李永紅，周方方，付路平，馮利菲,劉宏民#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心 鄭州 450001

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RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定酶法合成阿莫西林工藝中的原料、中間體和產(chǎn)物的含量*

李永紅1,2)，周方方1,2)，付路平1,2)，馮利菲1,2),劉宏民1,2)#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)新藥研究開(kāi)發(fā)中心 鄭州 450001

摘要目的：建立同時(shí)測(cè)定酶法合成阿莫西林反應(yīng)體系中原料、中間體和產(chǎn)物含量的反相高效液相分析方法。方法：以 Gemini-NX-C18為固定相；甲醇0.05 mol/L、pH 5.6的磷酸鹽緩沖液(V?V)為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：6-氨基青霉烷酸、D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯、D-對(duì)羥基苯甘氨酸、阿莫西林在各自的線性條件內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限分別為4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確靈敏，適合同時(shí)測(cè)定酶法合成阿莫西林反應(yīng)體系中原料、中間體和產(chǎn)物的含量。

阿莫西林(AMO)具有高效廣譜抗菌作用,而且不良反應(yīng)很少， WHO推薦其作為首選的β-內(nèi)酰胺類口服抗生素。工業(yè)上生產(chǎn)AMO通常用化學(xué)方法，步驟繁瑣，條件苛刻，而且污染嚴(yán)重。隨著人類環(huán)保意識(shí)逐漸增強(qiáng)，酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素已經(jīng)變得越來(lái)越受人關(guān)注[1]。目前，酶法合成AMO工藝已經(jīng)比較成熟，轉(zhuǎn)化率也較高[2-4]。 采用一鍋法[5-6]，6-氨基青霉烷酸(6-APA)[7]和D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯(HPGM)2種原料在青霉素?；竅8]的催化下直接生成了產(chǎn)物AMO[9]。在反應(yīng)的過(guò)程中，一部分HPGM會(huì)水解生成D-對(duì)羥基苯甘氨酸(HPG)。生成的產(chǎn)物AMO也可能發(fā)生水解反應(yīng)，水解產(chǎn)物是HPG、6-APA和甲醇，故酶促反應(yīng)體系中6-APA、HPGM、HPG、AMO 4種物質(zhì)共存。雖然有測(cè)定HPG[10]、6-APA[11]和AMO[12-13]的HPLC方法，但是未見(jiàn)到用RP-HPLC法同時(shí)檢測(cè)這4種物質(zhì)含量的報(bào)道，作者對(duì)此進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑1200 HPLC儀、紫外檢測(cè)器(安捷倫科技有限公司)，Gemini-NX-C18型色譜柱(廣州菲羅門科技有限公司)，HYG-Ⅱa 型自動(dòng)搖瓶柜(上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，雷磁pHS-3C型酸度計(jì)(濟(jì)南東儀實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，青霉素?；?湖南福來(lái)格生物有限公司)，HPGM(純度97%，Ark Pharm Inc公司產(chǎn)品)，6-APA、HPG(純度99.4%)及AMO(純度85.8%)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及RP-HPLC測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：分別精確稱取相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，嚴(yán)格用相應(yīng)的流動(dòng)相溶解，配制成一系列的儲(chǔ)備液。各儲(chǔ)備液經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后，分別配制成單標(biāo)溶液用于定性分析。再分別精密稱取相應(yīng)的對(duì)照品，配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及回收率等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

樣品的制備：在28 ℃、180 r/min條件下加入相應(yīng)的青霉素酰化酶和異辛醇，1 h后酶充分分散。采用一鍋法加入HPGM和6-APA，反應(yīng)11 h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用相應(yīng)的流動(dòng)相溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用RP-HPLC法檢測(cè)體系中各物質(zhì)的含量[14]。

根據(jù)6-APA和HPGM的分子結(jié)構(gòu)、解離常數(shù)，HPGM易水解等性質(zhì)，pH值對(duì)6-APA和HPGM的分離影響最大，以這2種化合物為主要研究對(duì)象，選擇3種不同pH值(5.0、5.6、6.0)的流動(dòng)相對(duì)同一樣品分別進(jìn)行測(cè)定[15-16]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

