張　霄，李志英

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黃芪注射液加強(qiáng)心肌保護(hù)液在兔未成熟心肌保護(hù)作用的研究

張霄1，李志英2

1. 山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)；2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

摘要：目的探討黃芪注射液加強(qiáng)心肌保護(hù)液對(duì)未成熟兔心肌的保護(hù)作用。方法24只幼兔(兔齡14 d～21 d)隨機(jī)分3組，每組8只。用Langendorff模型灌注離體心臟。平穩(wěn)灌注45 min后，主動(dòng)脈根部灌注STH液(4℃)。對(duì)照組(Con)：灌注STH液；黃芪組(AS)：黃芪注射液+STH灌注；5-羥葵酸液(5-HD)組：5-HD+STH灌注。3組心臟均經(jīng)歷停灌30 min(保溫、保濕)及再灌注40 min復(fù)制模型。觀察3組的血流動(dòng)力學(xué)、心肌酶、冠脈流出液、病理學(xué)變化、心肌能量變化及分子生物學(xué)改變。結(jié)果黃芪組左心功能、冠脈流量恢復(fù)及再灌后心肌組織內(nèi)ATP含量明顯優(yōu)于對(duì)照組及5-HD組，心肌酶值明顯低于對(duì)照組及5-HD組，心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)分析顯示預(yù)處理組線粒體損傷輕于對(duì)照組及5-HD組，心肌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)AS組78.4 ng，高于對(duì)照組20.8 ng及5-HD組61.8 ng。結(jié)論黃芪加強(qiáng)心肌保護(hù)液對(duì)兔未成熟心肌有保護(hù)作用，黃芪可能是KATP通道開放劑。

關(guān)鍵詞：黃芪注射液； 心肌保護(hù)液； 未成熟兔心??；5-羥葵酸； KATP通道

黃芪為豆科多年生草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge Var Mongholicus (Bge) Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge的干燥根。藥性甘，微溫、歸脾、肺經(jīng)。功效為生陽(yáng)補(bǔ)氣，固表益衛(wèi)，消腫利水，托瘡生肌。目前在臨床上已廣泛應(yīng)用且取得了很好的療效。本實(shí)驗(yàn)探討黃芪注射液加強(qiáng)心肌保護(hù)液對(duì)未成熟兔心肌的保護(hù)作用，及是否對(duì)ATP依賴鉀離子通道(KATP)通道有作用，并從機(jī)制上加以討論。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑多導(dǎo)生理記錄儀(Macintosh，Quadra 610，Japan；Chart 3.6v/s)，恒溫循環(huán)器(HX-10555，北京)，改良Langendorff 裝置，Stocker血泵(Gemany)，混合氣(O2∶CO2=95%∶5%，北京)，超純水(SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海)。Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液成分：NaCl 118.5、NaHCO325.0、KH2PO41.2、KCl 4.8、MgSO4·7H2O 1.2、CaCl2·2H2O 1.8、葡萄糖 11.0。pH 7.4±0.5。黃芪注射液為成都地奧公司生產(chǎn)，每毫升含原生藥2 g。5-羥葵酸(5-hydroxydecanoic acid， 5-HD)編號(hào)H135，美國(guó)sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?shí)驗(yàn)兔為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(純種新西蘭白兔)。兔重300 g～350 g，兔齡14 d～21 d。氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.5 g/kg)，經(jīng)股靜脈肝素化(150 IU/kg)，劍下開腹腔，沿前胸壁充分游離膈肌，雙側(cè)橫斷肋骨，胸腔完全暴露，迅速剪開壁層心包，小心快速取出心臟，浸入4℃K-H緩沖液(KHB)，主動(dòng)脈略修剪， 30 s內(nèi)連于Langendorff灌注裝置并用39℃經(jīng)混合氣(O2∶CO2=95%∶5%)平衡的K-H緩沖液灌注，在肺動(dòng)脈根部剪開以保證冠脈回流通暢，灌注壓60 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kpa)。剪開左心耳，向左室插入與多導(dǎo)生理檢測(cè)儀相連的帶球囊導(dǎo)管，立即將心臟移入保溫(39℃)缸內(nèi)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及步驟平穩(wěn)灌注30 min后，向球囊內(nèi)緩慢注入生理鹽水，調(diào)整至左室舒張壓(LVDP)為10 mmHg(1 mmHg=0.133 kpa)。將18只幼兔隨機(jī)分為3組。主動(dòng)脈根部灌注對(duì)照組(CON)：灌注STH液；黃芪組(AS)：AS(2 mL/kg)+STH液灌注；5-HD組：5-HD(100 μmol/L)+STH灌注。3組心臟均經(jīng)歷停灌30 min(保濕、保溫)、再灌注45 min。

