李　雪, 來文慶, 姜喜鳳, 王　潮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

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異肽鍵交聯(lián)的N肽類HIV-1融合抑制劑的設計、 合成及活性評價

李雪, 來文慶, 姜喜鳳, 王潮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

摘要報道了一種通過在HIV-1 gp41 NHR區(qū)域的多肽(N肽)之間引入異肽鍵穩(wěn)定N3螺旋的新方法; 以天然N肽序列N38為模板, 采用此方法設計合成了一系列異肽鍵交聯(lián)的N38三股α螺旋結構. 該結構具有極強的熱穩(wěn)定性和納摩爾水平抑制HIV-1包膜糖蛋白(Env)介導的細胞融合活性.

關鍵詞人免疫缺陷病毒Ⅰ型; 融合抑制劑; N端重復序列; 卷曲螺旋

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)引起的一種高致死性傳染病[1]. 在病毒膜和宿主細胞膜的融合過程中,HIV-1表面的包膜糖蛋白首先與宿主細胞上的受體(CD4)和趨化因子受體(CCR5或CXCR4)作用[2,3]; 隨后病毒包膜糖蛋白暴露出gp41亞基, 再錨定到細胞膜上. 其N端重復序列(NHRs)形成同源三聚體螺旋結構(N3螺旋), 進而C端重復序列(CHRs)以反向平行的方式折疊到N3螺旋內核所形成的疏水溝槽上, 形成融合過程中關鍵的六股α螺旋束(6-HB)結構(圖1)[4]. 6-HB的形成拉近了病毒膜和宿主細胞膜之間的距離, 從而導致融合.HIV-1融合抑制劑能夠阻斷病毒6-HB的形成, 抑制膜融合過程[5].

Fig.1　Interaction between the NHR and CHR peptides

恩夫韋肽(T20)是一個衍生于HIV-1CHR區(qū)域的多肽[6,7]. 2003年, 經美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準,T20成為第一個上市的C肽類融合抑制劑, 用于治療高效抗逆轉錄病毒療法失敗的患者[8,9]. 除T20外, 目前還有多個C肽類融合抑制劑處于不同的開發(fā)階段[10～12]. 與此相反, 衍生于gp41NHR區(qū)域的多肽(N肽)的生物活性通常僅在微摩爾水平, 比對應的C肽低1000倍左右. 究其原因主要是生理條件下天然NHR肽容易聚集、 沉淀, 因而不能形成穩(wěn)定的三聚體螺旋結構而失活[13]. 為了構建能夠穩(wěn)定存在的N3螺旋結構,Eckert等[14]在天然N肽上拼接水溶性好且容易形成三聚體的額外肽片段, 該嵌合N肽可以形成穩(wěn)定的N3螺旋結構, 從而顯著提高了N肽的融合抑制活性. 在此基礎上,Bianchi等[15]利用二硫鍵將上述嵌合N肽交聯(lián)成不可逆三聚體, 進一步提高了嵌合肽的生物活性, 達到納摩爾水平. 然而, 嵌合肽中的輔助結構部分易造成與功能無關序列的冗長, 不利于有效N肽片段與靶標CHR的結合; 另外, 二硫鍵在體內容易被氧化還原酶降解, 從而導致藥物的體內穩(wěn)定性差[16].

異肽鍵(Isopeptidebonds)是由組成蛋白的氨基酸之間至少有一個非α位的氨基或羧基參與形成的酰胺鍵, 廣泛存在于革蘭氏陽性菌的菌毛蛋白結構中[17]. 異肽鍵賦予了細菌菌毛蛋白極強的力學穩(wěn)定性、 熱穩(wěn)定性、 化學穩(wěn)定性和酶解穩(wěn)定性[18]. 本課題組前期工作[19,20]表明, 異肽鍵交聯(lián)的N3螺旋具有較強的穩(wěn)定性和低納摩爾的生物學活性.

