陳雪芳 吳艷麗
(蘇州景昱醫(yī)療器械有限公司 215123)
六種菌懸液制備方法的探討
陳雪芳 吳艷麗
(蘇州景昱醫(yī)療器械有限公司 215123)
依照《中國(guó)藥典》2015年版四部標(biāo)準(zhǔn),在無菌檢查法和微生物限度檢查法等試驗(yàn)中,經(jīng)常需要接種小于100cfu的各種試驗(yàn)菌作為測(cè)試,而制備該濃度的菌懸液需要有可靠的方法,以確保制備的菌懸液能滿足試驗(yàn)所需。為了得到精確的菌懸液含菌量,特對(duì)此制備方法進(jìn)行驗(yàn)證。
制備方法;菌懸液;梯度稀釋
1.1 儀器設(shè)備
本次試驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備:生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、電子天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱等,試驗(yàn)用儀器設(shè)備經(jīng)國(guó)家計(jì)量檢測(cè)部門檢定合格,并在有效期之內(nèi)。
1.2 菌種
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003],由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,菌株代次為第2代。
1.3 稀釋劑
0.9 %無菌氯化鈉溶液。
1.4 培養(yǎng)基
胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,均由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),在使用有效期內(nèi),且已通過培養(yǎng)基適用性檢查。
2.1 接種及培養(yǎng)
(1)接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,每種試驗(yàn)菌各接種5支,用接種環(huán)分別刮取斜面培養(yǎng)物1次、2次、3次、4次、5次,并在培養(yǎng)基管作好標(biāo)記,于 30~35℃培養(yǎng) 18~24h。
(2)接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,共接種5支,用接種環(huán)分別刮取斜面培養(yǎng)物1次、2次、3次、4次、5次,并在培養(yǎng)基管作好標(biāo)記,于20~25℃培養(yǎng)24~48h。
(3)接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基斜面長(zhǎng)度應(yīng)不超過試管總長(zhǎng)度的1/2,共接種5支,用接種環(huán)分別刮取斜面培養(yǎng)物1次、2次、3次、4次、5次并在斜面劃線,作好標(biāo)記,于 20~25℃培養(yǎng) 5d。
2.2 梯度稀釋
2.2.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌培養(yǎng)物
將上述培養(yǎng)管置于規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后,在旋渦混合器上將菌液混勻,每種用無菌吸管吸取1ml菌液,用若干支含9ml的0.9%無菌氯化鈉溶液逐級(jí)梯度稀釋,稀釋至10-5、10-6、10-7、0-8梯度,每個(gè)梯度分別取2ml至2個(gè)無菌平皿中,每皿1ml。每稀釋一個(gè)梯度,必須換一個(gè)無菌吸頭,并且每個(gè)梯度菌液必須混勻。
2.2.2 黑曲霉瓊脂斜面培養(yǎng)物
加入5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。采用雙層紗布過濾菌絲的方法吸出1ml孢子懸液,用若干支裝量為9ml/支的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液逐級(jí)梯度稀釋至10-5、10-6、10-7梯度,每個(gè)梯度分別取2ml至2個(gè)無菌平皿中,每皿1ml。每稀釋一個(gè)梯度,必須換一個(gè)無菌吸頭,并且每個(gè)梯度菌液必須混勻。
2.3 菌液計(jì)數(shù)
細(xì)菌培養(yǎng)傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,于30~35℃培養(yǎng)3d。真菌培養(yǎng)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,于20~25℃培養(yǎng)5d。
2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)
在5次獨(dú)立平行試驗(yàn)中,選擇菌落數(shù)<100cfu/ml的稀釋級(jí)別作為驗(yàn)證試驗(yàn)及日常檢驗(yàn)之用。
六種菌懸液的菌液計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。
表1 六種菌懸液的菌液計(jì)數(shù)結(jié)果
4.1 結(jié)論
(1)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于30~35℃培養(yǎng)18~24h,若欲制備的<100cfu/ml的菌懸液,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌應(yīng)梯度稀釋至10-8級(jí),枯草芽孢桿菌應(yīng)梯度稀釋至10-6級(jí)。
(2)白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,于 20~25℃培養(yǎng) 24~48h,若欲制備的<100cfu/ml的菌懸液,應(yīng)梯度稀釋至10-6級(jí)。
(3)黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至10ml沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上,于20~25℃培養(yǎng)5d,若欲制備的<100cfu/ml的菌懸液,應(yīng)梯度稀釋至10-5級(jí)。
4.2 分析
若欲制備<100cfu/ml的菌懸液,不同試驗(yàn)菌的培養(yǎng)條件及稀釋梯度有所不同。從試驗(yàn)結(jié)果可知,每種菌同一梯度的每毫升含菌量與接種量沒有直接關(guān)系,即并非接種量越多,培養(yǎng)的菌數(shù)越多。因此,日常試驗(yàn)中,若需要制備<100cfu/ml的菌懸液,在接種時(shí)可不必計(jì)較于接種量,只要保證接種上菌即可進(jìn)行培養(yǎng)。
[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版.四部.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,通則1100生物檢查法.
[2]汪穗福.微生物檢測(cè)驗(yàn)證技術(shù).中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005,5.
[3]溫玉瑩,李汶,陳之敏.廣東省汕頭市藥品檢驗(yàn)所.微生物驗(yàn)證試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌菌懸液制備的探討.今日藥學(xué),2009,5,19(5).
[4]王暉,劉桂萍,王雁霞.五種菌液兩種保存方法的比較觀察.華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,23(5).
R927
A
1004-7344(2016)02-0297-01
2015-12-22