王　男, 程小桁, 鄭積敏, 陳光巨, 賈宗超

(1. 北京師范大學化學學院, 2. 生命科學學院, 北京 100875;3. 加拿大皇后大學生物醫(yī)學與分子科學學院, 金士頓 K7L3N6)

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DEPTOR蛋白的表達純化條件及與mTOR-TRD2亞結構域的相互作用

王男1, 程小桁2, 鄭積敏1, 陳光巨1, 賈宗超3

(1. 北京師范大學化學學院, 2. 生命科學學院, 北京 100875;3. 加拿大皇后大學生物醫(yī)學與分子科學學院, 金士頓K7L3N6)

摘要測試并優(yōu)化了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的FAT結構域及其亞結構域TRD2和DEPTOR蛋白在大腸桿菌中的表達條件, 獲得了TRD2和DEPTOR蛋白成功表達并大量純化的條件. 結果表明, 麥芽糖結合蛋白(MBP)融合mTOR的TRD2亞結構域可以在菌株BL21(DE3)中大量表達. DEPTOR-G270P突變比野生型DEPTOR在BL21(DE3)中的表達量提高約5倍, 且該突變并不影響DEPTOR自身的二級結構. 通過凝膠過濾實驗發(fā)現(xiàn), mTOR的TRD2亞結構域和DEPTOR之間可能存在相互作用.

關鍵詞mTOR蛋白; TRD2亞結構域; DEPTOR蛋白; G270P突變; 大腸桿菌表達

癌癥是人類健康的第一大殺手, 醫(yī)學工作者長期致力于癌癥的誘因及其治療方法的研究. 據(jù)預測, 2015年在發(fā)展中國家中將有900萬例因癌癥致死的病例, 其中我國占有相當?shù)臄?shù)量[1～4]. 然而, 在過去50年中, 從分子層面上對腫瘤和癌癥的各項研究數(shù)據(jù)尚十分缺乏. 有關分子機制層面的研究數(shù)據(jù)集中在蛋白質-蛋白質相互作用并形成信號通路方面, 包括mTOR蛋白通路、PI3K/Akt蛋白通路、 細胞外信號調控激酶通路和細胞核因子kB通路等. 其中,mTOR蛋白通路的研究成果表明其與腫瘤的成因密切相關, 而逐漸成為抗癌研究的熱門蛋白.

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(MammaliantargetofRapamycin,mTOR)是一種存在于細胞質中的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶, 對細胞代謝的調控、 細胞的生長及其它與激酶相關的生化過程具有重要調節(jié)作用[5,6].mTOR蛋白的正調控與負調控過程及其相關信號通路的激活與抑制與多種疾病有密切關系[7,8]. 因此, 對mTOR蛋白及其相關信號通路的研究將有助于了解癌癥等相關疾病的分子機制. 目前研究發(fā)現(xiàn),mTOR蛋白的抑制有利于腫瘤的治療[9]. 對于天然的內源mTOR抑制劑, 其代表蛋白DEPTOR是由Sabatini等[5]發(fā)現(xiàn)的在多發(fā)骨髓瘤細胞中存在, 并對腫瘤細胞存活起重要作用的一類內源mTOR抑制蛋白.

本文采用大腸桿菌表達系統(tǒng)探索了mTOR蛋白的FAT結構域及其各個片段的表達條件, 還探索了抑制劑DEPTOR蛋白的表達條件和純化條件; 嘗試借助基于DNA序列功能性突變的方法尋找二者能夠大量表達純化的最佳條件; 并以圓二色譜對表達產(chǎn)物進行了二級結構的測試表征, 初步探索了表達產(chǎn)物相互作用的能力, 為后續(xù)進一步對mTOR及相關抑制劑的研究提供了幫助.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