Fig.2　Helical wheel representations of the 6-HB(A) and the isopeptide bond-tethered NHR-trimer(B)Table 1　Sequences of designed N38 derivatives

PeptideSequencegabcdefgabcdefgabcdefgabcdefgabcdefgabN38LLSGIVQQQNNLL-RAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(N38M)3(LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL)3(N38MEK)3(LIEEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL)3(N38MEKK)3(KIEEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL)3

1實驗部分

1.1試劑與儀器

Rink酰胺樹脂為天津南開合成有限公司產品; 2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)、 1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、 N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及芴甲氧羰基(Fmoc)保護的天然氨基酸為上海吉爾生化公司或成都誠諾新技術公司產品; 芐硫醇、 三氟乙酸(TFA)、 1,2-乙二硫醇(EDT)、 苯甲醚(Anisole)和間甲酚(m-Cresol)購自百靈威公司; 二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)購自國藥集團; 色譜純乙腈為Fisher公司產品. 保護氨基酸包括N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-谷氨酰胺[Fmoc-L-Gln(Trt)-OH]、 N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸[Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH]、 N-芴甲氧羰基-O-烯丙基-L-谷氨酸[Fmoc-L-Glu(OAll)-OH]、 N-芴甲氧羰基-L-異亮氨酸(Fmoc-L-Ile-OH)、 N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-L-Leu-OH)、 N-芴甲氧羰基-N′-叔丁氧羰基-L-賴氨酸[Fmoc-L-Lys(Boc)-OH]、 N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-絲氨酸[Fmoc-L-Ser(tBu)-OH]、 N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-組氨酸[Fmoc-L-His(Trt)-OH]、 N-芴甲氧羰基-L-甘氨酸(Fmoc-L-Gly-OH)、 N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(Fmoc-L-Ala-OH)、 N-芴甲氧羰基-L-纈氨酸(Fmoc-L-Val-OH)、 N-芴甲氧羰基-L-色氨酸(Fmoc-L-Trp-OH)、 N-芴甲氧羰基-L-甘氨酸(Fmoc-L-Gly-OH)、 N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-蘇氨酸[Fmoc-L-Thr(tBu)-OH]和N-芴甲氧羰基-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸[Fmoc-L-Arg(pbf)-OH].

CEMLiberty型微波多肽合成儀(美國CEM公司);LC-20AP型高壓制備液相色譜儀和10A型高效液相色譜儀(日本島津株式會社);C8制備液相色譜柱(250mm×21.20mm, 5μm)和XBridgeC8液相色譜柱(250mm×4.6mm, 5μm)(美國Waters公司);Milli-Q純水機(美國MilliPore公司);Free-Zone18L型冷凍干燥機(美國Labconco公司);REFLEXⅢ型基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS, 德國Bruker公司); 圓二色譜儀(法國Claix公司);Nano2000型微量光度計(美國ThermoFisherScientific公司).

1.2實驗過程

1.2.1中間體的合成及純化中間體的合成采用標準的氨基芴甲氧羰基(Fmoc)保護固相合成方法, 選用RinkAmide樹脂, 以HBTU/HOBt/DIEA為縮合劑. 脫保護試劑組成為V(哌啶)∶V(DMF)=1∶4. 用微波多肽合成儀合成多肽序列, 第13位殘基所需試劑為Fmoc-L-Glu(OAll)-OH,N端用乙酸酐試劑乙?；舛? 然后, 用四(三苯基膦)鈀和5,5-二甲基環(huán)己二酮選擇性脫除序列第13位Glu(OAll)側鏈的OAll保護基(O-烯丙基), 用EDC/HOBt對13位的Glu側鏈羧基進行芐硫酯化. 裂解[1g肽樹脂對應使用10mL裂解液, 裂解液的組成為V(TFA)∶V(H2O)∶V(EDT)∶V(m-Cresol)∶V(Anisole)=16.5∶0.5∶1∶1∶1], 粗肽用水溶解后凍干保存. 用高壓液相色譜(HPLC)對粗肽分離純化, 得到純肽(純肽含量>95%), 用MALDI-TOF-MS驗證分子量[23].

1.2.2異肽鍵交聯(lián)的N3螺旋的合成及純化將多肽中間體溶解于PBS緩沖液(0.1mol/L,pH=7.4)和乙腈的混合溶液中[V(PBS)∶V(乙腈)=4∶1], 在37 ℃下孵育. 中間體自組裝形成三螺旋結構, 其中1條NHR第8位的Lys與相鄰的另1條NHR上第13位的芐硫酯化的Glu靠近,Lys側鏈的氨基進攻Glu的芐硫酯, 形成異肽鍵[圖2(B)]. 然后用HPLC純化,MALDI-TOF-MS驗證分子量.

