劉雪亞，王　平，李　杰，李　萍，衛(wèi)軍華，高祎楠，張國俊#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052　2)河南省職業(yè)病防治研究院毒理室 鄭州 450052　3)鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 鄭州 450001

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大氣細(xì)顆粒物不同成分對(duì)A549細(xì)胞遺傳毒性的影響*

劉雪亞1)，王平2)，李杰2)，李萍1)，衛(wèi)軍華3)，高祎楠3)，張國俊1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 4500522)河南省職業(yè)病防治研究院毒理室 鄭州 4500523)鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 鄭州 450001

摘要目的：研究大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)不同成分對(duì)人肺腺癌Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(A549)遺傳毒性的影響，探索PM2.5暴露的細(xì)胞毒性機(jī)制及發(fā)病機(jī)制, 為開展河南地區(qū)PM2.5的健康危害評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：于鄭州市采集并處理PM2.5非水溶性成分和水溶性成分，分為PM2.5非水溶性和水溶性成分不同濃度(50、100、200、400、800 mg/L)染毒組和對(duì)照組，采用CCK-8比色法測(cè)量A549細(xì)胞在染毒后6、12、24、48和72 h的細(xì)胞存活率，微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各個(gè)濃度染毒24 h后細(xì)胞染色體損傷情況。結(jié)果：PM2.5非水溶性和水溶性成分均能抑制A549細(xì)胞增殖(P<0.05)。染毒24 h 時(shí)800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分或染毒48 h 時(shí)800 mg/L的大氣PM2.5水溶性成分作用下細(xì)胞存活率最低。PM2.5非水溶性成分和水溶性成分均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞染色體損傷，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組微核率明顯升高(P<0.05)，非水溶成分致細(xì)胞微核率較高(P<0.05)。結(jié)論：PM2.5能抑制A549細(xì)胞增殖，導(dǎo)致A549細(xì)胞染色體損傷。非水溶成分的影響可能更大。

近年來，隨著大氣環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，暴露在污染環(huán)境中已對(duì)人類健康構(gòu)成了極大的威脅，肺作為靶器官首當(dāng)其害。在各種污染成分中，大氣顆粒物尤其是細(xì)顆粒物(PM2.5)，即環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，已被公認(rèn)為危害最大、代表性最強(qiáng)的大氣污染物。大量流行病學(xué)研究[1-3]表明PM2.5增加住院率、呼吸系統(tǒng)發(fā)病率和病死率。PM2.5由于相對(duì)較小的體積和較大的表面積，以及其表面攜帶的多種重金屬和有機(jī)毒性物質(zhì)是致DNA損傷的主要成分[4]。當(dāng)前對(duì)PM2.5毒性機(jī)制的研究已成為國內(nèi)外公共衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和前沿。許多研究[5-9]證明了PM2.5的DNA損傷作用和染色體損傷作用，但有關(guān)大氣PM2.5及其不同組分對(duì)A549細(xì)胞遺傳毒性的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。該研究以2013年12月采集的鄭州市大氣PM2.5為實(shí)驗(yàn)樣品，并將其分離的不同組分分別作用于體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，探討大氣PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的生物效應(yīng)以及對(duì)遺傳物質(zhì)損傷的影響，從而評(píng)價(jià)大氣PM2.5的細(xì)胞毒性并探討其對(duì)呼吸系統(tǒng)損傷的可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1.2細(xì)胞培養(yǎng)采用單層貼壁培養(yǎng)法，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg /L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行日常培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：溫度37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，pH值維持在7.2～7.4，相對(duì)飽和濕度為95%。用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞存活率達(dá)90%以上。