BL21(DE3)表達型菌株、TOP10克隆型菌株、ArcticExpress表達型菌株、pGEX系列質粒及pET28a質粒由加拿大皇后大學賈宗超教授課題組惠贈; 包含mTOR基因全長的質粒由加拿大皇后大學劉峰博士惠贈; 大腸桿菌TOP10和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購于天根(TIANGEN)公司; 氨芐青霉素鈉(Amp)、 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、 二硫蘇糖醇(DTT)、 十二烷基硫酸鈉(SDS)、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、 甘氨酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)和瓊脂糖粉劑購于美國Amersco公司; 四甲基乙二胺(TEMED, 分析純)購于香港FARCOChemical公司; 各類限制性內切酶(BamHⅠ, XhoⅠ, NcoⅠ, EcoRⅠ和NotⅠ)購于美國Fermentas公司;Ligation-High連接酶溶液購于日本Toyobo公司; 丙烯酰胺(濃度0.3g/mL)/甲叉雙聚丙烯酰胺溶液(兩組分質量比為29∶1)購于美國Bio-Rad公司;Ni-NTA蛋白質純化填料和谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)蛋白質純化填料購于QIAGEN公司, 均由乙醇溶液(體積分數(shù)20%)封裝保存.

SDS-PAGE及Western-Blot電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);AKTApurifier蛋白層析系統(tǒng)(配備Highloadsuperdex200蛋白層析柱, 美國GE公司);Chirascan圓二色譜儀(英國AppliedPhotophysics公司).

1.2實驗過程

1.2.1mTOR蛋白的克隆構建和表達篩選根據(jù)設計好的目標DNA序列, 設計合適的聚合酶鏈式擴增反應(PCR)引物(見表1, 不含酶切位點和保護堿基), 在PCR反應管中加入mTORDNA模板1μL、 正、 反向引物各1.5μL(先用200μL超純水溶解引物)、Pfu酶預混液25μL和超純水21μL構建PCR反應體系. 將PCR管放入PCR儀中, 于94 ℃預變性5min;PCR循環(huán)為94 ℃保持1min, 55 ℃保持1min, 72 ℃保持xmin(x為目標DNA序列堿基對數(shù)/1000, 如, 對于4000bp的DNA, x=4), 共循環(huán)25次; 之后于72 ℃保溫1min, 于4 ℃保存?zhèn)溆? 擴增過程中引入BamHⅠ和EcoRⅠ/NotⅠ限制性內切酶位點, 以方便進行限制性內切酶的消化與連接等步驟.

Table 1　FAT domain and TRD2 subdomain PCR primer sequence

PCR反應結束后, 用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應是否成功, 并用TIANGEN試劑盒回收PCR產(chǎn)物DNA(終體積50μL)備用. 在酶消化步驟中, 向PCR管中加入10μL回收后的PCR產(chǎn)物或6μL欲連接的質粒, 根據(jù)引物中設計的內切酶位點加入相應的內切酶各1μL, 加入超純水至體積為20μL, 放入37 ℃水浴中1h, 取出用TIANGEN試劑盒回收消化后的DNA與質粒(終體積50μL)備用.DNA連接過程中, 取消化后的DNA產(chǎn)物10μL, 消化后的質粒2μL和Ligation-High連接酶溶液6μL, 于16 ℃空氣浴中放置30min, 取出直接向TOP10感受態(tài)細胞中進行轉化(轉化方式見感受態(tài)細胞說明), 并涂布在相應抗生素的平板上, 次日挑取單克隆菌并進行DNA測序.

使用質粒小提試劑盒從測序結果正確的菌液中提取相應的質粒, 將其轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中. 從相應抗性篩選平板上挑取過夜培養(yǎng)的白色單一菌落, 接種到3mL含相應抗生素的LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉速培養(yǎng)過夜. 取過夜培養(yǎng)的菌液1mL, 接種到100mL含有相應抗生素的無菌LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉速培養(yǎng)12h. 取20mL過夜培養(yǎng)的菌液, 接種到含有Amp(終濃度100μg/mL)的無菌LB培養(yǎng)液中, 于37 ℃以150r/min轉速培養(yǎng). 監(jiān)測菌液OD600值至0.8時, 加入IPTG(終濃度0.1mmol/L)進行誘導. 于25 ℃以110r/min轉速再培養(yǎng)12h后, 用離心機以8000r/min轉速收菌. 將菌泥保存于-40 ℃?zhèn)溆?

