何軍華，王　麗，吳慧璐，范運娟，王　巍，范　鑫，李　興

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血管緊張素(1-7)對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的作用

何軍華，王麗，吳慧璐，范運娟，王巍，范鑫，李興

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院(太原 030001)

摘要：目的探討血管緊張素(1-7)[Ang-(1-7)]對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠糖代謝及胰島β細胞凋亡的影響。方法健康雄性Wistar大鼠給予高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，建立2型糖尿病模型大鼠共20只，隨機分為糖尿病對照組(D0組)和Ang-(1-7)干預組(D1組)，同時設(shè)正常對照組(NC組)。D1組給予Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)皮下注射，余兩組注射等體積生理鹽水。干預共持續(xù)8周，監(jiān)測空腹血糖(FPG)，檢測血清中空腹胰島素(FINS)及Ang Ⅱ的含量，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，免疫組化法檢測胰島細胞內(nèi)iNOS及Caspase-3的蛋白表達，實時熒光定量PCR法檢測胰島iNOS、bax、bcl-2及Caspase-3的mRNA表達。結(jié)果與NC組相比，D0組大鼠FPG、AngⅡ及HOMA-IR明顯升高，F(xiàn)INS濃度降低，胰腺iNOS、Caspase-3的蛋白表達分別增加了77.1%、1.03倍，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表達水平分別增加3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2基因表達降低了74.8%(P<0.05)。與D0組相比，D1組FPG、Ang Ⅱ及HOMA-IR下降，F(xiàn)INS濃度升高，iNOS及Caspase-3蛋白表達分別降低了19.4%、37.2%，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表達水平分別降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2基因表達增加了81.2%(P<0.05)。結(jié)論Ang-(1-7)可通過降低胰島局部氧化應(yīng)激,減少β細胞凋亡而改善STZ誘導的糖尿病大鼠胰島分泌功能及胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用。

關(guān)鍵詞：糖尿?。淮笫?；血管緊張素(1-7)；胰島功能；細胞凋亡

近年來2型糖尿病與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)的關(guān)系備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)RAS阻斷劑可降低高危人群的新發(fā)糖尿病發(fā)生率[1-2]。利用RNA干擾技術(shù)阻斷血管緊張素轉(zhuǎn)換酶以及利用血管緊張素 Ⅱ(AngiotensinⅡ，Ang Ⅱ受體阻斷劑在細胞水平及動物實驗中均可以減少氧化應(yīng)激及細胞凋亡，改善胰腺纖維化，增加胰島素分泌[3-5]。血管緊張素(1-7) [angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是RAS的重要成員之一，主要由Ang Ⅱ在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的作用下生成，通過與其受體結(jié)合發(fā)揮擴血管、抗炎、抗組織纖維化、抗氧化應(yīng)激等效應(yīng)，與Ang Ⅱ作用相反[6-7]。已有研究表明，Ang-(1-7)可以促進葡萄糖攝取和脂質(zhì)分解，改善胰島素抵抗及血脂異常[8]。

本研究即應(yīng)用高脂高熱量飼料喂養(yǎng)結(jié)合小劑量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，給予Ang-(1-7)干預，觀察Ang-(1-7)對糖代謝、胰島素分泌功能、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激以及胰島β細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1動物模型制備及分組8周齡雄性Wistar大鼠，體重180 g～220 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機選取12只為正常對照(NC)組，普通飼料喂養(yǎng)。24只給予高糖高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，一周后非同日兩次尾靜脈采血測隨機血糖≥16.7 mmol/L為成模標準。成模大鼠20只隨機分為糖尿病對照組(D0組，n=10)、Ang-(1-7)干預組(D1組，n=10)。D1組以Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)頸部皮下注射，余兩組以等量的生理鹽水頸部皮下注射，共干預8周。

1.2檢測指標實驗前后測體重和空腹血糖(FPG)，每日觀察動物的食欲、活動力、體溫及其他反應(yīng)情況。 實驗結(jié)束時ELISA法檢測血清Ang Ⅱ和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)的濃度，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA -IR)，HOMA-IR=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

1.3免疫組化檢測胰腺iNOS與Caspase-3蛋白表達做胰腺組織石蠟切片，每個大鼠每個指標選5張切片，iNOS與Caspase-3免疫組織化學染色，將每張切片隨機編號，在高倍(×400)鏡下雙盲觀察6～8個視野，選擇胰島部分用計算機圖像處理系統(tǒng)進行平均光密度值檢測，經(jīng)校正后代表其蛋白的相對表達水平，并量化分析。1.4實時熒光定量PCR提取胰島β細胞總RNA，檢測iNOS、Bax、Bcl-2與Caspase-3的mRNA表達水平?；驍U增反應(yīng)條件均為：94℃預變性10 min，94℃15 s，60℃60 s，擴增45個循環(huán)。引物序列見表1。

表1　引物序列

2結(jié)果

2.1Ang-(1-7)對大鼠FPG、體重、Ang Ⅱ、FINS及HOMA-IR的影響(見表2)干預結(jié)束后，D0組和D1組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義，但兩組體重均低于NC組。與NC組比較，D0組FPG、AngⅡ濃度、HOMA-IR明顯升高，F(xiàn)INS明顯減少。D1組與D0組相比，F(xiàn)PG、Ang Ⅱ、HOMA-IR降低，F(xiàn)INS增加。提示Ang-(1-7)治療降低RAS活性，增加血清胰島素含量，改善胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用。