分別配制濃度為0.02、0.05和1.00 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，依次進(jìn)樣，以塔板數(shù)、對(duì)稱因子、分離度為主要指標(biāo)進(jìn)行篩選。

由于6-APA和AMO 2種化合物的保留時(shí)間很接近，故選用不同的流動(dòng)相配比使這2種化合物的分離度達(dá)到中國(guó)藥典要求。選擇甲醇和0.05 mol/L、pH值為5.6的磷酸鹽緩沖液做流動(dòng)相，采用不同的流動(dòng)相比例，對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳的流動(dòng)相比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

分別設(shè)置柱溫箱的溫度為25、30、35和40 ℃，依次進(jìn)樣，以塔板數(shù)、對(duì)稱因子、分離度為主要指標(biāo)進(jìn)行篩選。

取不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC色譜圖峰面積對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸和檢測(cè)限分析。

在酶法合成AMO反應(yīng)體系中加入一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法處理后進(jìn)行加樣回收率分析。

2結(jié)果

2.1磷酸鹽緩沖溶液pH值的確定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，當(dāng)pH值為5.6時(shí)，分離完全。因此流動(dòng)相的pH值確定為5.6。

表1　流動(dòng)相pH值對(duì)保留時(shí)間的影響(n=5)　min

2.2磷酸鹽緩沖溶液濃度的確定對(duì)不同濃度梯度的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，最終確定最適宜的流動(dòng)相濃度為0.05 mol/L。

表2　流動(dòng)相配比對(duì)分離度的影響(n=5)

2.4溫度的確定對(duì)不同的柱溫箱溫度進(jìn)行進(jìn)樣分析，最終確定柱溫箱的溫度為30 ℃。

2.5色譜圖以上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，4種化合物在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。6-APA、HPGM、HPG、AMO的最低檢測(cè)限分別為4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。

從左至右依次為化合物HPG、6-APA、AMO及HPGM的色譜峰。圖1　轉(zhuǎn)化液的色譜圖

化合物線性方程6-APAY=2.6683X+0.026670HPGMY=15.664X-12.337HPGY=71.687X-90.802AMOY=14.280X+5.6919

2.7加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表4。6-APA、HPGM、HPG、AMO的平均回收率分別為99.77%、99.47%、99.97%、98.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.32%、1.49%、1.72%、1.31%。4種化合物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在誤差范圍內(nèi)，結(jié)果可信。

表4　加樣回收率結(jié)果

3討論

作者利用此分析方法已經(jīng)對(duì)酶法合成AMO的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要包括酶解時(shí)間、溫度、酸堿度及底物濃度等條件。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化效率提高了80%，成本大大降低。

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(2015-10-14收稿責(zé)任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.005

#通信作者，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)及糖化學(xué)，E-mail：liuhm@zzu.edu.cn

中圖分類號(hào)TQ460.7

關(guān)鍵詞阿莫西林；中間體；反相高效液相色譜法；酶法合成

Simultaneous determination of content of raw materials，intermediates， and products in process of enzymatic synthesis of amoxicillin by RP-HPLC

LI Yonghong1,2),ZHOU Fangfang1,2),FU Luping1,2)，F(xiàn)ENG Lifei1,2),LIU Hongmin1,2)

1)DepartmentofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Key wordsamoxicillin;intermediate;RP-HPLC;enzymatic synthesis

AbstractAim: To establish a RP-HPLC method to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.Methods: The determination was performed on a Gemini-NX-C18 column with a 90 mixture of methanol and phosphate buffer solution(0.05 mol/L, pH 5.6) as mobile phase, 1.0 mL/min as flow rate, 230 nm as determination wavelength, and 10 μL as injection volume with column temperature of 30 ℃.Results: The content of 6-APA, HPGM, HPG, and amoxicillin had good linear relationship in certain range and the limits of the detection were 4.00, 1.00, 0.04, and 1.00 mg/L, respectively. Conclusion: The method is accurate, sensitive and suitable to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目21402178