邢　衢，馬珊珊#，王欣欣，孟　楠，黃團(tuán)結(jié)，韓　康，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化微環(huán)境的優(yōu)化*

邢衢1)，馬珊珊1)#，王欣欣2)，孟楠2)，黃團(tuán)結(jié)1)，韓康1)，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

摘要目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)體外定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞的適宜條件，提高h(yuǎn)UC-MSCs的分化效率，為神經(jīng)細(xì)胞移植提供新細(xì)胞來(lái)源。方法：采用組織貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面抗原；利用經(jīng)典誘導(dǎo)(方案1)和復(fù)合誘導(dǎo)(方案2)兩種方法定向誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，并以只加培養(yǎng)基的hUC-MSCs作對(duì)照。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)元遷移蛋白(DCX)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)各組神經(jīng)分化標(biāo)記基因DCX、NSE、Mash、Ngn1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，兩種方案均能誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，開(kāi)始表達(dá)DCX和NSE；但是，與方案1相比，方案2組的細(xì)胞NSE的陽(yáng)性表達(dá)率更高(P<0.05)，各神經(jīng)分化標(biāo)記基因mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化更明顯。結(jié)論：復(fù)合誘導(dǎo)方案能有效改善神經(jīng)分化微環(huán)境，促進(jìn)hUC-MSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷易導(dǎo)致腦、脊部神經(jīng)細(xì)胞大量死亡、神經(jīng)功能永久缺失，且很難自我修復(fù)[1]。單獨(dú)或聯(lián)合其他生物材料移植干細(xì)胞均能促進(jìn)變性神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞再生，重塑神經(jīng)環(huán)路和突觸連接，恢復(fù)傳遞功能[2]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)是一類采集痛苦小、自我更新快、增殖能力強(qiáng)、無(wú)免疫排斥、無(wú)倫理爭(zhēng)議的干細(xì)胞，有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值[3]?？紤]到干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，移植向神經(jīng)分化后的MSC更為安全，探討適宜的誘導(dǎo)分化條件或微環(huán)境成為決定MSC轉(zhuǎn)歸效率的關(guān)鍵[4]。因此，該實(shí)驗(yàn)探討2種不同組分的神經(jīng)誘導(dǎo)微環(huán)境(經(jīng)典誘導(dǎo)和復(fù)合誘導(dǎo))對(duì)hUC-MSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響，并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，篩選和評(píng)價(jià)優(yōu)化方案，為細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源與主要試劑臍帶標(biāo)本來(lái)源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦志愿者，檢測(cè)傳染性相關(guān)指標(biāo)均呈陰性。研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、低糖(LG)-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(美國(guó)Gemini公司)，胰蛋白酶消化液、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、β-巰基乙醇(β-ME)、DMSO、青霉素鏈霉素混合液(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、丁基羥基茴香醚(BHA)、Forskolin 腺苷酸環(huán)化酶激活劑(美國(guó)Aladdin公司)，全反式維甲酸(美國(guó)Sigma公司)，氫化可的松(Hydrocortisone)、胰島素(Insulin)、氯化鉀、氯化鈉、HEPES、氯化鎂、氯化鈣、Glucose、Glycine(北京索萊寶科技有限公司)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、B-27添加劑(美國(guó)Gibco公司)，抗人抗體CD29-FITC、CD31-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE(美國(guó)Biolegend公司)，鼠抗DCX單抗、兔抗NSE抗體(英國(guó)Abcam公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(中國(guó)碧云天公司)，DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；引物合成由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)在生物安全柜內(nèi)，取新鮮臍帶標(biāo)本兩段，每段4 cm，用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次、去除血污、洗消干凈。剔除臍帶表面薄膜、2條動(dòng)脈和1條靜脈血管后，將沃頓膠 (WJ) 組織用生理鹽水清洗干凈，剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，分散轉(zhuǎn)移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入3 mL含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后更換培養(yǎng)基，間隔2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用胰蛋白酶消化后傳代，每間隔2 d換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察各階段細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.3hUC-MSCs細(xì)胞表面抗原檢測(cè)取P3代hUC-MSCs細(xì)胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化離心后，預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗、重懸為1×107mL-1的單細(xì)胞懸液，分別加入2 μL CD45-PE、CD44-FITC、CD90-PE、CD31-FITC、CD29-FITC單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。

