徐金麗， 尤祥偉， 王秀國， 徐光軍， 鄭 曉， 陳 丹， 李義強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗室，山東青島 266101)

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高效液相色譜-熒光法測定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙葉及土壤中的殘留及消解動態(tài)

徐金麗， 尤祥偉*， 王秀國， 徐光軍， 鄭 曉， 陳 丹， 李義強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗室，山東青島 266101)

[目的]建立柱前衍生高效液相色譜-熒光法測定煙葉和土壤中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量的方法。[方法]樣品經(jīng)乙腈提取，分散固相萃取凈化，以N-甲基咪唑和三氟乙酸酐進(jìn)行柱前衍生，衍生物用高效液相色譜-熒光法測定。[結(jié)果]當(dāng)添加濃度為0.000 5～1.000 0mg/kg時,甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的平均添加回收率均超過90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～5.5%。在鮮煙葉、干煙葉和土壤中，方法最低檢出濃度(LOQ)分別為0.004、0.008和0.000 5mg/kg。采用所建方法測定了2014～2015年山東、四川煙葉和土壤樣品中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的消解動態(tài)及最終殘留，結(jié)果表明，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙葉和土壤中消解半衰期為4.4～5.4和1.6～2.6d。按照2.25和3.375ga.i./hm2用量，分別施藥2～3次，采收間隔期 7d時，烤后煙葉樣品中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量低于0.2mg/kg。[結(jié)論]該方法操作簡便，有機(jī)溶劑用量少，符合農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)對靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度的要求。

高效液相色譜-熒光法；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽；煙葉；土壤；殘留；消解

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡稱甲維鹽)是以阿維菌素為原料，經(jīng)化學(xué)合成的一種高效殺蟲殺螨劑[1]，其作用機(jī)理為阻礙害蟲運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)傳遞而使其麻痹死亡，具有胃毒、觸殺和一定的滲透作用。甲維鹽對鱗翅目、鞘翅目、同翅目等害蟲具有顯著防效，在水果、蔬菜、煙草以及大田作物中得到了廣泛應(yīng)用[2]。

目前，甲維鹽的分析方法常采用高效液相色譜分離，紫外檢測器(UV)[3-5]或熒光檢測器(FLD)[6-7]進(jìn)行檢測。當(dāng)使用紫外檢測器(UV)進(jìn)行檢測時，由于雜質(zhì)干擾大、靈敏度低，需要進(jìn)行較為復(fù)雜的凈化和濃縮步驟，程序繁瑣，消耗大量有機(jī)溶劑[8-9]。而目前報道的衍生化方法中，應(yīng)用范圍也以蔬菜、水果和土壤為主[10-13]。筆者首次將分散固相萃取凈化與熒光檢測相結(jié)合，建立了煙草和土壤中甲維鹽的分析方法，具有快速、簡便、靈敏、可靠的特點(diǎn)，并采用所建方法研究3.4%甲維鹽懸浮劑在煙草上應(yīng)用時的消解動態(tài)與最終殘留水平，為推薦該農(nóng)藥制定合理使用規(guī)范提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料煙草試驗品種：NC89(山東青島)、CF27(四川西昌)。

1.2藥品、試劑及主要儀器甲維鹽(emamectinbenzoate)標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司)；乙腈(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、去離子水、氯化鈉(分析純)；衍生化試劑：N-甲基咪唑(NMIM)、三氟乙酸酐(TFAA)和N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(PSA)。3.4%甲維鹽懸浮劑(陜西上格之路生物科學(xué)有限公司)。

WatersAlliancee2695/2475高效液相色譜儀-熒光檢測器(HPLC-FD)(Waters公司)；WatersSunFireTMC18色譜柱(5.0μm，4.6mm×150.0mm，Waters公司)；超聲波振蕩機(jī)(RSQ-60AS，寧波榮順公司)； 千分之一電子天平(SHIMADZU-UW420H，日本Shimadzu公司)；萬分之一電子天平(ER-182A，日本Tykyo公司)；回旋式振蕩器(BLUDPARDWSZ-200A，上海藍(lán)豹)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(HEIDOLPH-ADVANTAGE，德國海道爾夫)。

1.3試驗方法

1.3.1煙葉動態(tài)試驗。設(shè)30m2煙田為一小區(qū)，每個處理3次重復(fù)。在煙草旺長中后期，按照甲維鹽3.375ga.i./hm2葉面噴霧，施藥時保證煙葉均勻著藥。于施藥后1h，1、3、5、7、14、21、28、35、42d采集煙葉樣品。將采集的煙葉樣品去除煙梗，切成1cm2左右，混勻后采用四分法留樣200g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3.2土壤動態(tài)試驗。選一塊15m2的空白地塊，按照甲維鹽3.375ga.i./hm2地面均勻噴霧，于施藥后1h，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42d隨機(jī)取點(diǎn)5～10個，用土鉆采集0～10cm土壤1～2kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣300g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3.3最終殘留量試驗。在煙草旺長后期，設(shè)30m2煙田為一小區(qū)。按照甲維鹽2.250、3.375ga.i./hm22個劑量葉面噴霧，分別施藥2、3次(交叉施藥次數(shù)和劑量，共4個處理)，施藥間隔期7d。分別于最后一次施藥后7、14、21d采集煙葉樣品，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集上、中、下部正常成熟的煙葉樣品不少于100片，煙葉經(jīng)三段式烘烤工藝(不超過68 ℃)烘烤、去主脈，粉碎混勻后，采用四分法留樣200g。同時采集土壤樣品，用土鉆采集0～15cm的土壤1～2kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣300g。分別裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。每個處理重復(fù)3次，另設(shè)清水空白對照，處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.4分析方法

