韓　康，馬珊珊，朱相展，孟　楠，王欣欣，邢　衢，黃團(tuán)結(jié)，韓　莉，石振慶，楊　波，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

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慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾下調(diào)p16的表達(dá)對(duì)hUC-MSCs衰老的影響*

韓康1)，馬珊珊1)，朱相展1)，孟楠2)，王欣欣2)，邢衢1)，黃團(tuán)結(jié)1)，韓莉2)，石振慶1)，楊波2)，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

摘要目的：利用慢病毒(LV)介導(dǎo)的RNA干擾下調(diào)老齡人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)中p16基因的表達(dá)，研究p16表達(dá)下調(diào)與hUC-MSCs衰老的關(guān)系。方法：實(shí)驗(yàn)分為第3代(P3)hUC-MSCs組(P3組)、P15 hUC-MSCs組(P15組)、LV-sip16感染P15 hUC-MSCs組(LV-sip16組)和LV-NC感染P15 hUC-MSCs組(空病毒組)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，β-半乳糖苷酶染色計(jì)算衰老細(xì)胞率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡，qRT-PCR檢測(cè)衰老相關(guān)基因p16、p21、p53、pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：LV-sip16感染能促進(jìn)P15 hUC-MSCs增殖，降低衰老細(xì)胞率，促使細(xì)胞周期進(jìn)入S期，抑制hUC-MSCs的早期凋亡(P均<0.05)；同時(shí)，LV-sip16組細(xì)胞中p16、p21、p53 mRNA表達(dá)量較P15組降低，而pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)量升高(P均<0.05)。結(jié)論：下調(diào)P15 hUC-MSCs中p16基因的表達(dá)能夠延緩和改善hUC-MSCs的衰老。

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞經(jīng)歷一定次數(shù)的有絲分裂后，永久性地進(jìn)入生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)[1]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)雖然是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞，但是隨著傳代次數(shù)的增加，其功能也會(huì)逐漸衰退[2]。所以，現(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要采用第3～5代的hUC-MSCs進(jìn)行移植，而有限的細(xì)胞來(lái)源和數(shù)量極大地限制了hUC-MSCs的使用。p16基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，同時(shí)還是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控基因[3]，課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，p16基因過(guò)表達(dá)可促使293細(xì)胞發(fā)生衰老。該研究以p16基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，以慢病毒(LV)為載體，利用RNAi技術(shù)[5]下調(diào)第15代(P15)hUC-MSCs中p16基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察p16基因表達(dá)下調(diào)對(duì)hUC-MSCs衰老的影響，并初步探討其機(jī)制，為提高干細(xì)胞移植治療臨床疾病的效果奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gemini公司，CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和SA-β-半乳糖苷酶衰老檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，兔抗人P16抗體、山羊抗兔HRP抗體購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。hUC-MSCs和293細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期凍存的細(xì)胞。

1.2靶向p16基因的siRNA的篩選和LV載體的構(gòu)建根據(jù)Genbank提供的p16 mRNA序列，選用上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成的2個(gè)p16 siRNA序列(表1)。利用LipofectamineTM2000分別將siRNA1、siRNA2和NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(CON組)和轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞中只加LipofectamineTM2000(Lip2000組)為對(duì)照。轉(zhuǎn)染結(jié)束后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取60 μg總蛋白，采用Western blot檢測(cè)P16蛋白的表達(dá)，采用qRT-PCR檢測(cè)p16 mRNA的表達(dá)。將篩選出的siRNA片段送至上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建LV穩(wěn)定表達(dá)載體，包裝獲得含有p16 siRNA的慢病毒(LV-sip16)和陰性對(duì)照病毒(LV-NC)。

