劉　靜　鄧　晶　陳揚凱　騰　青　徐秀章　邵　媛　王嘉勵　夏文杰　葉　欣

廣州血液中心臨床輸血研究所 (廣州 510095)

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ITP患者血清IgG型抗體糖基化特異性的研究

劉靜鄧晶陳揚凱騰青徐秀章邵媛王嘉勵夏文杰葉欣

廣州血液中心臨床輸血研究所 (廣州 510095)

【摘要】目的分析ITP患者血清中IgG型抗體糖基化的特異性，初步探討其特異性與臨床癥狀的相關性。方法選取健康獻血員30例、ITP患者13例及健康懷孕婦女23例，純化血清中的IgG型抗體，應用nano-LC-MS法分析糖基化種類及水平，對比分析ITP患者血清中IgG型抗體的糖基化特異性。 結果① ITP 患者血清中IgG型抗體的半乳糖糖基化水平為47.08±2.69，低于健康懷孕婦女(50.93±2.21)，高于健康獻血員(42.88±2.00)(P<0.05)；② ITP 患者巖藻糖基化水平為81.16±2.49低于健康獻血員(82.60±2.56)(P>0.05)，同時低于健康懷孕婦女(86.17±2.23)(P<0.05)；③ITP 患者唾液酸化水平為3.93±1.20，高于健康獻血員(3.69±1.19)，低于健康懷孕婦女(4.28±0.88)(P>0.05)。④ITP 患者乙酰葡糖氨基化水平為10.53±1.41，低于健康獻血員(11.54±1.76)，高于健康懷孕婦女(10.13±1.45)(P>0.05)。 結論ITP患者血清中的IgG型抗體的巖藻糖基化、半乳糖糖基化水平的特異性可能是其產(chǎn)生有別于健康懷孕婦女的臨床癥狀的的分子基礎。

【關鍵詞】ITPIgG型抗體糖基化

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic, ITP) 是一種獲得性的自身免疫型疾病，臨床上主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜瘀斑、出血，嚴重時可能出現(xiàn)內(nèi)臟出血甚至顱內(nèi)出血。患者血清中含有抗血小板的抗體，尤其是病程兇險的慢性ITP患者血清中主要存在的抗體是IgG1型(77%)[1]。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白 (約占80%)，其Fc段含有唯一的N-糖基化修飾保守位點，即Asn-297。由于連接在Asn-297核心七糖上的糖鏈末端的糖基不同，IgG存在著種屬、組織、年齡和性別的特異性。連接在Asn-297上的糖鏈可維持IgG抗體的四級結構以及Fc段的熱穩(wěn)定性，并通過影響IgG分子與FcRsXlq以及FcRn的結合而分別調(diào)節(jié)抗體依賴細胞毒作用(ADCC)、補體依賴的細胞毒作用(CDC)以及抗體的半衰期，從而導致患者出現(xiàn)血小板減少、免疫力降低及皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血等臨床癥狀[2-5]。

ITP的主要發(fā)病機制為患者血清中存在的IgG 型抗體可介導產(chǎn)生相應的臨床病癥，而部分健康人群及健康的懷孕婦女血清中也存在IgG抗體，卻并不會產(chǎn)生與ITP患者相似的臨床癥狀。這可能與ITP患者產(chǎn)生的抗體Fc段的N-糖基化的保守位點的糖基的特異性有關。故本實驗通過純化ITP患者與健康人群及健康懷孕婦女血清中的IgG型抗體，檢測其糖基化的特異性，并將三者進行比較，尋找ITP患者血清中抗體糖基化的特異性與其臨床癥狀的相關性。

1資料與方法

1.1研究對象隨機選取2007年—2013年廣州血液中心采集的30份健康獻血員、23份健康懷孕婦女及13份臨床診斷為ITP的患者血清標本。本研究遵循的程序符合廣州血液中心人體試驗委員會所制定的倫理學標準，得到該倫理會批準，試驗征得受試對象本人的知情同意，并與之簽訂臨床研究知情同意書。

1.2主要試劑和儀器ProtG-sepharose 磁珠 (GE Healthcare 17-0618-05)，formic acid(94318-250 mL-F Fluka analytical)，Acetic acid (glacial) CH3COOH (EMSURE-K44691363326)，NH4HCO3(FlukaBioChemika-09830 500 gr)，Trypsin(Promega Cat # V5111)。壓力真空泵，平板搖床，真空離心濃縮系統(tǒng)，質(zhì)譜儀。

1.3方法nano-LC-MS法

1.3.1從血清中純化IgG型抗體。將洗滌后的30 μl Protein G- Sepharose 磁珠和2 μl血清混勻，孵育1小時，吸附血清中的抗體。PBS、去離子水分別洗滌三次，100 μl甲酸將抗體洗脫，真空離心濃縮系統(tǒng)中離心3小時，獲得純化的抗體。

1.3.2使用胰蛋白酶消化抗體，獲得抗體的Fc段。純化獲取的抗體加入20 μl NH4HCO3在搖床上孵育10分鐘，后加入20 μl稀釋后的胰蛋白酶，于搖床上孵育10分鐘，隨機選取3- 4個檢測孔檢測其pH值，確保pH>6(若<6，可用NH4HCO3調(diào)整)。將反應板密封，37℃孵育過夜。

1.3.3將檢測孔稀釋10倍，上機檢測。

1.4統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，組間采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

