郎麗翔,辛雅萍,豐樹煥,張?zhí)K河,付艷芹

鄭州大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

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妊娠期糖尿病大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達*

郎麗翔,辛雅萍,豐樹煥,張?zhí)K河,付艷芹#

鄭州大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

摘要目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)、Caspase-12與妊娠期糖尿病(GDM)的關(guān)系。方法：60只健康雌性SD大鼠隨機分為4組：高脂高糖飲食受孕組(HP)、高脂高糖飲食未孕組(HV)、普通飲食受孕組(NP)、普通飲食未孕組(NV)，分別給予相應(yīng)處理。測定妊娠末期空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、血脂，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，采用HE染色觀察胰腺組織形態(tài)學改變，TUNEL法檢測胰島細胞凋亡指數(shù)(AI)，免疫組化法測定GRP78表達，Western blot法測定TRAF2、Caspase-12蛋白表達。結(jié)果：妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂升高，二者具有協(xié)同作用(P<0.05)。妊娠第21天時，HP組胰島出現(xiàn)不同程度萎縮，細胞數(shù)量明顯減少，可見核固縮和核裂解；妊娠、高脂高糖飲食均可導(dǎo)致大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12表達升高，并且二者具有協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論：妊娠和高脂高糖飲食均參與了ERS，ERS可能通過TRAF2-Caspase-12信號通路誘導(dǎo)胰島細胞凋亡,繼而參與GDM的發(fā)生發(fā)展。

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)，即妊娠期間發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常，可導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。胰島β細胞數(shù)量減少，隨之引起胰島素分泌功能缺陷，是各種類型糖尿病的共同病理特征，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是引起胰島β細胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。 GRP78蛋白在ERS發(fā)生時表達上調(diào)，被認為是ERS的特異性標志物之一[2]。Caspase-12是Caspase家族成員之一，是介導(dǎo)細胞凋亡的一個主要因子。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)與Caspase-12前體物的切割密切相關(guān)，在Caspase-12誘導(dǎo)細胞凋亡的過程中起重要作用[3]。目前有關(guān)GDM中TRAF2、Caspase-12與胰島細胞功能缺陷的關(guān)聯(lián)性研究較少。作者建立了一種GDM大鼠模型，通過分析其胰島細胞凋亡程度及胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達，探討ERS引起胰島細胞凋亡的可能機制。

1材料與方法

1.1材料健康雌性SD大鼠60只[平均周齡4周，體重(105.84±9.94) g]，普通飼料、高脂高糖飼料均購自河南省實驗動物中心。血糖、血脂測定采用奧林帕斯全自動生化儀。胰島素放射免疫法測定試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。β-actin抗體、兔抗鼠TRAF2抗體、兔抗鼠Caspase-12抗體均購自Santa Cruz公司，二抗購自Zymed公司。

1.3實驗分組所有實驗大鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(標記為T1)，然后隨機分為4組(每組15只)：高脂高糖飲食受孕組(HP)、高脂高糖飲食未孕組(HV)、普通飲食受孕組(NP)、普通飲食未孕組(NV)，尾靜脈采血測定空腹血糖(FBG)。之后，HP、HV組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，NP、NV組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，6周后(標記為T2)測定FBG。然后，HP和NP組雌鼠受孕，按1.2操作。

1.4檢測指標

1.4.1血糖、血胰島素及血脂檢測妊娠第21天(即妊娠末期)，測定各組大鼠FBG，空腹胰島素(FINS)，血脂[總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)]，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

1.4.2胰腺組織HE染色所有雌性大鼠隔夜禁食12 h后，水合氯醛腹腔麻醉后，尾靜脈注射空氣3 mL處死動物，快速分離胰腺組織。取部分置于體積分數(shù)4%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察胰腺組織的形態(tài)學變化。

1.4.3TUNEL法檢測胰島細胞凋亡指數(shù)取部分胰腺組織，嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作。光鏡下觀察，細胞核深棕色著色為凋亡細胞。每只動物隨機選取不連續(xù)的3張切片，每張切片選取5個陽性細胞數(shù)最多的高倍視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.4.4免疫組化法檢測胰腺組織中GRP78蛋白的表達胰腺組織切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS洗滌3次，高溫高壓抗原修復(fù)5 min，自然冷卻后PBS洗滌，用二抗封閉，滴加一抗50 μL，室溫孵育1 h；滴加二抗50 μL，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明及封片。光鏡下觀察，細胞質(zhì)呈棕黃色染色為陽性細胞。應(yīng)用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行平均光密度分析，計算GRP78蛋白的相對表達量。