表1　p16 siRNA 和NC片段序列

1.3細(xì)胞分組和LV感染實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：P3 hUC-MSCs組(P3組)、P15 hUC-MSCs組(P15組)、LV-NC感染P15 hUC-MSCs組(空病毒組)、LV-sip16感染P15 hUC-MSCs組(LV-sip16組)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)篩選，在MOI=10(病毒濃度為107數(shù)量級(jí))、Enis處理?xiàng)l件下感染效率最高。按照比例擴(kuò)大原則將hUC-MSCs接種于6孔板中，細(xì)胞40%融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行病毒感染，取2.5 μL病毒原液(1×108TU/mL)和8.4 μL LV-sip16原液(4×107TU/mL)，分別加到1 mL Enis中混勻，逐滴加到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h，然后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基，感染3～4 d后，觀察熒光表達(dá)情況。待融合狀態(tài)達(dá)90%進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞分組處理同1.3，將4組細(xì)胞以每孔2 000個(gè)的數(shù)量接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，選擇第1、2、3、4、5天為節(jié)點(diǎn)測(cè)4組細(xì)胞的吸光度，然后吸除舊的培養(yǎng)基，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞分組處理同1.3，將4組生長(zhǎng)密度達(dá)90%的hUC-MSCs消化離心，加入1 mL PBS重懸離心，重復(fù)2次，吸除上清，加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇重懸細(xì)胞，固定過(guò)夜。第2天離心吸除上清，加入1 mL PBS混勻細(xì)胞，離心吸除上清，加入500 μL PI染色液，37 ℃避光溫育30 min，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6FITC染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞分組處理同1.3，將4組生長(zhǎng)密度達(dá)90%的hUC-MSCs消化離心，然后加入1 mL PBS重懸離心，重復(fù)2次，吸除上清，加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，將5 μL PI和5 μL FITC分別加入各組細(xì)胞中，室溫避光孵育15 min，然后補(bǔ)加400 μL Binding Buffer，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞的衰老細(xì)胞分組處理同1.3，采用SA-β-半乳糖苷酶衰老檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的衰老情況。光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，藍(lán)色細(xì)胞為衰老細(xì)胞。在100倍鏡下選擇細(xì)胞形態(tài)較好且相互獨(dú)立的視野拍照，計(jì)算衰老細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8qRT-PCR檢測(cè)衰老相關(guān)基因的表達(dá)細(xì)胞分組處理同1.3，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR分別檢測(cè)p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達(dá)。CyclinD1、CDK4引物序列見(jiàn)表2，其他引物序列見(jiàn)姚寧等[6]的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2　CyclinD1、CDK4引物序列

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較以上各觀測(cè)指標(biāo)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1有效p16 siRNA的篩選與CON組、Lip2000組、NC組相比，siRNA1和siRNA2組293細(xì)胞p16基因表達(dá)均降低，siRNA1處理組表達(dá)量降低更明顯，見(jiàn)表3。故用siRNA1構(gòu)建LV-sip16用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3　各組p16基因的表達(dá)情況

2.24組hUC-MSCs增殖活力的比較LV-sip16組增殖活力高于P15組，但是又低于P3組，見(jiàn)圖1。

A：P3組；B：LV-sip16組；C：P15組；D：空病毒組。圖1　4組hUC-MSCs增殖活力的比較

2.34組hUC-MSCs細(xì)胞周期和凋亡的比較相比P15組，LV-sip16組有更多的細(xì)胞進(jìn)入S期，細(xì)胞生長(zhǎng)得到促進(jìn)；而細(xì)胞凋亡受抑，見(jiàn)表4。

表4　4組細(xì)胞周期和凋亡率的比較　%

2.44組hUC-MSCs中衰老細(xì)胞率比較染色結(jié)果見(jiàn)圖2。P3組幾乎沒(méi)有藍(lán)染細(xì)胞出現(xiàn)；P3組、P15組、空病毒組和LV-sip16組衰老細(xì)胞率分別為(1.10±0.20)%、(12.10±1.35)%、(13.40±0.85)%和(8.20±1.12)%，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8 832.328，P<0.001)；P15組、空病毒組和LV-sip16組衰老細(xì)胞率均高于P3組，而LV-sip16組低于P15組。

A、B、C、D:分別為P3組、P15組、空病毒組和LV-sip16組。圖2　β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞的衰老(×100)

2.54組hUC-MSCs中衰老相關(guān)基因表達(dá)的比較與P3組相比，P15組和空病毒組p16、p53、p21 mRNA表達(dá)量升高，pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)量降低；與P15組相比，LV-sip16組p16、p53、p21 mRNA表達(dá)量降低，pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)量升高。見(jiàn)表5、6。

