yú)油的質(zhì)量(g)。

1.2.4理化指標(biāo)的測(cè)定。皂化價(jià)測(cè)定：按GB/T5534—1998執(zhí)行；過(guò)氧化值測(cè)定：按GB5538—2005執(zhí)行；酸價(jià)測(cè)定：按GB/T5530—2005執(zhí)行；碘價(jià)測(cè)定：按GB/T5532—1995執(zhí)行。

1.2.5脂肪酸組成分析。采用氣相色譜法測(cè)定。樣品前處理：取適量油脂樣品于離心管中，加入2mL0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液，置于60 ℃水浴加熱40min，冷卻后加入2mL25%BF3-甲醇溶液，繼續(xù)放入60 ℃水浴中進(jìn)行酯化反應(yīng)30min，冷卻后加入2mL正已烷振蕩，最后加入飽和NaCl2mL溶液振蕩，離心取上層有機(jī)相于離心管中進(jìn)行脂肪酸組成分析。分析條件參照文獻(xiàn)[5]。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶種類對(duì)魚(yú)油提取率的影響在液固比為1.2∶1mL/g、酶添加量為10 000U/g的條件下，根據(jù)酶種類選擇合適的酶解pH，在最適反應(yīng)溫度條件下反應(yīng)3h，所得魚(yú)油的提取率見(jiàn)表1。

表1　不同蛋白酶對(duì)酶解效果的影響

從表1可以看出，在上述條件下，對(duì)于白鰱腹部下腳料中魚(yú)油的提取，堿性蛋白酶的提取率最高，同時(shí)堿性蛋白酶水解液中的蛋白回收率最高。從資源再利用以及經(jīng)濟(jì)角度考慮，選用堿性蛋白酶作為下一步的酶解試驗(yàn)用酶。

2.2加酶量對(duì)魚(yú)油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、溫度55 ℃、pH8.5的條件下酶解3h，分別考察酶添加量4 000、6 000、8 000、10 000、12 000U/g時(shí)魚(yú)油提取率的變化情況。從圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，魚(yú)油提取率仍然呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诘孜镂催_(dá)到飽和的情況下，酶量的增加可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解，當(dāng)達(dá)到飽和之后，由于酶自身的水解或者抑制作用，酶解程度降低[6]，因而使油脂釋放不完全，導(dǎo)致提取率降低。結(jié)果表明，在酶添加量為8 000U/g時(shí)，所得魚(yú)油提取率最高。

圖1　不同酶添加量對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.1　Effects of enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.3酶解溫度對(duì)魚(yú)油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、pH8.5的條件下酶解3h，考察酶解溫度45、50、55、60、65、70 ℃條件下魚(yú)油提取率的變化情況。從圖2可以看出，在酶解溫度55 ℃以下時(shí)，溫度的升高使得魚(yú)油的提取率有較為明顯的提升。其原因可能是因?yàn)闇囟壬呤沟妹富钚缘玫教嵘?，而且能夠加快體系內(nèi)分子的熱運(yùn)動(dòng)，使得酶解效率提高，酶促反應(yīng)更加完全。當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃之后，魚(yú)油提取率隨溫度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榈鞍酌副旧碜鳛橐环N大分子蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)特性也會(huì)受到溫度的影響，因而穩(wěn)定性變差最終發(fā)生蛋白質(zhì)變性，從而失去活性。此外，較高的溫度也會(huì)在一定程度上加快魚(yú)油的氧化，使魚(yú)油顏色變深、品質(zhì)變差。結(jié)果表明，較為適宜的酶解溫度為55 ℃。

圖2　不同酶解溫度對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on extraction rate of fish oil

2.4酶解pH對(duì)魚(yú)油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、溫度55 ℃的條件下酶解3h，考察pH7.0、8.0、8.5、9.0、9.5以及10.0的條件下魚(yú)油提取率的變化情況。從圖3可以看出，隨著pH的增加，魚(yú)油提取率同樣呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這是由于不同的酸堿性對(duì)于底物分子和酶分子的帶電性都有影響，同時(shí)酶分子的穩(wěn)定性也會(huì)受到影響，因此在特定條件下，每種酶都有作用的最適pH。提取率最高時(shí)即為堿性蛋白酶在此條件下的最適pH，此時(shí)酶活性最高，酶解效果最好。結(jié)果表明，該反應(yīng)的最適pH為8.5。