1.4hUC-MSCs的神經(jīng)誘導(dǎo)分化取P3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSCs，按預(yù)處理、分化誘導(dǎo)、維持誘導(dǎo)三階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①預(yù)處理階段，使用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)1 d，加入10 μg/L bFGF繼續(xù)誘導(dǎo)1 d。②分化階段采用不同微環(huán)境誘導(dǎo)1 d。經(jīng)典誘導(dǎo)(方案1)組采用體積分?jǐn)?shù)2% DMSO、6 mmol/L β-ME、DMEM-LG；復(fù)合誘導(dǎo)(方案2)組采用體積分?jǐn)?shù)2% DMSO、200 μmol/L BHA、10 μmol/L Forskolin、0.5 μmol/L ATRA、 5 mg/L胰島素、1 μmol/L氫化可的松、25 mmol/L KCl、130 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、DMEM-LG。③維持誘導(dǎo)階段，加入含10 μg/L EGF、10 μg/L bFGF、1×B-27、2 mmol/L L-谷甘氨酸的DMEM-LG處理1 d。對(duì)照組僅添加DMEM/F-12培養(yǎng)基。所有誘導(dǎo)分化試劑均須經(jīng)0.22 μm針頭式過(guò)濾器除菌后使用。使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞神經(jīng)分化情況，并拍照記錄。

1.5免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞神經(jīng)元遷移蛋白(DCX)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)取狀態(tài)良好的P3 hUC-MSCs，按2×105/孔接種于放有無(wú)菌蓋玻片24孔板。匯聚度達(dá)50%時(shí)，按不同分化方案誘導(dǎo)完畢后，用PBS漂洗3遍，40 g/L多聚甲醛于4 ℃過(guò)夜固定。再用體積分?jǐn)?shù)0.2% Triton X-100室溫通透10 min，PBS潤(rùn)洗3次，每次10 min。然后加入體積分?jǐn)?shù)5%BSA室溫封閉30 min后，分別加入鼠抗DCX單抗(稀釋50倍使用)、兔抗NSE抗體(稀釋70倍使用)置于4 ℃孵育過(guò)夜；同時(shí)，用PBS替代一抗作陰性對(duì)照。次日用PBS漂洗3次，每次5～10 min后，各組按200 μL/孔加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG(稀釋200倍使用)室溫避光孵育1 h。最后用PBS輕柔潤(rùn)洗3次后，加入DAPI染色劑復(fù)染細(xì)胞核, 封片，上鏡觀察，計(jì)數(shù)。

1.6qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞神經(jīng)分化相關(guān)基因(DCX、NSE、Mash、Ngn1)mRNA的表達(dá)每組細(xì)胞各取5×106個(gè)細(xì)胞，以Trizol法常規(guī)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，GAPDH作為內(nèi)參，采用qRT-PCR檢測(cè)DCX、NSE、Mash、Ngn1基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)?；蛞镄蛄?、退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)分析采用比較CT法，目的基因相對(duì)表達(dá)量(RQ)=2-ΔΔCt。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　引物序列、退火溫度、片段長(zhǎng)度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各誘導(dǎo)組細(xì)胞的DCX、NSE陽(yáng)性表達(dá)率、相關(guān)基因(DCX、NSE、Mash、Ngn1)的mRNA表達(dá)量均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1hUC-MSCs的形態(tài)變化培養(yǎng)7 d后，邊緣可見(jiàn)紡錘形細(xì)胞爬出 (圖1A)；hUC-MSCs貼壁后，多呈現(xiàn)梭形或多角形，迅速增殖呈散在分布、大小不等的細(xì)胞集落(圖1B)；匯合度較高時(shí)，P3 hUC-MSCs群落呈方向性、旋渦狀聚集(圖1C)。