表5　4組hUC-MSCs中p16、p53、p21和pCNA mRNA的表達(dá)

表6　4組hUC-MSCs中sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA的表達(dá)

3討論

LV載體是以人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的載體。與腺病毒載體相比，LV載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：①能使目的基因在細(xì)胞中長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。②感染細(xì)胞范圍廣泛，能有效感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、干細(xì)胞等。③低免疫原性[7]。所以，該研究中作者采用LV介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究p16基因表達(dá)下調(diào)與hUC-MSCs衰老的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LV-sip16能促進(jìn)P15 hUC-MSCs增殖，降低衰老細(xì)胞率，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期，并且抑制hUC-MSCs的早期凋亡；與姚夢(mèng)枝[8]在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中的研究結(jié)果相一致。但是，該研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)LV-sip16只能在一定程度上改善和促進(jìn)P15 hUC-MSCs的增殖，并不能使其達(dá)到P3 hUC-MSCs的增殖活性，說(shuō)明hUC-MSCs的增殖和衰老可能并不是p16一個(gè)因素可以控制的。

細(xì)胞衰老由兩條信號(hào)通路控制，分別為 p16-CyclinD1/CDK4-Rb途徑和p53-p21-CyclinD1/CDK4-Rb途徑[9-11]。該研究發(fā)現(xiàn)LV-sip16組中p16、p21、p53 mRNA表達(dá)量降低，而pCNA、sirt1、sirt2、CyclinD1、CDK4 mRNA表達(dá)量升高，說(shuō)明兩條信號(hào)通路并不是彼此獨(dú)立的，p16表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)p16-CyclinD1/CDK4-Rb通路調(diào)控其他衰老相關(guān)基因的表達(dá)，一定程度上延緩hUC-MSCs的衰老。下一步實(shí)驗(yàn)可以阿爾茨海默鼠為衰老模型，通過(guò)移植LV-sip16感染的P15 hUC-MSCs，觀察LV-sip16對(duì)阿爾茨海默鼠的抗衰老作用并分析其機(jī)制，從而為干細(xì)胞移植治療阿爾茨海默癥提供新的思路。

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(2015-09-19收稿責(zé)任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.003

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)， E-mail:guanfangxia@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)Q291

關(guān)鍵詞siRNA；p16；慢病毒；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;衰老

Effect of lentivirus-mediated RNAi targeting p16 on aging of hUC-MSCs

HAN Kang1), MA Shanshan1), ZHU Xiangzhan1), MENG Nan2),WANG Xinxin2), XING Qu1), HUANG Tuanjie1),HAN Li2), SHI Zhenqing1), YANG Bo2), GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordssiRNA;p16;lentivirus;human umbilical cord derived mesenchymal stem cell;aging

AbstractAim: To study the effect of lentivirus(LV)-mediated RNAi targeting p16 on the aging of hUC-MSCs.Methods: There were 4 groups,the 3rd generation hUC-MSCs group(P3 group), the 15th generation hUC-MSCs group(P15 group), P15 hUC-MSCs infected by LV-sip16 group(LV-sip16 group) and P15 hUC-MSCs infected by LV-NC group(negative control group). CCK-8 assay was performed to detect cell proliferation, β-galactosidase staining was used to detect aging cells, flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis, and the expressions of p16,p21,p53,pCNA,sirt1,sirt2,CyclinD1 and CDK4 mRNA were detected by qRT-PCR.Results: LV-sip16 infection could successfully promote the proliferation of P15 hUC-MSCs, reduce aging cell rate, induce S phase cells, and inhibit the early cell apoptosis(P<0.05); meanwhile, the mRNA expressions of p16, p21, p53 were decreased, while the mRNA expressions of pCNA, sirt1, sirt2, CyclinD1 and CDK4 were increased(P<0.05).Conclusion: Downregulating the expression of p16 in P15 hUC-MSCs could delay and improve the aging of hUC-MSCs.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81471306,U1404313；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃154200510008；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃15IRTSTHN022；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目142107000008

*：與CON組、Lip2000組和NC組相比，P<0.05；#：與siRNA2組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。