圖3　不同pH對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.3　Effects of pH on extraction rate of fish oil

2.5液固比對(duì)魚(yú)油提取率的影響在酶添加量10 000U/g、溫度55 ℃、pH8.5的條件下酶解3h，分別考察液固比0.5∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.5∶1以及1.8∶1mL/g對(duì)魚(yú)油提取率的影響。從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著體系中水添加量的增多，酶解效果增強(qiáng)，魚(yú)油提取率升高。這是因?yàn)轶w系中的水分可以幫助蛋白酶與底物充分接觸，使得酶解速度加快，酶解程度增加，同時(shí)也有利于脂肪的溶出；而超過(guò)一定含量，水分的增加就會(huì)導(dǎo)致提取率的降低，這可能是因?yàn)榈孜餄舛冉档?、酶解反?yīng)不完全導(dǎo)致的。結(jié)果表明，液固比在1.0∶1mL/g的條件下，魚(yú)油提取率最高，為61.20%。

圖4　不同液固比對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of fish oil

2.6響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù)上述的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解pH以及加酶量進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。根據(jù)表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以魚(yú)油提取率為考察指標(biāo)，所得試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

響應(yīng)面試驗(yàn)所得回歸方程為：Y(%)=64.92-3.71X1+ 0.97X2+ 1.67X3-0.41X1X2-0.53X1X3+ 0.27X2X3-7.87X12-3.16X22-5.77X32。方差分析顯示，F(xiàn)模型=94.59，P模型< 0.000 1**；FX1=148.74,PX1< 0.000 1**；FX2=10.24，PX2=0.015 1*；FX3=30.24，PX3=0.000 9*；FX1X2=0.89，PX1X2=0.377 4；FX1X3=1.54,PX1X3=0.255 3；FX2X3=0.38,PX2X3=0.557 0;FX12=352.83，PX12< 0.000 1**；FX22=56.94，PX22=0.000 1*；FX32=189.63，PX32< 0.000 1**；F失擬=0.52，P失擬=0.691 0。由此可見(jiàn)，回歸方程極顯著，失擬不顯著，說(shuō)明所得方程擬合性較好，能夠較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)F值可以看出，所測(cè)3個(gè)因素對(duì)于魚(yú)油提取率的影響大小依次為：酶解溫度、酶解pH、酶添加量。其中因素之間的交互作用影響見(jiàn)圖5、6和7。從3D曲線以及等高線橢圓弧度來(lái)看，酶解溫度對(duì)于白鰱腹部魚(yú)油的提取率影響最大，曲線變化最為顯著，在溫度一定的條件下，圖7中的等高線呈橢圓形，說(shuō)明pH和加酶量之間的交互作用對(duì)魚(yú)油的提取率影響較大。

表2響應(yīng)面3因素3水平設(shè)計(jì)

Table2Threefactorsandthreelevelsofresponsesurfaceexperimentaldesign

水平Level因素Factor溫度(X1)Temperature∥℃加酶量(X2)Enzymedosage∥U/gpH(X3)15070008.025580008.536090009.0

表3　響應(yīng)面分析試驗(yàn)及結(jié)果

利用響應(yīng)面優(yōu)化得到試驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)提取條件為：酶解溫度53.77 ℃，加酶量8 176.45U/g，pH8.58，理論魚(yú)油提取率為65.59%，為方便實(shí)際操作，將上述條件修正為酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得平均魚(yú)油提取率為64.32%。

圖5　溫度和加酶量對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.5　Effects of temperature and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

圖6　溫度和pH對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.6　Effects of temperature and pH on extraction rate of fish oil

2.7粗魚(yú)油的理化性質(zhì)分析從表4可以看出，其中所有指標(biāo)均達(dá)到了國(guó)家1級(jí)粗魚(yú)油的標(biāo)準(zhǔn)，魚(yú)油品質(zhì)較好。其中魚(yú)油的過(guò)氧化值較高，可能與酶解時(shí)間較長(zhǎng)發(fā)生氧化作用有關(guān)，另外還含有一些蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，會(huì)影響魚(yú)油的進(jìn)一步加工利用，因此還需要進(jìn)行一系列精煉過(guò)程才能用于工業(yè)生產(chǎn)或食用。