1.4.5Western blot法檢測TRAF2、 Caspase-12蛋白的表達胰腺組織切塊并稱重，按每20 mg組織加100～200 μL蛋白裂解液的比例在冰水中勻漿裂解，14 000×g離心5 min，取上清。BCA法初步測定蛋白濃度。取約30 μg蛋白進行SDS-PAGE，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃一抗孵育過夜，37 ℃二抗孵育45 min，ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參。將膠片掃描后用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。

1.5統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析。HOMA-IR呈非正態(tài)分布，對其進行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再行分析。采用2×2析因設(shè)計的方差分析對妊娠和高脂高糖飲食對大鼠血糖、胰島素、血脂的影響，以及對胰腺組織中AI、GRP78、TRAF2和Caspase-12蛋白表達的影響進行分析，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.14組大鼠不同時期血糖值的比較4組大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，F(xiàn)BG差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周可使大鼠FBG顯著增高(表1)。

表1　4組大鼠飼養(yǎng)不同時期FBG的比較(n=15)　mmol/L

2.2妊娠末期4組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂的比較見表2。妊娠第21天時，妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂升高，二者具有協(xié)同作用。

表2　4組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂的比較(n=15)

2.34組大鼠胰腺組織形態(tài)學表現(xiàn)NV組胰島形態(tài)規(guī)則，細胞排列整齊，大小一致，胞質(zhì)豐富，胞核多為圓形，核染色質(zhì)清晰；NP組和HV組胰島形態(tài)尚規(guī)則，有少許出血發(fā)生，細胞數(shù)目減少，可見少許空泡變性發(fā)生；HP組胰島形態(tài)欠規(guī)則，出現(xiàn)不同程度的萎縮，細胞排列紊亂且數(shù)量明顯減少，部分細胞呈空泡變性，出現(xiàn)核固縮和裂解，可見以淋巴細胞、單核細胞為主體的炎癥細胞浸潤(圖1)。

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖1　4組大鼠胰腺組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×400)

2.44組大鼠胰島細胞AI的比較見圖2、表3。妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠胰島細胞AI升高，但二者沒有協(xié)同作用。

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖2　4組大鼠胰島細胞凋亡的檢測(TUNEL,×400)

2.54組大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12表達的比較見圖3、圖4和表3。由表3可知，妊娠、高脂高糖飲食均可導(dǎo)致大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達升高，并且二者具有協(xié)同作用。

圖3　4組大鼠胰腺組織中TRAF2、Caspase-12蛋白的表達

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖4　4組大鼠胰腺組織中GRP78蛋白的表達(SP,×400)

組別AI/%GRP78TRAF2Caspase-12NV3.62±0.360.087±0.0110.14±0.010.14±0.02NP8.33±0.490.209±0.0070.36±0.020.48±0.03HV11.38±0.630.329±0.0220.28±0.020.21±0.02HP18.86±0.740.565±0.0210.79±0.040.84±0.04F妊娠(P)19.582(<0.001)811.498(<0.001)1309.910(<0.001)396.636(<0.001)F高脂高糖飲食(P)84.796(<0.001)2281.688(<0.001)2100.921(<0.001)1893.868(<0.001)F交互(P)0.016(0.900)82.259(<0.001)370.225(<0.001)167.787(<0.001)

3討論

細胞凋亡是多細胞生物體內(nèi)細胞自我破壞的程序性過程。胰島細胞凋亡過多導(dǎo)致胰島細胞數(shù)量減少，是造成胰島細胞功能缺陷的一個主要原因。目前研究[5]認為，胰島素抵抗與胰島β細胞功能缺陷是GDM的主要發(fā)病機制。作者通過高脂高糖飲食誘導(dǎo)和妊娠建立GDM大鼠模型，結(jié)果顯示妊娠末期HP組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、血脂均明顯升高，符合GDM的病理特點[6]，提示GDM大鼠模型建立成功。HP組大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果顯示胰島不同程度萎縮，細胞數(shù)量明顯減少且排列紊亂，出現(xiàn)細胞核固縮和裂解，而NV組胰島細胞形態(tài)規(guī)則且數(shù)目較多，提示HP組胰島細胞凋亡增加，與李佳[7]的研究結(jié)果一致。

