陳晴　　劉洋　　張勤修　　李昕蓉

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·實驗研究·

穴位埋線調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎模型大鼠血清Th細(xì)胞因子平衡狀態(tài)的實驗研究*

陳晴1劉洋1張勤修2李昕蓉1

目的 探討穴位埋線對變應(yīng)性鼻炎實驗動物外周血清的sIgE、IL-4、IL-10、INF-γ水平的影響及其作用機(jī)制。方法用卵清蛋白（OVA）建立AR大鼠模型，實驗組大鼠穴位埋線后2周，處死動物采血，取血清送檢。用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA法）對各組大鼠外周血清sIgE、IL-4、IL-10、INF-γ變化進(jìn)行觀察。結(jié)果 ①模型組大鼠外周血清sIgE、IL-4、IL-10水平明顯升高，與空白組相比有明顯差異（P＜0.05）；INF-γ水平升高，與空白組相比沒有明顯差異（P＞0.05）。②實驗組大鼠外周血清sIgE、IL-4、IL-10水平顯著下降，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與空白組相比沒有顯著差異（P＞0.05）；INF-γ水平顯著升高，與空白組、模型組相比有顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 穴位埋線可以通過調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠血清sIgE、IL-4、IL-10和INF-γ水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2水平，改善變應(yīng)性鼻炎癥狀。

穴位埋線；變應(yīng)性鼻炎；大鼠模型；細(xì)胞因子

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由于IgE介導(dǎo)的鼻黏膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，其主要癥狀是鼻癢、流清水樣涕、鼻塞和噴嚏［1］?，F(xiàn)已有證明表示全球已有超過6億AR患者。任何國家、種族、年齡、性別的人們都可能受到AR的困擾［2］。變應(yīng)性鼻炎已是一種常見病、多發(fā)病，帶給人們生活困擾和龐大的經(jīng)濟(jì)困擾。尋求有效的治療方式迫在眉睫。穴位埋線在近年來的研究［3，4］已表明是治療變應(yīng)性鼻炎的有效、安全的方法，但其作用機(jī)制尚不明確。本實驗通過建立大鼠變應(yīng)性鼻炎的模型，以穴位埋線為干預(yù)手段，從細(xì)胞因子方面初步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

1動物來源及分組

1成都中醫(yī)藥大學(xué)（四川成都，610072）

2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科

選用清潔級（SP）SD大鼠共36只，雌雄各半，體重250～280g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，動物合格證號：Scxk（川）2013-100。飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗中心（室溫18～22℃，日溫差不超過3℃，相對濕度60%～70%，日光燈照明，12小時明暗相間，自動定時過濾通風(fēng)換氣，換氣頻度10～15次/小時）。分性別飼養(yǎng)，全價顆粒飼料及自由飲水、采食。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，利用電腦隨機(jī)序列號將36只動物隨機(jī)分為3組，即空白組、模型組和實驗組，每組12只。

2造模方法

AR大鼠模型建造采用卵清蛋白致敏法。即基礎(chǔ)致敏階段，采用卵清蛋白0.3mg（OVA，Albumin Egg，購自 Sigma公司）為抗原，氫氧化鋁 30mg（Aluminum hydroxide，成都市科龍化工試劑廠）為佐劑，加生理鹽水1ml形成混懸液。模型組和實驗組大鼠進(jìn)行腹腔注射，隔日1次，共7次。鼻腔激發(fā)階段，模型組和實驗組動物以5%卵清蛋白50uL/側(cè)滴鼻，每日1次，連續(xù)7天。致敏維持階段，即經(jīng)過激發(fā)，仍以5%卵清蛋白50uL/側(cè)滴鼻，隔日1次，直至實驗結(jié)束。空白組不做任何特殊處理。

3模型評價

根據(jù)文獻(xiàn)［5］，每次于激發(fā)后30min內(nèi)觀察大鼠癥狀，按評分系統(tǒng)計算行為學(xué)總分（＞5分為動物模型成功），評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　動物行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