表2　干預后各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、Ang Ⅱ的比較(±s)

2.2免疫組化結(jié)果胰島內(nèi)iNOS與Caspase-3的表達水平(見圖1、表3)與NC組相比，D0組胰島iNOS相對表達量增加了77.1%，Caspase-3相對表達量增加了1.03倍。與D0組相比，D1組iNOS相對表達量降低了19.4%，Caspase-3相對表達量下降了37.2%。表明經(jīng)Ang-(1-7)干預后，胰島內(nèi)氧化應(yīng)激降低，促凋亡蛋白表達下降。

圖1　胰島iNOS及Caspase-3免疫組化染色(×400)

表3　各組大鼠胰島免疫組化結(jié)果量化分析(±s)

2.3iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達水平(見表4)與NC組相比，D0組iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平分別增加了3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2mRNA表達水平降低了74.8%。與D0組相比，D1組iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平分別降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2mRNA表達水平增加了81.2%。表明經(jīng)Ang-(1-7)干預后，促β細胞凋亡因子基因表達下降，抗凋亡因子基因表達增加。

表4　胰腺內(nèi)iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA相對表達量(±s)

3討論

研究已證實胰腺組織內(nèi)能表達完整的且具有功能活性的RAS成分，并參與胰島β細胞功能和存活的調(diào)節(jié)，與糖尿病時β細胞功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。最新研究表明，胰腺存在RAS的重要成分Ang-(1-7)，可拮抗Ang Ⅱ的作用，Ang-(1-7)參與幾乎所有RAS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制[10-13]，成為具有很大潛力的RAS干預靶點。

高糖時胰腺局部RAS過度表達，Ang Ⅱ生成增加，誘導胰島細胞產(chǎn)生過多的活性氧中間產(chǎn)物，一方面可能激活細胞內(nèi)凋亡通路，誘導細胞凋亡，抑制胰島素的合成及釋放，最終導致胰島結(jié)構(gòu)和功能損害，另一方面也可直接損害胰島β細胞[14-15]。本實驗也發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清Ang Ⅱ濃度增加，胰島局部iNOS及凋亡因子Caspase-3蛋白表達水平升高，同時血清胰島素濃度下降。通過給予Ang-(1-7)干預后發(fā)現(xiàn)，血清Ang Ⅱ濃度降低，胰島的iNOS及Caspase-3蛋白表達水平均減少，胰島素分泌增加。

2型糖尿病中胰島β細胞凋亡的主要信號途徑是線粒體途徑[16]，即促凋亡因子(如Bax、Bid等)和抗凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xl等)異常表達使線粒體外膜通透性增加，同時內(nèi)膜里的細胞色素C釋放到細胞質(zhì)，激活Caspase3、Caspase6、Caspase7，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和代謝，導致細胞凋亡。研究表明氧化應(yīng)激是引起β細胞功能缺陷并加劇其惡化的主要原因，活性氧(ROS)類物質(zhì)是細胞凋亡的重要介質(zhì)，作用于線粒體凋亡途徑的各個環(huán)節(jié)。ROS既能上調(diào)Bax的表達，又能在Caspase級聯(lián)放大中起到重要作用[17-19]。本實驗發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠經(jīng)Ang-(1-7)干預后，胰島中促凋亡因子Bax、Caspase-3基因表達降低，抗凋亡因子Bcl-2基因表達升高，由此可推測糖尿病狀態(tài)下拮抗RAS后，可通過下調(diào)iNOS的表達，降低胰島局部氧化應(yīng)激水平，減少β細胞凋亡，對β細胞起到保護作用。

有研究證實在氧化應(yīng)激時，可導致胰島素信號通路受阻，引發(fā)胰島素抵抗。研究表明RAS與胰島素抵抗關(guān)系密切，Ang Ⅱ可影響肝臟、肌肉和脂肪組織的胰島素受體、胰島素受體底物及葡萄糖轉(zhuǎn)運體4等，激活胰島素抵抗[20]。本實驗用Ang-(1-7)干預后，糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)降低，說明阻斷RAS可增加胰島素的敏感性。

STZ誘導的糖尿病大鼠Ang Ⅱ生成增多，胰腺局部氧化應(yīng)激反應(yīng)、促凋亡因子表達增加，抗凋亡因子表達下降，胰島素分泌減少，胰島素抵抗指數(shù)增加。Ang-(1-7)干預可減弱胰腺局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善凋亡系統(tǒng)失衡，改善胰島素分泌功能及胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用。

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(本文編輯王雅潔)

基金項目：山西省自然科學基金(No.2009011056-2)；山西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科技攻關(guān)項目(No.201201074)；山西省高?！?31”領(lǐng)軍人才工程

通訊作者：李興，E-mail：13007000339@163.com

中圖分類號：R587R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.015

文章編號：1672-1349(2016)13-1488-04

(收稿日期：2016-05-11)