目前認為，觸發(fā)細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑大致分為3種：死亡受體途徑、線粒體途徑和ERS途徑。ERS是指由于各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的一種病理狀態(tài)[8]。研究[9-10]表明，ERS在各種類型糖尿病胰島細胞凋亡過程中起重要作用。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)，是熱休克蛋白70家族的成員之一，它是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，能使錯誤折疊的蛋白質(zhì)恢復(fù)正確構(gòu)象或促進其降解，是細胞自我保護的一種機制。GRP78參與前體蛋白轉(zhuǎn)運及其折疊、組裝和運輸，包括錯誤折疊和組裝蛋白質(zhì)的輸出及相光降解，調(diào)節(jié)與ERS相關(guān)的3條主要信號通路(PERK、IRE-1、ATF-6)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的諸多生物學過程[11-12]。

Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)一側(cè)，是介導(dǎo)ERS誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化[13]。Nakagawa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-12基因敲除的細胞能夠抵抗ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡，而將激活的Caspase-12導(dǎo)入細胞則會促使細胞凋亡。曹延萍等[15]研究發(fā)現(xiàn)ERS特有凋亡途徑Caspase-12參與了糖尿病腎病足細胞的凋亡。TRAF2是一種細胞內(nèi)信號接頭分子，在非應(yīng)激細胞中，TRAF2可與Caspase-12前體蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，發(fā)生ERS時，TRAF2與Caspase-12前體蛋白分離，引起Caspase-12活化。

該研究結(jié)果顯示，高脂高糖飲食和妊娠均可使大鼠血糖血脂及FINS和HOMA-IR增高；同時二者可使胰島細胞AI增加，可促使胰腺組織中GRP78蛋白和TRAF2、Caspase-12蛋白表達增加，說明妊娠、高脂高糖飲食均參與了ERS，二者交互作用，很可能通過增加ERS誘導(dǎo)的胰島細胞凋亡共同促進GDM的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，高脂高糖飲食和妊娠可參與ERS，ERS可能通過TRAF2-Caspase-12信號通路誘導(dǎo)胰島細胞凋亡繼而參與GDM的發(fā)生發(fā)展。推測可以通過干擾TRAF2-Caspase-12信號通路或ERS細胞凋亡不同環(huán)節(jié)減少胰島細胞凋亡，從而保護胰島功能，延緩GDM的發(fā)展，這將為臨床治療GDM提供全新的思路。

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(2015-10-22收稿責任編輯王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.006

#通信作者，女，1976年9月生，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的防治，E-mail：fyq338916@163.com

中圖分類號R587.1

關(guān)鍵詞妊娠期糖尿病；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；GRP78；TRAF2；Caspase-12；大鼠

Detection of expressions of GRP78,TRAF2,and Caspase-12 in pancreatic tissue of gestational diabetes mellitus rats

LANG Lixiang，XIN Yaping，F(xiàn)ENG Shuhuan，ZHANG Suhe，F(xiàn)U Yanqin

DepartmentofEndocrinology，theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

Key wordsgestational diabetes mellitus;endoplasmic reticulum stress;apoptosis;GRP78;TNF receptor-associated factor 2;Caspase-12;rat

AbstractAim: To investigate the relationship of endoplasmic reticulum stress,TRAF2,Caspase-12 and the gestational diabetes mellitus(GDM)．Methods: A total of 60 healthy female SD rats were randomly allocated into four groups: pregnant group with high fat and sugar diet(HP),virgin group with high fat and sugar diet(HV),pregnant group with normal diet(NP),virgin group with normal diet(NV)．Fasting blood glucose(FBG),fasting serum insulin(FINS),and blood lipid of each group were tested in the late pregnancy, then the insulin resistance index(HOMA-IR) was calculated.The morpholog ical changes in pancreatic tissue were observed using HE staining，the apoptosis of islet cells was detected by TUNEL，and the expression of GRP78 was tested by immunohistochemistry， the expressions of TRAF2 and Caspase-12 were tested by Western blot. Results: Pregnancy and high fat and sugar diet could increase FBG,FINS,HOMA-IR,blood lipid synergistically(P<0.05).At the 21st day during pregnancy, pancreatic tissue appeared different degree of atrophy,islet cells decreased significantly，pyknosis and karyorrhexis could be seen in HP group. Pregnancy, high fat and high sugar diet were the main factors for increasing the GRP78, TRAF2, Caspase-12 expressions in rat pancreatic tissue, and they had synergistic effect(P<0.05). Conclusion: Pregnancy and high fat and sugar diet are involved in ERS;ERS might be involved in the development of GDM through inducing islet cell apoptosis by TRAF2-Caspase-12 signaling pathway.

*河南省醫(yī)學科技攻關(guān)計劃項目201403091