1.4.1提取。鮮煙葉：稱取鮮煙葉10.0g，盛于250mL三角瓶中，加入80mL乙腈，振蕩提取1h，加入6gNaCl，振蕩15min，靜置，濾紙過濾，準(zhǔn)確量取40mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，待凈化。

干煙葉：稱取干煙葉2.0g，盛于250mL三角瓶中，加8mL蒸餾水，輕搖使樣品潤濕，靜置10min。加入60mL乙腈，振蕩提取1h，加入6gNaCl，振蕩15min，靜置，濾紙過濾，準(zhǔn)確量取30mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，待凈化。

土壤：稱取土壤20.0g，盛于250mL三角瓶中，加入適量蒸餾水，輕搖使樣品潤濕，靜置10min。加入60mL乙腈，回旋式振蕩器振蕩提取1h，加入6gNaCl，再振蕩15min，靜置，濾紙過濾，準(zhǔn)確量取30mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，經(jīng)0.22μm微膜過濾至樣品瓶中，再準(zhǔn)確吸取0.5mL于棕色樣品小瓶中，待衍生化。

1.4.2凈化。移取提取液上清液1.5mL于盛有150mg無水硫酸鎂和25mgPSA的 1.5mL離心管中，于漩渦混合振蕩儀上漩渦振蕩2min，再以6 000r/min離心2min，上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過濾至樣品瓶中，再準(zhǔn)確吸取0.5mL于棕色樣品小瓶中，待衍生化。

1.4.3柱前衍生化。為避免強(qiáng)光照射，向待衍生化的棕色樣品瓶中，分別加入0.25mLN-甲基咪唑(NMIM)和0.25mL三氟乙酸酐(TFAA)，立即蓋上瓶蓋，用手振蕩搖勻，避光衍生化20min后，進(jìn)行HPLC-FLD測定。

1.4.4檢測條件。WatersAlliancee2695/2475高效液相色譜儀-熒光檢測器(HPLC-FLD)；WatersSunFireTMC18色譜柱(5.0μm，4.6mm×150mm)；流動相:乙腈∶水溶液(95∶5，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：熒光激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長：475nm；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，甲維鹽的相對保留時間16min左右。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用外標(biāo)法定量。準(zhǔn)確稱取0.01g甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100mg/L的甲維鹽母液；以100mg/L標(biāo)準(zhǔn)品母液用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.020、0.100、0.200、1.000、2.000、10.000mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用“1.4.3”的方法進(jìn)行衍生化，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，所對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程Y=58 715 037X-1 769 997，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，其中，Y為甲維鹽測定峰面積，X為甲維鹽進(jìn)樣濃度。

2.2方法靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

2.2.1靈敏度。以最小添加濃度作為方法的最低檢測濃度(LOQ)，則甲維鹽在鮮煙葉、干煙葉和土壤中LOQ分別為0.004、0.008、0.000 5mg/kg。

2.2.2準(zhǔn)確度及精密度。用鮮煙葉、干煙葉和土壤的空白樣品分別進(jìn)行3個不同濃度的添加回收率試驗，每個水平重復(fù)5次。按樣品處理方法提取、凈化、衍生后用外標(biāo)法進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度在0.004～1.000mg/kg時，鮮煙葉中甲維鹽平均添加回收率為90.7%～93.5%，RSD為2.4%～5.0%；當(dāng)添加濃度在0.008～0.200mg/kg時，干煙葉中甲維鹽平均添加回收率為90.5%～92.2%，RSD為2.9%～5.5%；當(dāng)添加濃度在0.000 5～0.1000mg/kg時，土壤中甲維鹽平均添加回收率為90.4%～92.5%，RSD為2.3%～4.9%(表1)。這表明該方法的準(zhǔn)確度及精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表1甲維鹽農(nóng)藥殘留檢測方法的準(zhǔn)確度及精密度

Table1Accuracyandprecisionofthedetectionmethodofemamectinbenzoateresidues

樣品Sample添加濃度Addedconcent-ration∥mg/kg平均回收率Averagerecoveryrate∥%RSD%鮮煙葉0.00490.75.0Freshtobaccoleaf0.10093.52.41.00093.22.8干煙葉0.00890.55.5Curedtobaccoleaf0.02092.24.30.20092.22.9土壤Soil0.000590.44.90.010091.43.00.100092.52.3