1.3大氣PM2.5樣品采集該研究所使用的大氣PM2.5由鄭州大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究院采集，采樣地點(diǎn)位于鄭州市高新區(qū)鄭州大學(xué)綜合科研樓四樓樓頂(113°31′ E；34°48′ N)，采樣點(diǎn)水平高度為13 m，采樣口位置距樓頂?shù)孛婕s1.5 m。該采樣點(diǎn)周圍開闊，無高大建筑物阻擋，緊鄰交通要道，周圍存在建筑施工工地及較多工廠，取樣可用于評(píng)價(jià)鄭州市高新區(qū)大氣局部污染現(xiàn)狀。采用TE-6070D大流量顆粒物采樣器(Tisch Environment公司，美國)，顆粒物收集在石英濾膜(2500 QAT-UP 8×10)(美國PALL公司)，采樣時(shí)空氣流量為1.13 m3/min，采樣時(shí)間為2013年12月，連續(xù)采樣15 d，采集樣品14份，每 d連續(xù)采樣23.5 h，陰雨、大風(fēng)等極端天氣不采樣。采樣前每張濾膜編號(hào)，放入馬弗爐中450 ℃烘烤1 h，稍冷卻后立即放入干燥缸中，過夜后用電子天平稱重，放入干燥缸中采樣時(shí)用。采樣后將濾膜放置在恒溫恒濕超凈室內(nèi)平衡大于48 h，稱重后將采樣膜裝入鋁箔紙袋內(nèi)，放在-20 ℃冰箱避光保存。

1.4樣品不同成分提取及溶液配制PM2.5不同成分提取及溶液配制：用圓形銃子將采樣膜截取成直徑為37.2 mm的小膜，稱重后浸入超純水中，0 ℃超聲振蕩30 min×3次，將濾膜上的顆粒物洗脫下來獲得混懸液。用6層無菌紗布過濾震蕩液中的紙漿，13 000 r/min離心20 min，提取上清液，將上清液通過3層0.22 μm濾膜過濾后真空冷凍干燥，取得PM2.5水溶成分干粉；收集底層顆粒物，真空冷凍干燥，取得PM2.5非水溶成分干粉，均保存于-20 ℃冰箱備用。臨用前，稱取一定量的樣品，用無菌PBS溶液配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，超聲振蕩30 min混勻，高壓蒸汽滅菌后保存于4 ℃冰箱備用。臨用前超聲振蕩混勻，并用完全培養(yǎng)基配制成不同濃度的染毒液。

1.5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，將A549細(xì)胞懸液稀釋至5×104mL-1，按100 μL/孔將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于96孔板上，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。分別加入各濃度的PM2.5水溶性成分和非水溶性成分培養(yǎng)基100 μL，使其終濃度為50、100、200、400和800 mg/L。每組均設(shè)5個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(無血清培養(yǎng)基、CCK-8)，對(duì)照孔(細(xì)胞、最大濃度的藥物溶解介質(zhì)、無血清培養(yǎng)基、CCK-8)。繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48和72 h。染毒結(jié)束后，先棄去原培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗1遍，隨后每孔加入含CCK-8的新鮮無血清培養(yǎng)基100 μL，孵育1 h終止培養(yǎng)。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm波長下各組細(xì)胞的吸光(A)值，記錄所得數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值)/(對(duì)照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%。

1.6微核試驗(yàn)A549細(xì)胞消化后接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，每孔分別加入各濃度的PM2.5水溶性成分和非水溶性成分培養(yǎng)基2 mL，參照CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇細(xì)胞存活率在(55±5)%以上的染毒劑量和時(shí)間，每組設(shè)定3個(gè)平行孔。染毒結(jié)束后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，以0.075 mol/L KCl低滲處理，固定、氣干法制片及Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下(×400)，每張片子觀察1 000個(gè)胞體完整、已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并記錄細(xì)胞微核數(shù)，結(jié)果以微核率(‰)表示，每個(gè)劑量滴4張玻片。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0分析。不同濃度PM2.5作用不同時(shí)間后A549細(xì)胞存活率的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，不同濃度PM2.5作用后A549細(xì)胞微核率的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，相同濃度非水溶和水溶性PM2.5作用后A549細(xì)胞微核率的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1PM2.5不同成分對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性PM2.5非水溶性成分對(duì)A549細(xì)胞存活率影響的結(jié)果見表1。由表1可知，分別以50、100、200、400、800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行染毒，在相同染毒時(shí)間下，細(xì)胞存活率隨著染毒濃度的增加呈下降趨勢(shì)。由于48 h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，未進(jìn)行A值的測(cè)量。在相同染毒時(shí)間下，0與50 mg/L染毒濃度，細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)染毒濃度≥100 mg/L，細(xì)胞存活率下降。在相同染毒濃度條件下，不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。濃度與時(shí)間交互作用下，染毒24 h 時(shí)800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分作用下，細(xì)胞存活率最低。