4干預(yù)方法

實驗組大鼠進(jìn)行一次雙側(cè)迎香穴埋線治療。參照文獻(xiàn)［6］迎香穴的的定位為：大鼠直視時眼珠中心向下，在鼻孔兩旁約3mm處。埋線時將大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉后，用碘伏棉球消毒穴位及周圍。選用9號埋線針，自針尖方向裝入長約0.2～0.3cm的000號羊腸線。自穴位下方約0.5cm處朝向穴位快速進(jìn)針刺入，將羊腸線推入穴位。退針后棉球按壓針眼1～2min。術(shù)后隔日以碘伏棉球消毒穴位表面。

5標(biāo)本制備

實驗組動物穴位埋線14天后，以3%戊巴比妥鈉行大鼠腹腔注射麻醉，仰臥于平板，四肢稍加固定。用5號尖刀刀片將大鼠右側(cè)腹股溝處皮膚及淺筋膜打開，分離股動脈后，以組織剪剪開血管壁，用一次性采血管采血，靜置離心，取血清送檢。

6統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各組所得結(jié)果，計量資料符合正態(tài)分布時，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）進(jìn)行描述，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Pearson分析；當(dāng)不符合正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗方法。設(shè)P＜0.05時，數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

結(jié)果

1模型評估

經(jīng)觀察、評分及統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，模型組與實驗組型的大鼠均出現(xiàn)典型的AR癥狀，如噴嚏、流涕、搔抓等，但無哮喘及死鼠。且兩組大鼠平均積分為6.3，明顯高于空白組評分1.2（P＜0.01）。證實變應(yīng)性鼻炎大鼠模型建立成功。

2大鼠外周血清IL-4、IL-10、INF-γ、sIgE的水平變化

表2　大鼠外周血清IL-4、IL-10、INF-γ、sIgE水平變化

通過表2可見，三組細(xì)胞因子的組間差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），可以認(rèn)為3個處理組的細(xì)胞因子的總體均數(shù)不全相同。模型組IL-4、IL-10和sIgE的水平明顯升高，與空白組相比有明顯差異（P＜0.05）；INF-γ水平也有升高，與空白組相比沒有明顯差異（P＞0.05）。實驗組IL-4、IL-10和sIgE的水平明顯降低，與模型組相比有明顯差異（P＜0.05），與空白組相比沒有明顯差異（P＞0.05）。實驗組INF-γ水平明顯升高，與空白組、模型組相比有明顯差異（P＜0.05），見圖1。

圖1　大鼠外周血清IL-4、IL-10、INF-γ與sIgE

討論

變應(yīng)性鼻炎是IgE介導(dǎo)的慢性變態(tài)反應(yīng)炎癥性疾病，Th1和Th2細(xì)胞間免疫反應(yīng)失衡是導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的免疫學(xué)基礎(chǔ)［7，8］。Th1和Th2免疫反應(yīng)間存在著互相制衡的機(jī)制維持［9］。Th1主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ等，統(tǒng)稱Th1型細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞免疫。其中以IFN-γ為特征因子，可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。并上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1（CD54）表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞FcγR表達(dá)，協(xié)同誘導(dǎo)TNF并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物。此外，IFN-γ還可促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育和抑制TH2細(xì)胞活化與增殖。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和GM-CSF（粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子），統(tǒng)稱Th2型細(xì)胞因子，主要參與體液免疫。Th2型細(xì)胞因子在呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的免疫病因?qū)W中起重要作用。IL-4為Th2細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，一方面可以抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，另一方面促進(jìn)IgE生成和形成以IgE為基礎(chǔ)的嗜酸粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞浸潤與介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

穴位埋線療法是針灸療法的延伸和發(fā)展。有文獻(xiàn)［10］描述在穴位埋線對變應(yīng)性鼻炎的治療中，穴位區(qū)埋入異體蛋白線后，可能使人體淋巴細(xì)胞致敏，并配合體液中的巨噬細(xì)胞使其分解吸收，成為多肽、氨基酸，并產(chǎn)生多種淋巴因子，從而對疾病產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。也有文獻(xiàn)［11］報道穴位埋線利用醫(yī)用羊腸線的異體蛋白在體內(nèi)經(jīng)軟化、分解、液化、吸收的作用，對穴位產(chǎn)生生理、物理及化學(xué)刺激而獲得一種“長效針感”效應(yīng)，使機(jī)體免疫、抗過敏能力得以提高。但這些不足以解釋穴位埋線治療變應(yīng)性鼻炎的機(jī)理。本次試驗通過細(xì)胞因子方向?qū)ρㄎ宦窬€治療變應(yīng)性鼻炎的機(jī)理進(jìn)行初步探討。