1.4測(cè)定指標(biāo)平穩(wěn)灌注30 min時(shí)，記錄冠脈流量(CF)、心率(HR)、LVDP、左室壓力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)作為基礎(chǔ)值。全程記錄再灌注后左室波動(dòng)圖形；分別記錄再灌后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min的CF、HR、LVDP、±dp/dtmax測(cè)定值，并把它們表達(dá)為其對(duì)基礎(chǔ)值的恢復(fù)率。取再灌注后10 min冠脈流出液，以自動(dòng)生化分析儀(日立，T170A型)測(cè)定肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)。再灌注畢，快速取下心臟，濾紙吸盡心臟表面水分，剪取心尖部位約200 mg組織液氮保存，用以測(cè)定ATP。每組隨機(jī)取一例左室心肌作電鏡及用分子生物學(xué)方法測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。

2結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)變化平衡期末，3組各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌后，黃芪組LVDP、±dp/dtmax在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的恢復(fù)率均較對(duì)照組及5-HD組顯著性增高(P<0.05)。加入5-HD后其保護(hù)作用減弱，甚至消失。詳見表1。

表1　各組STH灌注后血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)情況比較(±s) 　%

2.2心肌酶缺血復(fù)灌5 min后心肌酶值以AS組最低，對(duì)照組及5-HD組復(fù)灌后心肌酶值明顯升高。詳見表2。

IU/L

2.3心肌組織內(nèi)ATP含量AS組心肌組織內(nèi)ATP含量明顯較對(duì)照組及5-HD組高。AS組(35.93±7.83)μg/(g· wet)，與CON組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；5-HD組(22.34±2.79)μg/(g·wet)，與CON組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組為(15.55±1.98)μg/(g·wet)。

2.4形態(tài)學(xué)改變透射電鏡觀察顯示：對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)尚清。部分線粒體空泡變性，腫脹；部分心肌肌原纖維排列較散亂，肌節(jié)長(zhǎng)度不一，有灶狀肌絲溶解破壞；部分線粒體內(nèi)出現(xiàn)致密沉積物，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。黃芪預(yù)處理組：心肌結(jié)構(gòu)清楚；肌原纖維排列整齊；肌節(jié)結(jié)構(gòu)較清晰，部分肌節(jié)縮短，H帶結(jié)構(gòu)不清，少數(shù)區(qū)域肌纖維肌節(jié)有破壞，Z線模糊；線粒體數(shù)量相對(duì)較少，個(gè)別區(qū)域輕度空泡變性；肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；未見糖原蓄積?？傮w印象：黃芪組心肌損傷較對(duì)照組減輕。5-HD組介于以上兩組之間。

2.5iNOS改變用PCR法測(cè)定相對(duì)含量為：AS組78.4 ng；5-HD組61.8 ng；對(duì)照組20.8 ng。

3討論

黃芪為傳統(tǒng)中藥，黃芪注射液臨床用于冠心病、心絞痛、竇緩等的治療療效顯著。黃芪對(duì)心肌的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，能降低心率、縮小心肌缺血范圍，維持內(nèi)皮細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)，顯著改善心肌缺血再灌注時(shí)左室的舒張及收縮功能，還具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化、減輕鈣超載、減輕白細(xì)胞聚集等作用。

黃芪預(yù)處理對(duì)未成熟心肌有保護(hù)作用[1]，其保護(hù)作用是通過啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制來完成的。黃芪是ATP依賴鉀離子通道的開放劑[2]。開放細(xì)胞膜KATP通道能縮短心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位，并由此引發(fā)保護(hù)效應(yīng)。位于線粒體內(nèi)膜的KATP通道在預(yù)處理過程中也發(fā)揮著重要的作用。5-羥葵酸是線粒體KATP通道的特異性阻斷劑。將黃芪加入St.ThomasⅡ號(hào)心肌保護(hù)液中，了解線粒體KATP通道能否開放，是否同樣能增強(qiáng)心肌保護(hù)液對(duì)未成熟兔心肌的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，AS組無(wú)論在左心收縮舒張功能、心率、冠脈流量的恢復(fù)，還是在減少再灌后心肌酶值等方面均較單純應(yīng)用心肌保護(hù)液組及5-HD組好。AS組的組織ATP含量較對(duì)照組及5-HD組明顯提高。電鏡觀察AS組心肌損傷較對(duì)照組及5-HD組減輕，分子生物學(xué)方法測(cè)定iNOS半定量，AS組明顯高于對(duì)照組及5-HD組。