PM2.5水溶性成分對(duì)A549細(xì)胞存活率影響的結(jié)果見表2。由表2可知，分別以50、100、200、400、800 mg/L濃度的大氣PM2.5水溶性成分對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行染毒，在相同染毒時(shí)間下，0與50 mg/L染毒濃度，細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)染毒濃度≥100 mg/L，細(xì)胞存活率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在相同染毒濃度下，不同時(shí)間的細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。濃度與時(shí)間交互作用下，染毒48 h 時(shí)800 mg/L的大氣PM2.5非水溶性成分作用下，細(xì)胞存活率最低。

表1　不同濃度PM2.5非水溶性成分作用不同時(shí)間后A549細(xì)胞的存活率　%

F組間=639.632,F時(shí)間=80.295,F交互=8.168,P均<0.001；*:與對(duì)照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。

表2　暴露于不同濃度PM2.5水溶性成分作用不同時(shí)間A549細(xì)胞的存活率結(jié)果　%

F組間=186.370,F時(shí)間=315.456,F交互=49.974,P均<0.001；*:與對(duì)照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。

2.2PM2.5對(duì)A549細(xì)胞染色體的損傷作用結(jié)果見圖1。光學(xué)顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞呈圓形，分布均勻、密度適中，胞核和胞質(zhì)染色清晰，核漿分明、透明度好。對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)微核較少(圖1A)；隨著染毒濃度的增加，微核細(xì)胞增多(圖1B)。隨著PM2.5濃度的增加時(shí)，大氣PM2.5非水溶成分和較高濃度水溶成分(≥200 mg/L)均可使A549細(xì)胞微核率顯著增高，對(duì)細(xì)胞染色體產(chǎn)生損傷，各濃度組間微核率與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中相同PM2.5濃度非水溶成分細(xì)胞微核率大于水溶成分(表3)。

A：正常細(xì)胞；B：PM2.5處理后細(xì)胞。圖1　A549細(xì)胞的微核形態(tài)(×400)

表3　不同濃度PM2.5處理后對(duì)A549細(xì)胞微核率的影響　‰

3討論

PM2.5的來源及其在大氣中存留時(shí)間不同，其構(gòu)成成分、直徑大小和濃度也不同。雖然PM2.5只是地球大氣成分中含量很少的組分，但它對(duì)空氣質(zhì)量和能見度等有重要的影響，已成為當(dāng)今研究的重點(diǎn)。與較大的大氣顆粒物相比，PM2.5直徑小，表面積大，活性強(qiáng)，易附帶大量空氣中有毒、有害物質(zhì)(例如，重金屬、微生物等)，且在大氣中的停留時(shí)間長、輸送距離遠(yuǎn)，還可以隨著人的呼吸進(jìn)人體內(nèi)，PM2.5易避開氣管細(xì)胞纖毛等的過濾進(jìn)入下呼吸道，可到達(dá)支氣管，直達(dá)肺泡，有可能越過人體的血?dú)馄琳?，在肺泡里擴(kuò)散、沉積，長期作用可使局部支氣管的通氣功能下降，細(xì)支氣管和肺泡的換氣功能喪失，而人體的生理結(jié)構(gòu)又決定了對(duì)PM2.5幾乎沒有任何過濾、阻攔能力，因此導(dǎo)致PM2.5可以隨著人的呼吸進(jìn)入人體，從而引發(fā)心肺功能障礙等有關(guān)的疾病，同時(shí)這些細(xì)顆粒物中所含的有害氣體、重金屬等溶解在血液中，對(duì)人體健康的傷害更大。