圖7　pH和加酶量對(duì)魚(yú)油提取率的影響Fig.7　Effects of pH and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.8粗魚(yú)油的脂肪酸分析從表5可以看出，白鰱魚(yú)油中的19種脂肪酸以長(zhǎng)鏈脂肪酸為主，其中單不飽和脂肪酸的含量為43.01%，多不飽和脂肪酸的含量為28.82%，EPA和DHA的含量分別為6.54%和4.53%。n-3/n-6 高達(dá)2.89，高于文獻(xiàn)報(bào)道的1.7[7]和2.0[8]，其中原因可能與所選原料的來(lái)源、部位以及提取方法有關(guān)。研究表明，合理的n-3/n-6多不飽和脂肪酸比例對(duì)機(jī)體健康有重要意義[9]，n-3/n-6比例較高的油脂可以起到增強(qiáng)免疫反應(yīng)和非特異性抗性的作用，而n-3脂肪酸能夠?qū)⒌兔芏群蜆O低密度膽固醇轉(zhuǎn)化為高密度脂蛋白，從而使膽固醇從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到肝臟中，使膽固醇被肝臟代謝[10]。該試驗(yàn)提取得到白鰱腹部魚(yú)油具有較高的n-3/n-6值，是一種品質(zhì)較好且具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的功能性油脂。

表4　白鰱粗魚(yú)油的理化性質(zhì)

表5　白鰱粗魚(yú)油的脂肪酸組成

3　結(jié)論

以白鰱腹部下腳料為原料，采用酶解法制備魚(yú)油時(shí)，蛋白酶種類的選擇以及酶解時(shí)的工藝條件都會(huì)對(duì)魚(yú)油的提取率產(chǎn)生影響。通過(guò)試驗(yàn)確定，在酶解時(shí)間為3h的前提下，最優(yōu)的提取條件為：液固比1.0∶1mL/g，酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此條件下魚(yú)油的提取率為64.32%。各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合國(guó)家1級(jí)粗魚(yú)油標(biāo)準(zhǔn)，且EPA和DHA的含量分別為6.54%和4.53%，高于白鰱魚(yú)頭魚(yú)油[11]，n-3/n-6值為2.89，明顯高于白鰱內(nèi)臟魚(yú)油的2.0[12]，這與原料來(lái)源以及采取部位有關(guān)，但表明所得魚(yú)油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)格較高。此工藝過(guò)程較為簡(jiǎn)單，提取條件溫和，資源回收利用率較高，所得魚(yú)油品質(zhì)較好，可作為提高淡水魚(yú)加工附產(chǎn)值的有效方法。

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TechnologyResearchandQualityAnalysisofFishOilfromSilverCarpbyEnzymeHydrolysisMethod

LUOTing,XUXue-qin,XIAWen-shuietal

(CollegeofFood,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122)

[Objective]Toprovidemethodandreferencefortheextractionoffreshwaterfishoilandthecomprehensiveutilizationofprocessingby-productsoffreshwaterfish.[Method]Fishoilwasextractedfromthebellypartofsilvercarpbyenzymehydrolysismethod.Weresearchedtheeffectsofenzymetype,liquid-solidratio,hydrolysistemperature,pHandenzymedosageontheextractionrateoffishoil.Then,thephysicochemicalpropertyandfattyacidcompositionofobtainedcrudefishoilwereanalyzed.[Result]Alkalineproteasehadtheoptimalextractioneffectsonfishoilfrombellypart.Undertheconditionof1.0∶1liquid-solidratio,theresponsesurfaceoptimizationwascarriedout.Theoptimaltechnologywasasfollows： 54 ℃hydrolysistemperature,8 200U/genzymedosage,pH8.6and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateoffishoilwas64.32%.Thefishoilperoxidevaluewas5.48mmol/kg;iodinevaluewas1 204.2g/kg;saponificationvaluewas169.21mg/gandacidvaluewas3.56mg/g.Amongthem,contentsofEPAandDHAwere6.54%and4.53%,respectively.Then-3/n-6was2.89.[Conclusion]Thefishoilindexesreachthefirstgradestandardofcrudefishoil,whichhashighnutritionalvalueandbroadapplicationprospect.

Fishoil;Enzymolysis;Extraction;Fattyacidcomposition

國(guó)家大宗淡水魚(yú)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)項(xiàng)目(CARS-46)。

駱婷(1990- )，女，山東蓬萊人，碩士研究生，研究方向：食品加工。

2016-04-06

S986

A

0517-6611(2016)17-096-05