純化蛋白時, 向保存的菌泥中加入10mL/g破菌緩沖液, 攪勻后置于冰上, 加入200μL苯甲基磺酰氟溶液(PMSF, 100mmol/L)攪勻. 將冰盒放入超聲破碎儀, 超聲探頭置于液面以下1cm, 以40%儀器總功率, 頻率為10s/50s進行破菌, 破菌時間為3min, 總時間為18min, 菌液由黏稠變澄清. 使用高速冷凍離心機以18000r/min轉速對破碎的菌液離心15min2次, 每次均收集上層清液并棄去沉淀部分, 置于冰盒中保持低溫并轉移至4 ℃環(huán)境中. 取體積為1mL的Ni-NTA蛋白純化填料加入小層析柱中, 待填料中的乙醇流盡后, 用10mL超純水沖洗, 再用咪唑溶液(20mmol/L)沖洗5個柱體積進行柱平衡. 將上層清液逐漸加入層析柱, 收集30μL流穿液作為SDS-PAGE電泳檢測樣品. 用100mL緩沖液進行沖洗, 洗掉結合力弱的雜蛋白. 收集30μL沖洗液作為SDS-PAGE電泳檢測樣品. 用15mL咪唑溶液緩沖液(200mmol/L)進行洗脫并全部收集, 取30μL洗脫液和30μL洗脫后的Ni-NTA填料作為SDS-PAGE電泳檢測樣品. 采用Bradford法檢測洗脫液蛋白濃度, 并以SDS-PAGE電泳對以上樣品進行檢測.

1.2.2DEPTOR蛋白的克隆構建、 表達純化和產(chǎn)物的二級結構鑒定大腸桿菌中DEPTOR蛋白的克隆構建及表達純化過程與mTOR蛋白質的克隆構建表達純化過程基本一致, 所使用的引物序列見表2(不含酶切位點和保護堿基).

Table 2　DEPTOR PCR Primer and G270P Mutation Primer Sequence

凝膠過濾實驗開始前, 用截留分子量為30000的超濾管對蛋白洗脫液進行濃縮, 并緩慢加入凝膠過濾緩沖液, 繼續(xù)濃縮蛋白溶液至終體積為1mL. 在AKTApurifier上用凝膠過濾緩沖液對HighLoadSuperdex200層析柱進行平衡, 平衡體積120mL, 報警壓0.5MPa, 流速1mL/min. 平衡完成后, 將1mL濃縮蛋白溶液用注射器打入上樣環(huán), 運行AKTA系統(tǒng), 報警壓強為0.5MPa, 流速為1mL/min, 體積為120mL. 外水(40mL)后, 以2mL每管對流出液進行收集. 收集出峰位置的流出液并進行SDS-PAGE檢測以確定表達產(chǎn)物的分子量.在產(chǎn)物的鑒定步驟中, 取200μL純化后的DEPTOR蛋白溶液, 用圓二色譜儀掃描180～260nm處的圓二色譜信號, 并使用儀器附帶的分析軟件計算待測產(chǎn)物的二級結構含量的測定值, 同時將DEPTOR蛋白一級序列上傳至在線Jpred服務器(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/), 使用多種二級結構預測算法來預測DEPTOR各個二級結構的理論含量. 將理論值與實驗測定值作對比, 即可得到表達產(chǎn)物的二級結構含量, 從而推知其折疊是否完好.

2結果與討論

2.1mTOR蛋白的TRD2亞結構域與MBP的融合蛋白在大腸桿菌中的表達

Fig.1　Sub-domains of mTOR FAT domain The 0—600 number suggests amino acids numbers in primary structure.