細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，是檢測(cè)細(xì)胞毒理學(xué)常用的手段和方法，能反映受試物的毒性大小。研究[10]顯示，PM2.5的吸附成分如多環(huán)芳烴類有機(jī)物和重金屬等對(duì)細(xì)胞存在明顯的毒性作用，但PM2.5中的非水溶成分和水溶成分對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用大小及差異，目前國內(nèi)外的研究對(duì)此很少涉及。該實(shí)驗(yàn)選用A549作為體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，同時(shí)引入大氣PM2.5的非水溶成分和水溶成分，考察其對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖損傷，結(jié)果顯示，染毒24 h及更長時(shí)間后大氣PM2.5的非水溶及水溶成分均導(dǎo)致 A549細(xì)胞活力下降。

微核試驗(yàn)是一種檢測(cè)環(huán)境污染物致細(xì)胞染色體損傷最常用且有效的方法之一，在環(huán)境物質(zhì)遺傳毒性檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用[11]。Roubicek等[12]通過體外實(shí)驗(yàn)證明大氣PM10的水溶性提取物和有機(jī)溶解提取物能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞微核的發(fā)生。魏愛麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)沙塵暴PM2.5及其有機(jī)提取物引起的遺傳損傷主要與劑量和城市有關(guān)，無機(jī)提取物處理也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。該研究結(jié)果表明，大氣PM2.5非水溶成分和較高濃度水溶成分(≥200 mg/L)均可使A549細(xì)胞微核率顯著增高，對(duì)細(xì)胞染色體產(chǎn)生損傷，各濃度間差異顯著，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外，與水溶成分相比，相同濃度的非水溶成分致細(xì)胞微核率明顯較高，可能與顆粒物對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷和有機(jī)毒性相關(guān)，這些都可能直接或者間接導(dǎo)致了其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

綜上所述，大氣PM2.5水溶性成分和非水溶性成分均可引起染色體損傷，降低A549細(xì)胞存活率。非水溶性成分細(xì)胞毒性可能強(qiáng)于水溶性成分，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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(2015-11-13收稿責(zé)任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.012

#通信作者，男，1966年10月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床，E-mail：zlgj-001@126.com

中圖分類號(hào)R563.9

關(guān)鍵詞細(xì)顆粒物；A549細(xì)胞；增殖；微核試驗(yàn)

Effects of different fractions of air particulate matter on genotoxicity in A549 cell line

LIU Xueya1),WANG Ping2),LI Jie2),LI Ping1),WEI Junhua3),GAO Yinan3),ZHANG Guojun1)

1)DepartmentofRespirationDiseases,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofToxicology,HenanInstituteofOccupationalDiseasesPreventionandControl,Zhengzhou4500523)CollegeofChemistryandMolecularEngineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsparticulate matter;A549 cell;proliferation; micronuclei test

AbstractAim: To explore the effects of different fractions of air particulate matter(PM2.5) on genotoxicity in A549 cell line,to investigate the mechanism of cytotoxic and pathogenesis induced by particulate matter, and to provide experimental basis for the health hazard assessment of PM2.5 in Henan.Methods: Water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 were collected and processed in Zhengzhou. Then divided into PM2.5 (50,100,200,400,800 mg /L) group(experimental groups) and control group. Finally the CCK-8 colorimetric method was used to measure the cytotoxicity in A549 cells after 6, 12, 24, 48 and 72 h, while micronucli test was adopted to detect the chromosome damage after 24 h.Results: Both water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 could inhibit the proliferation of A549 cells(P<0.05).And cell viability of A549 cells was the lowest after being treated by 800 mg/L PM2.5 water-insoluble fractions for 24 h,and for 800 mg/L PM2.5 water-soluble fractions treated for 48 h were lowest. Both water-insoluble fractions and water-soluble fractions of PM2.5 could induce chromosome damage of A549 cells. The micronucleus rate of experimental groups was higher than that of control groups(P<0.05). The micronucleus rate in A549 cells treated by water-soluble fractions was lower than that in A549 cells treated by water-insoluble fractions at the same concentration(P<0.05).Conclusion: PM2.5 could inhibit A549 cells proliferation, and result in chromosome damage;the water-insoluble fractions of PM2.5 may have greater effects.

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目201401005

*:與對(duì)照組比較,P<0.05；#:與其他組比較,P<0.05。