線粒體不僅是細(xì)胞能量的供應(yīng)站，并且具有很強(qiáng)的緩沖心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+的能力。線粒體內(nèi)膜內(nèi)負(fù)外正的電位差是線粒體吸收Ca2+的主要?jiǎng)恿?。線粒體KATP通道在缺血過程中開放對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)的機(jī)制可能與該通道開放后K+內(nèi)流使線粒體內(nèi)膜電位發(fā)生去極化有關(guān)；線粒體內(nèi)膜電位絕對(duì)值降低，減小了Ca2+進(jìn)入線粒體基質(zhì)的動(dòng)力，防止了線粒體鈣超載的發(fā)生。目前越來越多的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伴隨著缺血再灌注損傷是線粒體的鈣超載而不是細(xì)胞漿內(nèi)的鈣超載。同時(shí)，隨著K+內(nèi)流，線粒體內(nèi)滲透壓升高，胞漿水分進(jìn)入線粒體內(nèi)引起線粒體基質(zhì)膨脹；研究表明線粒體體積適度(10%以內(nèi))的增加能激活脂肪酸氧化和電子轉(zhuǎn)移，促進(jìn)ATP的生成。此外，線粒體KATP通道開放還能減少線粒體內(nèi)氧自由基的生成。

黃芪對(duì)未成熟兔心肌有保護(hù)作用的機(jī)制為黃芪可以激發(fā)未成熟兔心肌細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)：①腺苷生成增加：停跳液中加入黃芪注射液，可使缺血后心肌組織的內(nèi)源性腺苷釋放明顯增加，實(shí)現(xiàn)腺苷多方面的心肌保護(hù)作用[3-4]。②NO濃度增加：心肌細(xì)胞缺血早期，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)/環(huán)磷酸腺苷(cAMP)比值下降時(shí)，可刺激心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生緩激肽，進(jìn)而作用于內(nèi)皮細(xì)胞的緩激肽B2受體產(chǎn)生NO，緩激肽和NO均有保護(hù)心肌作用；iNOS的激活可能參與預(yù)處理的延遲保護(hù)(DP)作用。NO與缺血再灌注損傷有密切關(guān)系，其作用機(jī)制可能是通過阻礙中性粒細(xì)胞的黏附而減輕缺血再灌注損傷程度[5]。黃芪可以提高再灌注后未成熟兔心肌iNOS的含量。③開放ATP依賴鉀離子通道。對(duì)KATP通道作用機(jī)制可能為：KATP通道對(duì)K+具有高度選擇性，具有時(shí)間和電壓不依賴性，開放和關(guān)閉狀態(tài)只受ATP濃度的控制。本實(shí)驗(yàn)顯示黃芪可以明顯提高心肌組織ATP含量，而5-HD組ATP含量則明顯減少，即5-HD阻斷了KATP通道，減弱了黃芪的作用，甚至消失；進(jìn)而證實(shí)黃芪對(duì)未成熟心肌的保護(hù)可能是通過開放KATP通道而實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷是線粒體的鈣超載而非細(xì)胞漿內(nèi)的鈣超載[6]，K+內(nèi)流使線粒體內(nèi)膜電位發(fā)生去極化，線粒體內(nèi)膜電位絕對(duì)值降低，減小了Ca2+進(jìn)入線粒體基質(zhì)的動(dòng)力，防止了線粒體鈣超載的發(fā)生；線粒體體積適度增加(10%以內(nèi))，會(huì)促進(jìn)ATP的生成[7]。隨著K+內(nèi)流，線粒體內(nèi)滲透壓升高，胞漿水分進(jìn)入線粒體內(nèi)引起線粒體基質(zhì)膨脹，ATP生成增多[8-10]。黃芪可能是通過開放線粒體膜KATP通道、K+內(nèi)流使線粒體內(nèi)膜電位發(fā)生去極化，阻止Ca2+進(jìn)入線粒體基質(zhì)，防止線粒體鈣超載，同時(shí)使線粒體體積適度增加，ATP的生成增多而起到保護(hù)未成熟兔心肌的作用。

黃芪加強(qiáng)停跳液通過增強(qiáng)線粒體KATP通道的開放對(duì)未成熟兔心肌有保護(hù)作用，但對(duì)其機(jī)制仍不十分清楚，須進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯王雅潔)

通訊作者：李志英，E-mail：leezhiyingcpb@sina.com

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.016

文章編號(hào)：1672-1349(2016)13-1491-03

(收稿日期：2016-05-25)