實驗中對獲得的人源mTOR基因進行PCR擴增后, 利用瓊脂糖電泳凝膠分離, 用以鑒定PCR實驗是否成功并回收PCR產(chǎn)物. 由圖S1結果(見本文支持信息)可知, 在退火溫度為55 ℃時, 產(chǎn)物均有明亮的條帶, 并且與標準Marker對照判讀出其堿基數(shù)約為2000, 符合FAT基因1860堿基對數(shù)的理論值, 這說明對目標基因的PCR擴增是成功的. 抽取少量菌液為模板做PCR驗證,PCR體系構建與實驗步驟相同, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證結果. 由圖S2結果(見本文支持信息)可知, 標有GST的樣品均在目標堿基對數(shù)的位置處出現(xiàn)了明顯條帶, 表明連接產(chǎn)物中已引入FAT的目標DNA, 即FAT結構域基因已經(jīng)與pGEX-6P-1組成重組質粒. 用相同方法將FAT基因引入pET28b質粒中構建成所需的克隆, 同時根據(jù)文獻[10]方法將FAT結構域按照TRD2,TRD3,HRD及其組合分割為各個功能性截斷, 總計分為TRD2,TRD3,HRD,TRD2-3,TRD3-HRD和TRD2-HRD5段(圖1), 構建出這些片段與pET28b質粒連接的克隆.

將重組質粒抽提并轉化入BL21(DE3)等多種感受態(tài)細胞中, 設置對照組嘗試進行FAT結構域的小量表達, 并以使用GST標簽抗體的Western-Blot技術對表達結果進行鑒定.結果[圖2(A)]顯示,FAT-GST在JM109菌株中能夠以較大量的包涵體的表達形式出現(xiàn), 且主要條帶位于正確分子量的位置(92000). 這可能是FAT-GST分子量過大(已超過90000), 超過了一般大腸桿菌表達系統(tǒng)對蛋白的正確折疊修飾所致. 因此, 對FAT結構域進行適當截斷, 使表達產(chǎn)物能夠溶解, 并進一步增加蛋白的表達量是一項重要工作. 上述5個FAT結構域的片段經(jīng)過與pET28b連接構成重組質粒后, 同樣嘗試進行了表達, 但均未成功.

根據(jù)文獻[11～14]對mTOR蛋白的報道以及對同源蛋白ATM類激酶和ATR類激酶的類比研究[15～17], 推斷表達不成功可能是由于mTOR蛋白作為PKC(蛋白激酶C)類蛋白, 其FAT結構域自身與其它部分以疏水表面結合[18,19], 直接表達FAT結構域可能使疏水表面暴露而導致表達產(chǎn)物受到降解. 因此, 考慮使用麥芽糖結合蛋白(MBP)與FAT的這些截斷相互融合, 構建融合蛋白以增加其溶解性. 將融合蛋白引入大腸桿菌中進行表達篩選后, 在BL21(DE3)中,MBP-TRD2能夠產(chǎn)生大量的可溶性表達[圖2(B)], 并且能夠用Ni-NTA純化填料進行純化.

Fig.2　FAT domain and subdomain expression assay in E.coli (A) FAT-GST fusion protein in JM109 expression assay by Western-Blot, lane 1: negative control (incubate without adding IPTG), lane 2: whole-cell-extract after induced by 1 mmol/L IPTG, lanes 3, 4: supernatant/pellet of whole-cell-extract lysate. (B) MBP fusion TRD2 protein in BL21(DE3) expression assay by SDS-PAGE(Ft: flow-through; W: wash; E: eluted protein).

2.2DEPTOR蛋白G270P突變體表達純化結果優(yōu)于野生型

實驗中對購得的人源DEPTOR基因進行PCR擴增后, 利用瓊脂糖電泳凝膠分離, 用以鑒定PCR實驗是否成功并回收PCR產(chǎn)物. 結果表明, 退火溫度在55～64 ℃任何梯度下, 產(chǎn)物均有明亮的條帶, 并且與標準Marker對照判讀出其堿基數(shù)約為1200, 符合DEPTOR基因1230堿基對數(shù)的理論值, 說明對目標基因的PCR擴增是成功的.抽取少量菌液為模板做PCR驗證,PCR體系構建與實驗步驟相同, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證結果. 由圖S3結果(見本文支持信息)可知, 2個樣品均在目標堿基對數(shù)的位置處出現(xiàn)了明顯條帶, 表明連接產(chǎn)物中已引入DEPTOR的目標DNA.即DEPTOR全長已經(jīng)與pGEX-6P-1組成重組質粒.