ITP 患者血清中IgG型抗體的半乳糖糖基化水平為(47.08±2.69)，低于健康懷孕婦女(50.93±2.21)，高于健康獻血員(42.88±2.00)，該差異有統(tǒng)計學意義，見圖A；巖藻糖基化水平為(81.16±2.49)，低于健康獻血員(82.60±2.56)，該差異無統(tǒng)計學意義，與健康懷孕婦女(86.17±2.23)相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05).見圖B；唾液酸化水平為(3.93±1.20)，高于健康獻血員(3.69±1.19)，低于健康懷孕婦女(4.28±0.88)，此差異無統(tǒng)計學意義，見圖C；乙酰葡糖氨基化水平為(10.53±1.41)，低于健康獻血員(11.54±1.76)，高于健康懷孕婦女(10.13±1.45)此差異無統(tǒng)計學意義，見圖D。

圖1血清中IgG型抗體的糖基化水平及種類(A：半乳糖糖基化水平；B：巖藻糖基化水平；C：唾液酸化水平；D：乙酰葡糖氨基化水平。*P<0.05 NSP>0.05)

3討論

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic, ITP) 又稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是臨床上最常見的、原因不明的出血性疾病，是一種獲得性的自身免疫型疾病。目前的研究認為ITP的發(fā)病機制非常復雜，仍在不斷的研究更新中，最重要的是自身抗體介導的血小板的破壞。

ITP患者血清中含有的主要抗體類型是IgG，糖基化是IgG重要的翻譯后修飾，末端糖鏈的不同可產(chǎn)生不同的糖基化，包括半乳糖基化、核心巖藻糖基化、唾液酸化、乙酰葡糖胺基化和甘露糖基化。近年來越來越多的人認為蛋白糖基化修飾在許多疾病中起到非常重要的作用[2- 4]。研究發(fā)現(xiàn)不同的糖基化對IgG功能的影響有所不同：①末端半乳糖基化對IgG功能的影響目前尚未達成共識。Kumpel等研究表明半乳糖化水平增高可提高ADCC[5]。 Hodoniczky等[6]卻發(fā)現(xiàn)提高末端半乳糖基化水平，可增強其CDC的強度，但對ADCC并無影響；②IgG若無核心巖藻糖基化，則其與FcrRⅢa親和力明顯增強，同時ADCC也顯著增強[6-8]。③唾液酸糖基化水平越高，抗體與抗原的結合活性和ADCC越低[7]；④糖鏈末端乙酰葡糖胺基化水平的提高可顯著增強IgG的ADCC,但對其CDC和半衰期影響比較小[8]；⑤抗體的甘露糖基化水平升高，其ADCC顯著升高，而CDC卻減弱；已有研究表明ITP患者血清中的抗體的N-糖基化同樣可以影響血小板吞噬和血小板存活時間，并通過影響補體活化調(diào)節(jié)ADCC的強度[9]。因此，ITP患者血清中抗體的糖基化特異性的研究便十分必要。本實驗將ITP患者及健康孕婦和健康獻血員血清中抗體的糖基化水平進行比較，發(fā)現(xiàn)與健康獻血員相比，ITP患者半乳糖基化的水平有明顯的增高，但較健康懷孕婦女增高的幅度較小，核心巖藻糖基化的水平有略微下降，而此時懷孕婦女較健康獻血員則表現(xiàn)為明顯的升高，雖經(jīng)檢驗分析后無統(tǒng)計學差異，但考慮是由于樣本量不足導致，其間的差異較為明顯，推測在擴大樣本量之后該差異仍應存在。由此可發(fā)現(xiàn)，ITP患者產(chǎn)生的血小板特異性抗體較健康獻血員半乳糖基化水平增強，核心巖藻糖基化水平減弱，而較健康懷孕婦女半乳糖基化水平和核心巖藻糖基化水平均增強。該差異可能導致ITP患者與健康的懷孕婦女雖然血清中都產(chǎn)生了IgG型抗體，但ITP患者出現(xiàn)不同程度的血小板減少，皮膚、粘膜或內(nèi)臟出血等臨床癥狀，而懷孕婦女并無相應臨床病癥。

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基金項目：廣東省醫(yī)學科研基金項目(B2013344)、廣州市醫(yī)學重點學科建設項目、廣州市血液安全重點實驗室；廣州科技計劃應用基礎研究計劃項目(2010Y1-C471)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點項目(20121A021020)

通信作者:葉欣，E-mail:huang_yexin@qq.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.009

(收稿日期：2015-12-10)

Study on the glycosylation specificity of the IgG antibody in ITP

LiuJing,DengJing,ChenYangkai,etal.

GuangzhouBloodCenterInstituteofBloodTransfusion,Guangzhou510095,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the glycosylation specificity of the IgG antibody in ITP.MethodsChoose 30 healthy donors, 23 healthy pregnants and 13 ITP patients, purified the IgG antibody from serum, analysied the level of all kinds of glycosylation. Compared with healthy donor and healthy pregnants to find the specificity of the IgG antibody in ITP patients.Results① The galacosylation of IgG antibody in ITP patients was 47.08±7.24，lower than healthy pregnants (50.93±4.91), higher than healthy donor (42.88±4.01), and the healthy pregnants were higher than healthy donor (P<0.05). ② The fucosylation in ITP patients was 81.16±6.2， lower than healthy donors (82.60±2.56) (P>0.05), higher than healthy pregnants(86.17±2.23)(P<0.05)； ③The sialylation in ITP patients was 3.93±1.20, higher than healthy donors (3.69±1.19), lower than healthy pregnants (4.28±0.88)(P>0.05); ④The GlcNAc in ITP patients was 10.53±1.41, lower than healthy donors (11.54±1.76), higher than healthy pregnants (10.13±1.45)(P>0.05).Conclusion The specificity of IgG antibody in ITP patients in galacosylation and fucosylation may be the molecule base of ITP’s clinic symptom.

【Key words】Immune thrombocytopenic; IgG antibody; Glycosylation

共同第一作者：劉靜，鄧晶