2.2hUC-MSCs細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)hUC-MSCs不表達(dá)CD34、CD45，表達(dá)CD29、CD44和 CD90，陽(yáng)性表達(dá)率分別為(99.90±0.10)%、(61.90±1.21)%和(100.00±0.02)%。

A:原代培養(yǎng)7 d；B:原代培養(yǎng)2周；C:P3臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。圖1　不同時(shí)期hUC-MSCs的形態(tài)變化(×100)

2.3體外誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的形態(tài)變化體外培養(yǎng)的hUC-MSCs(對(duì)照組)多為細(xì)小的梭形、致密單層，束狀、漩渦狀排列(圖2A)；采用方案1誘導(dǎo)4 d后，胞體收縮、兩極伸展，可見(jiàn)明顯的軸突結(jié)構(gòu)(圖2B)；而方案2誘導(dǎo)分化4 d后的細(xì)胞，出現(xiàn)清晰的樹(shù)突結(jié)構(gòu)，有類似于網(wǎng)狀分支的神經(jīng)細(xì)胞終結(jié)形成(圖2C)。

A:對(duì)照組；B:方案1誘導(dǎo)4 d后；C:方案2誘導(dǎo)4 d后。圖2　各組hUC-MSCs的形態(tài)變化(×200)

2.4不同誘導(dǎo)方案中DCX、NSE蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖3、表2。方案1和方案2中的hUC-MSCs經(jīng)不同神經(jīng)分化方案誘導(dǎo)4 d后，均開(kāi)始表達(dá)DCX和NSE蛋白。方案1中DCX的表達(dá)較高，說(shuō)明hUC-MSCs主要向神經(jīng)前體細(xì)胞分化；而方案2中NSE的表達(dá)更高，說(shuō)明hUC-MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化更明顯。

A:對(duì)照組；B:方案1組；C:方案2組。圖3　各組DCX(1)、NSE(2)蛋白表達(dá)的免疫熒光染色(×200)

表2　各組細(xì)胞中DCX、NSE陽(yáng)性細(xì)胞率比較　%

2.5各組細(xì)胞中神經(jīng)分化相關(guān)基因DCX、NSE、Mash1、和Ngn1 mRNA的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，方案1和方案2組細(xì)胞中神經(jīng)分化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)均有明顯升高；與方案1相比，方案2中NSE、Mash1、Ngn1 mRNA表達(dá)量上升，而DCX mRNA表達(dá)量降低，說(shuō)明hUC-MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化更明顯。

表3　各組hUC-MSCs中DCX、NSE、Mash1、Ngn1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3討論

細(xì)胞分化是一種動(dòng)態(tài)、可逆的程序性重調(diào)過(guò)程[5]。2002年，Woodbury等[6]首次將骨髓MSC誘導(dǎo)成神經(jīng)元，開(kāi)啟了干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)損傷疾病的新思路。研究[7]證明，誘導(dǎo)微環(huán)境可促進(jìn)成神經(jīng)分化基因有序表達(dá)，啟動(dòng)相關(guān)通路，并直接導(dǎo)致MSC跨系分化。