利用TIANGENDNA少量提取試劑盒抽取重組質粒, 并轉化入BL21(DE3)表達菌株中, 設置37 ℃(體溫)和25 ℃(室溫)2個表達溫度進行蛋白質的少量表達. 由SDS-PAGE圖S4結果(見本文支持信息)可知, 在37和25 ℃ 2種表達條件下,DEPTOR-GST融合蛋白均有明顯的表達, 并且能夠以可溶的形式出現(xiàn)在裂解液中(裂解液含有50mmol/LTris和300mmol/LNaCl,pH=8.0), 且分子量處于正確的位置(GST分子量為26000,DEPTOR理論分子量為44000, 相加約為70000,SDS-PAGE中條帶位置在72000處). 但是, 在這2個條件下對DEPTOR-GST融合蛋白大量表達并使用GST親和純化填料對其進行純化后, 在上層清液中檢測到極少量的目標蛋白, 而在流穿液中檢測到較大量的目標蛋白, 表明DEPTOR-GST融合蛋白與純化填料的結合能力較差, 這可能是DEPTOR的某些蛋白序列或結構干擾了GST的正常折疊所致.

鑒于DEPTOR-GST融合蛋白的大量表達存在溶解困難的問題, 嘗試使用His融合標簽(多聚組氨酸)來表達DEPTOR蛋白. 通過使用連接酶將目標基因與pET28b質粒進行連接, 將連接產(chǎn)物轉化入TOP10感受態(tài)細胞中并挑取克隆進行PCR驗證. 由圖S5結果(見本文支持信息)可知, 全部樣品中均引入了DEPTOR外源基因, 表明DEPTOR與pET28b成功結合成重組質粒.設置對照組嘗試進行DEPTOR蛋白的小量表達, 并以使用His標簽抗體的Western-Blot技術對表達結果進行鑒定.結果[圖3(A)]顯示,DEPTOR在BL21(DE3)中能夠實現(xiàn)大量的可溶性表達, 且主要條帶位于正確分子量的位置; 而由重組質粒轉化入ArcticExpress感受態(tài)細胞中進行表達嘗試的結果[圖3(B)]可知,DEPTOR在ArcticExpress菌種中能夠獲得比BL21(DE3)較少降解的可溶性表達, 且主要條帶位于正確分子量的位置, 但是蛋白質的表達量較低. 這可能是由于ArcticExpress在16 ℃時工作所致.使用BL21(DE3)菌株進行DEPTOR蛋白的大量表達, 并用Ni-NTA填料進行蛋白純化, 同時以SDS-PAGE對表達結果進行鑒定. 結果[圖3(C)]顯示, 使用BL21(DE3)表達菌在表達DEPTOR時出現(xiàn)了較大量的雜帶, 這可能是由于DEPTOR不適應BL21(DE3)表達菌的環(huán)境而發(fā)生了降解所致.

Fig.3　DEPTOR expression assay in E.coli All the lanes are samples from each purification step, respectively. (A) DEPTOR-His wild-type expression assay by Western-Blot in BL21(DE3); (B) DEPTOR-His wild-type expression assay by Western-Blot in arctic express; (C) DEPTOR-His wild-type expression assay by SDS-PAGE in BL21(DE3); (D) DEPTOR-His G270P expression assay by SDS-PAGE; (E) DEPTOR-His G270P expression assay by SDS-PAGE with glycerol(10%, volume fraction) in purification buffer. P: pellet; S: supernatant; Cell: whole-cell-extract; Control: cell without induced by IPTG; Ft: flow-through; W1, W2: wash; E, E1 and E2: eluted protein; R: resin after elution.