2.3甲維鹽在煙葉及土壤中的消解動態(tài)于2014～2015年在山東青島、四川南昌進(jìn)行[14]。甲維鹽在山東、四川兩地?zé)熑~及土壤中的殘留消解結(jié)果表明，甲維鹽在煙葉和土壤中的消解曲線均符合一級動力學(xué)方程，其消解動力學(xué)參數(shù)見表2。由表2可知， 甲維鹽在煙葉和土壤中的半衰期均較短，分別為4.4～5.4 和1.6～2.6d，降解速率較快。

2.4甲維鹽在煙葉中的最終殘留量2014～2015年的最終殘留試驗結(jié)果表明，3.4%甲維鹽懸浮劑按照2.250、3.375ga.i./hm2分別施藥2、3次，施藥間隔期7d，于最后一次施藥后7、14、21d采集煙葉樣品，并按照三段式烘烤工藝烘烤。山東、四川2年煙葉和土壤最終樣品中甲維鹽殘留量均小于方法LOQ(煙葉0.008mg/kg，土壤0.000 5mg/kg)。

表2　甲維鹽在煙葉和土壤中的消解動態(tài)

3　結(jié)論

采用分散固相萃取凈化、柱前衍生、高效液相色譜-熒光法測定甲維鹽在煙葉及土壤中的殘留量，結(jié)果表明，該方法操作簡便，有機(jī)溶劑用量少，符合農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)對靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度的要求。

該試驗對甲維鹽在煙葉和土壤中的殘留消解動態(tài)及最終殘留量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，甲維鹽在煙葉和土壤中降解速率較快，半衰期分別為4.4～5.4和1.6～2.6d。按照2.250和3.375ga.i./hm2于煙草旺長中后期噴霧施藥2～3次，安全間隔期 7d時，烤后煙葉樣品中甲維鹽殘留量均低于0.008mg/kg。國際煙草合作研究中心(CORESTA)尚未規(guī)定甲維鹽在煙草上的指導(dǎo)性殘留限量。GB2763—2014規(guī)定阿維菌素在干辣椒中的最大殘留限量(MRL)為0.2mg/kg[15]。由于干辣椒和煙草的膳食結(jié)構(gòu)比例相似，以阿維菌素在干辣椒中的MRL(0.2mg/kg)為參考進(jìn)行風(fēng)險評估，甲維鹽在煙草上的使用劑量和方法用于煙草煙青蟲的防治，其殘留量是安全的。

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DissipationandResidueofEmamectinBenzoateinTobaccoandSoilUsingHighPerformanceLiquidChromatographyCoupledtoFluorescenceDetection

XUJin-li，YOUXiang-wei*，WANGXiu-guoetal

(TobaccoResearchInstituteofCAAS，KeyLaboratoryofTobaccoPestMonitoringControlling&IntegratedManagement，Qingdao，Shandong266101)

[Objective]Toestablishahighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetection(HPLC-FLD)methodforthedeterminationofemamectinbenzoateresidueintobaccoleavesandsoil. [Method]Thesamplewasextractedbyacetonitrileandthencleanedupbydispersivesolidphaseextraction.AfterprecolumnderivatizationwithN-methylimidazoleandthreetrifluoroaceticanhydride，thederivativesweredeterminedbyHPLC-FLD. [Result]Intherangeof0.000 5-1.000mg/kg，theaveragerecoveriesofemamectinbenzoatewerehigherthan90%，withtherelativestandarddeviation(RSD) 2.3%-5.5%.Thelimitsofquantification(LOQ)ofemamectinbenzoateinfreshtobaccoleaves，curedtobaccoleavesandsoilwere0.004，0.008and0.000 5mg/kg，respectively.ThedissipationandresiduelevelsofemamectinbenzoateinShandongandSichuanin2014-2015wereinvestigatedusingtheestablishedmethod.Thefieldtrialsresultsshowedthatthehalf-livesofemamectinbenzoateintobaccoleavesandsoilwere4.4-5.4dayand1.6-2.6day，respectively.Whenappliedatthedosageof2.25and3.375ga.i./hm2for2-3times，theterminalresiduesofemamectinbenzoateincuredtobaccoleaveswithapre-harvestintervalof7dayswerelowerthan0.2mg/kg. [Conclusion]Thismethodhasthecharacteristicsofsimpleoperation，smalldosageoforganicsolvent，whichmeetstherequirementsofsensitivity，accuracyandprecisionofpesticideresiduesdetectiontechnology.

HPLC-FLD;Emamectinbenzoate;Tobaccoleaf;Soil;Residue;Degradation

徐金麗(1963- )，女，山東濰坊人，實(shí)驗師，從事農(nóng)藥殘留方面的研究。*通訊作者，助理研究員，博士，從事農(nóng)藥殘留方面的研究。

2016-05-11

S482.3

A

0517-6611(2016)17-070-03