該研究成功地分離、培養(yǎng)和鑒定hUC-MSCs，并證明其在兩種體外微環(huán)境誘導(dǎo)下均能進(jìn)行神經(jīng)分化，細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)長(zhǎng)軸突結(jié)構(gòu)、局部成纖維網(wǎng)狀的類神經(jīng)樣細(xì)胞。不過(guò)與經(jīng)典誘導(dǎo)方法相比，采用“細(xì)胞因子+CAMP激活劑+激素+無(wú)機(jī)鹽緩沖體系”的復(fù)合誘導(dǎo)使hUC-MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化更明顯，其神經(jīng)元標(biāo)記物NSE的表達(dá)明顯高于神經(jīng)前體細(xì)胞DCX的表達(dá)。作者推測(cè)這與復(fù)合微環(huán)境體系不同組分的聯(lián)合效應(yīng)相關(guān)：①細(xì)胞因子bFGF可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致干細(xì)胞骨架重組、向神經(jīng)分化[8]。②Forskolin能提高腺苷酸環(huán)化酶水平，激活蛋白激酶A信號(hào)通路，誘導(dǎo)神經(jīng)樣細(xì)胞產(chǎn)生[9]。③適當(dāng)濃度胰島素或類胰島素對(duì)模擬低糖環(huán)境、維持干細(xì)胞增殖、分化十分必要[10]，此過(guò)程或伴隨mTOR信號(hào)通路的介導(dǎo)。④ATRA能阻斷Notch信號(hào)通路，上調(diào)Mash、Ngn1基因表達(dá)，動(dòng)員干細(xì)胞向神經(jīng)元樣分化[11-12]。⑤類似腦脊液的無(wú)機(jī)鹽緩沖體系的補(bǔ)充與神經(jīng)分化關(guān)系密切[13-14]。因此，復(fù)合誘導(dǎo)方案更適合hUC-MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向分化。

綜上所述，作者優(yōu)化了hUC-MSCs體外成神經(jīng)誘導(dǎo)分化的微環(huán)境條件，為細(xì)胞移植提供了新的來(lái)源。雖然證實(shí)誘導(dǎo)分化能夠表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，但還未就分化細(xì)胞的電生理活性、有無(wú)致瘤性、能否修復(fù)神經(jīng)損傷等問(wèn)題深入討論。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將結(jié)合膜片鉗技術(shù)、端粒酶活性檢測(cè)、細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步分析評(píng)價(jià)和分析。

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(2015-12-08收稿責(zé)任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.009

#通信作者:關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail:guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向:干細(xì)胞生物學(xué)特性分析，E-mail:mashanshan84@163.com

中圖分類號(hào)R394.2

關(guān)鍵詞人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)元；誘導(dǎo)分化；微環(huán)境；優(yōu)化

Optimization and evaluation of micro-environment about hUC-MSCs neural differentiation

XING Qu1)，MA Shanshan1)，WANG Xinxin2)，MENG Nan2)，HUANG Tuanjie1)，HAN Kang1)，GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordshUC-MSC;neuron;inductive differentiation;microenvironment;optimization

AbstractAim: To optimize the culture conditions for human umbilical cord mesenchymal stem cell (hUC-MSCs) and increase the differentiation efficiency.Methods: The hUC-MSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and its surface antigens were identified by flow cytometry.Classic strategy and composite strategy were used to induce the differentiation of hUC-MSCs into neurons, and the cells were randomly allocated into three groups: control group, classic strategy group(group 1) and composite strategy group(group 2). The morphology, the DCX/NSE positive cell ratio and expressions of neuronal differentiation genes DCX, NSE, Mash and Ngn1 were analyzed by microscope, immunohistochemistry and qRT-PCR after induced for 4 d in different groups, respectively.Results: Compared with control group, the group 1 and group 2 in vitro could both induce the neural differentiation of hUC-MSCs, and the expressions of neuronal differentiation proteins DCX and NSE could be detected. Compared with group 1, composite microenvironment demonstrated a higher NSE positive ratio(P<0.05) and mRNA expressions of neural differentiation mark genes were also higher(P<0.05), leading to differentiation towards neuron-like cells more likely.Conclusion: The composite strategy could significantly improve neural differentiation microenvironment, promote hUC-MSCs differentiation towards neuron-like cells.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81471306,U1404313；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃154200510008；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃15IRTSTHN022；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目142107000008

*:與對(duì)照組相比，P<0.05;#:與方案1組相比，P<0.05。

*:與對(duì)照組相比，P<0.05;#:與方案1組相比,P<0.05。