通過比較, 選擇使用表達量相對較高的BL21(DE3)來實現(xiàn)DEPTOR蛋白的大量表達.SDS-PAGE結果顯示的DEPTOR主要條帶(分子量45000處)下方的伴生雜帶主要位于分子量34000處, 并且一部分DEPTOR蛋白不能從純化填料上被洗脫下來, 表現(xiàn)出明顯的變性特征. 經(jīng)過生物質譜鑒定, 這些分子量為34000的伴生雜帶也屬于DEPTOR蛋白, 表明這是DEPTOR蛋白的降解產(chǎn)物.部分蛋白質在表達過程中的折疊存在問題, 使得蛋白質發(fā)生部分降解, 并且出現(xiàn)許多與純化填料的非正常相互作用. 而由Western檢測結果可知, 分子量34000處的伴生雜帶并不含有His標簽, 而分子量20000處的少量雜帶則表現(xiàn)出明顯的His標簽反應(見本文支持信息圖S6), 表明其含有His標簽.SDS-PAGE與Western檢測結果結表明,DEPTOR可能在接近C端的位置發(fā)生了降解. 文獻[20]報道DEPTOR的Loop-rich區(qū)中含有能夠被降解的GSSG模體, 這可能是導致DEPTOR表達量不夠高且容易產(chǎn)生降解的原因.

為了降低DEPTOR蛋白在大腸桿菌中的降解, 增加表達量, 引入G270P突變以減少GSSG模體的降解效應, 同時通過脯氨酸自身對肽鏈二面角的限制, 穩(wěn)定Loop-rich結構域. 結果[圖3(D)]表明,DEPTOR-G270P的表達量與野生型DEPTOR相比增加了3～5倍, 根據(jù)Bradford檢測結果可知, 該表達量達到了每升培養(yǎng)基15～20mg蛋白, 遠高于野生型DEPTOR在相同條件下每升培養(yǎng)基3～5mg蛋白的表達量.

DEPTOR蛋白純化條件的改進一直是研究熱點. 經(jīng)過對純化條件的篩查發(fā)現(xiàn), 使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 工作濃度20mmol/L,pH=7.0),NaCl(150mmol/L)并混合入甘油(體積分數(shù)10%)作為破菌緩沖液進行DEPTOR-G270P蛋白的純化過程, 所得的蛋白質雜質相對含量最少[圖3(E)]. 這是由于甘油所含的羥基與DEPTOR蛋白的富絲氨酸結構域側鏈含有的大量羥基[5]具有親和性, 能夠促進DEPTOR蛋白結構的穩(wěn)定性, 減少其變性或降解等問題.

使用Hiload-S200凝膠過濾柱對獲得的DEPTOR溶液進行凝膠過濾對蛋白質按照分子量進行分離, 用以鑒定蛋白質在溶液中以何種分散形式存在, 并去掉蛋白質中的高聚體.由圖S7結果(見本文支持信息)可知, 高聚體位于6和7號管中, 根據(jù)SDS-PAGE的結果估算, 高聚體約占DEPTOR總量的20%; 13和14號管中的蛋白溶液為DEPTOR寡聚體, 約占20%; 而剩余的16～19號管中的蛋白溶液為DEPTOR二聚體或單體, 這部分約占蛋白質總量的60%.

由DEPTOR野生型及G270P突變體的圓二色譜分析結果(表3和表4)可知, 無論野生型還是G270P突變體, 其圓二色譜結果均顯示表達產(chǎn)物含有約30%的α螺旋結構及約15%的β片層結構, 剩余約55%的結構為β轉角及無規(guī)卷曲部分. 這與Jpred服務器使用各種預測算法對DEPTOR蛋白的二級結構預測結果相吻合(預測該蛋白含有約25%～30% α螺旋結構, 含10%～15% β片層結構, 剩余為β轉角及無規(guī)卷曲). 由此可見, 使用大腸桿菌進行DEPTOR的表達, 其產(chǎn)物二級結構折疊良好, 且G270P突變并未造成二級結構的變化.

Table 3　Percentage of secondary structure in DEPTOR-wt*

*ResultsarethepercentageofeachsecondarystructurecalculatedfromCDspectra.

Table 4　Percentage of secondary structure in DEPTOR-G270P*

*ResultsarethepercentageofeachsecondarystructurecalculatedfromCDspectra.