1.2.3圓二色譜(CD)測定多肽二級結構和熱變性溫度(Tm)參照文獻[24]方法, 用超微量光度計標定N肽溶液的濃度. 以PBS緩沖液(pH=7.4)稀釋, 配制200μL10μmol/L的肽溶液. 用CD光譜測定其螺旋吸收值并按照公式[θ]=δ/(cLN)換算成橢圓率[θ][式中: δ為波長222nm處的信號值; c(mol/L)為肽溶液的濃度; L(mm)為樣品池的長度; N為測量肽的酰胺鍵數; θ=-33000, 為100%螺旋含量].

1.2.4HIV-1Env介導的細胞-細胞融合實驗參照文獻[25]方法, 配制不同濃度的樣品, 與含有熒光素酶報告基因的TZM-b1細胞及HL2/3細胞共同孵育6h, 用酶標儀檢測熒光發(fā)光.

2結果與討論

2.1異肽鍵交聯(lián)的N3螺旋的α螺旋含量和熱穩(wěn)定性

(N38M)3含有43%的α螺旋; 當引入E-K鹽橋后, (N38MEK)3和(N38MEKK)3分別表現出99%和100%的α螺旋含量(表2), 驗證了在螺旋內引入i, i+3或i, i+4的靜電作用能穩(wěn)定螺旋結構的結論. 異肽鍵的引入限制了三股α螺旋構象, 顯著提高N3螺旋的熱穩(wěn)定性, 使Tm值均大于90 ℃.

Table 2　Biophysical data and inhibitory activities of N38 derivatives

2.2異肽鍵交聯(lián)的N3螺旋的納摩爾水平抗融合活性

相比于N38微摩爾的抗HIV-1包膜糖蛋白介導的細胞融合活性, 異肽鍵交聯(lián)的N3螺旋表現納摩爾水平的融合抑制活性.E-K鹽橋的引入提高了α螺旋含量, 導致活性進一步提升. 當Leu(1)突變成Lys,Ile(19)還原為Gln, 活性顯著提高, 推測是由于這2個位點的突變加強了N3螺旋與靶CHR特異結合作用, 從而使其表現出較高的抗融合活性.

3結論

采用異肽鍵交聯(lián)的方法穩(wěn)定N肽的三螺旋構象, 使其表現出較高的熱穩(wěn)定性和抗HIV-1包膜糖蛋白(Env)介導的細胞融合活性. 本文結果表明, 這種策略有可能用于開發(fā)藥物或者合成疫苗來對抗HIV-1病毒或者其它具有卷曲螺旋融合蛋白的病毒, 如中東呼吸綜合征冠狀病毒和埃博拉病毒等.

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(Ed.:P,H,N,K)

?SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.81373266, 81573266).

doi:10.7503/cjcu20160125

收稿日期:2016-03-02. 網絡出版日期: 2016-04-15.

基金項目：國家自然科學基金(批準號: 81373266, 81573266)資助.

中圖分類號O629.72

文獻標志碼A

Design,SynthesisandActivityScreeningofIsopeptideBond-tetheredNPeptidesasHIV-1FusionInhibitors?

LIXue,LAIWenqing,JIANGXifeng,WANGChao*,LIUKeliang*

(Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures, Beijing 100850, China)

AbstractPeptides derived from the N-terminal heptad repeat(N-peptides) of HIV-1 gp41 can exhibit highly potent anti-HIV-1 activity when presented in a trimeric coiled-coil conformation. In this paper, the NHR trimeric coiled coils were designed based on a naturally occurring N-peptide, e.g. N38, on which engineered acyl transfer active sites were incorporated at the e/g-positions of heptad repeats to generate isopeptide bond cross-links. These isopeptide bond-tethered N-peptides exhibited exceptional thermal stability and possessed promising inhibitory activity on HIV-1 env-mediated cell-cell fusion.

KeywordsHIV-1; Fusion inhibitor; N-terminal heptad repeat; Coiled coil

聯(lián)系人簡介: 劉克良, 男, 博士, 研究員, 博士生導師, 主要從事多肽藥物、 核酸化學及藥用高分子材料的研究.

E-mail:keliangliu55@126.com

王潮, 男, 博士, 助理研究員, 主要從事多肽藥物的研究.E-mail:chaow301@gmail.com