本次實驗顯示，變應(yīng)性鼻炎模型組大鼠血清IL-4、IL-10、IgE水平升高，與空白組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，INF-γ水平略有升高，較空白組沒有明顯差異，表明模型組大鼠的Th2細(xì)胞水平升高，Th1/ Th2平衡被打破，與現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎患者或?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)存在Th1/Th2平衡失調(diào)［11-13］相吻合。實驗組動物經(jīng)穴位埋線治療后，血清IL-4、IL-10、IgE水平下降，與模型組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，血清INF-γ水平則明顯升高，較模型組與空白組動物均有明顯差異，體現(xiàn)了Th1細(xì)胞水平升高，抑制Th2細(xì)胞分泌，降低免疫應(yīng)答效應(yīng)，減輕變應(yīng)性鼻炎癥狀。實驗結(jié)果表明穴位埋線改善了AR動物模型中由Th2細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)，并改善了IL-4、IL-10、IgE的表達(dá)水平。由此我們推測，穴位埋線可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，緩解變應(yīng)性鼻炎癥狀。但變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病及調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，除本次試驗涉及的IL-4、IL-10等，還有其他諸多細(xì)胞因子以及神經(jīng)肽。穴位埋線如何對其他細(xì)胞因子及神經(jīng)肽進(jìn)行調(diào)節(jié)，及其相關(guān)變化規(guī)律，還需結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究完善。

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2Bousquet J，Khaltaev N，Cruz AA，Denburg J，F(xiàn)okkens WJ，Togias A，Zuberbier T，Baena-Cagnani CE，Canonica GW，van Weel C，Agache I，A？t-Khaled N，Bachert C，Blaiss MS，Bonini S，Boulet LP，Bousquet PJ，Camargos P，Carlsen KH，Chen Y，Custovic A，Dahl R，Demoly P，Douagui H，Durham SR，Gerth Van Wijk R，Kalayci O，KalinerMA，KimYY，KowalskiML，etal：Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma（ARIA）.Allergy 2008，Suppl 86：8-160.

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（收稿:2014-10-13修回：2015-02-15）

The experiment research of catgut implantation at acupoints adjust the balance of The cytokines on the rat model with allergic rhinitis

CHEN Qing，LIU Yang，ZHANG Qinxiu，LI Xinrong
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，Sichuan Province 610072，PR China

Objective To investigate the effect of catgut implantation at acupoints on sIgE IL-4，IL-10，sIgE and INF-γ，as well as its mechanism in a rat model with allergic rhinitis.Method Ovalbumin（OVA）-sensitized rats were randomly assigned into three groups.After two weeks of catgut implantation at acupoints in the experimental group，serum samples were collected.The levels of IL-4，IL-10，sIgE and INF-γ were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method.Result①Serum IL-4，IL-10 and sIgE were significantly increased in the model group in comparison with the blank group（P＜0.05）；INF-γ also increased in the model group，but without significant difference（P＞0.05）.②Serum IL-4，IL-10 and sIgE decreased significantly in experimental group in comparison with the model group（P＜0.05），but there were no significant difference compared with the blank group（P＞0.05）；INF-γ increased significantly，in comparison with the blank model group（P＞0.05）.Conclusion The catgut implantation at acupoints might improve the symptoms of allergic rhinitis by regulating the level of serum IL-4，IL-10，sIgE and INF-γ.

Catgut implantation at acupoints；Allergic rhinitis；Rat model；Cytokine

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.01.002

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.01.001

國家自然科學(xué)基金面上項目（No.81273985），高等學(xué)校博士點學(xué)科專項科研基金項目（No.20125132110011），四川省國際科技合作與交流研究計劃項目（No.2013HH0021）

張勤修，主任醫(yī)師.Email:zhqinxiu@163.com