Fig.4　Location of TRD2 subdomain in mTOR-FAT domain(circle)

根據(jù)TRD-2在整個FAT結構域中的位置(圖4)可知,TRD-2可能與DEPTOR的Loop-rich結構域發(fā)生相互作用. 因此, 將MBP-TRD2與DEPTOR以相同的緩沖液純化后混合, 并使用AKTA系統(tǒng)進行凝膠過濾, 觀察二者是否發(fā)生峰形重疊的現(xiàn)象, 即可知二者是否存在相互作用. 結果(圖5)表明, 二者峰形發(fā)生了不同程度的重疊, 并且對重疊峰形部分進行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),MBP-TRD2與DEPTOR的用量比約為1∶1, 是典型的復合物形成標志, 因此猜測TRD2與DEPTOR能夠形成1∶1的復合物.

Fig.5　Interaction assay of MBP-TRD2 and DEPTOR (A) MBP-TRD2 and DEPTOR co-purification by gel-filtration (Hi-Load S200) in 20 mmol/L Tris, pH=8.0 and 150 mmol/L NaCl; (B) MBP and DEPTOR co-purification by gel-filtration in the same condition as a negative control. Samples of the putative complexes are picked and analyzed by SDS-PAGE. In each figure, x-axis indicates the elution volume which reflects molecular mass of the protein and y-axis indicates the absorption value which is in direct proportion to protein concentration.

3結論

研究表明,mTOR的TRD2亞結構域可以通過與MBP蛋白的融合而依靠大腸桿菌表達體系實現(xiàn)大量的可溶性表達.DEPTOR蛋白表達純化的優(yōu)化過程表明, 使用大腸桿菌體系對DEPTOR蛋白的足量表達可對降解模體進行G270P點突變, 同時在純化過程中引入甘油(體積分數(shù)10%), 在相同條件下可使DEPTOR蛋白的表達量提高3～5倍, 且純度也得以提高. 而DEPTOR與MBP-TRD2的柱上結合實驗結果表明,FAT結構域能夠直接與DEPTOR相互作用, 也說明了FAT結構域中的TRD2亞結構域在某種條件下能夠與DEPTOR相互作用, 這為mTOR和DEPTOR整體相互作用的研究和mTOR的內源活性調控[21]以及癌癥信號通路的抑制[22,23]提供了實驗方面的研究數(shù)據(jù).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150817.

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(Ed.:P,H,V,K)

?SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.21131003, 21073015, 21273023).

doi:10.7503/cjcu20150817

收稿日期:2015-10-23. 網(wǎng)絡出版日期: 2016-04-18.

基金項目:國家自然科學基金(批準號: 21131003, 21073015, 21273023)資助.

中圖分類號O629; Q516

文獻標志碼A

ExpressionandPurificationofDEPTORandItsInteractionwithmTOR-TRD2?

WANGNan1,CHENGXiaoheng2,ZHENGJimin1*,CHENGuangju1,JIAZongchao3

(1. School of Chemistry, 2. School of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 100875, China;3. Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen’s University, KingstonK7L3N6, Canada)

AbstractThe inhibition of mammalian target of rapamycin(mTOR) is important to cancer treatment. DEPTOR is currently known as an endogenous mTOR inhibitor and could interact with mTOR FAT domain to suppress mTOR activity in vivo. It showed that MBP fusion mTOR TRD2 subdomain could be expressed in BL21(DE3) with conversional protocol and DEPTOR-G270P mutation could be expressed 5-fold more than wild-type DEPTOR in BL21(DE3). Adding glycerol(volume fraction 10%) in purification buffer would improve DEPTOR-G270P purity. CD spectra assay showed that this purification protocol could produce DEPTOR in large quantity without affecting its secondary structure. Gel-filtration assay indicated possible interactions between mTOR-TRD2 subdomain and DEPTOR, which may provide insights into mTOR-DEPTOR interaction and give new information about mTOR inhibition.

KeywordsMammalian target of rapamycin(mTOR); TRD2 subdomain; DEPTOR; G270P mutation; Escherichia coli expression

聯(lián)系人簡介: 鄭積敏, 男, 博士, 教授, 博士生導師, 主要從事磷酸化蛋白質及鈣調蛋白的結構與功能研究.

E-mail:jimin_z@bnu.edu.cn