陳科全葉元土蔡春芳吳 萍黃雨薇吳 韜林秀秀羅其剛張寶彤蕭培珍，

飼料氧化魚油引起草魚腸道結(jié)構(gòu)損傷、通透性增加

陳科全1葉元土1蔡春芳1吳 萍1黃雨薇1吳 韜1林秀秀1羅其剛1張寶彤2蕭培珍1， 2

（1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘇州 215123；2. 北京營養(yǎng)源研究所， 水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放實(shí)驗(yàn)室， 北京 100000）

為了探討飼料氧化魚油對草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道組織結(jié)構(gòu)及其通透性的影響， 本實(shí)驗(yàn)以豆油、魚油及氧化魚油作為飼料脂肪源， 分別設(shè)計(jì)魚油組（6F）、豆油組（6S）、2%氧化魚油（4S2OF）、4%氧化魚油（2S4OF）及6%氧化魚油（6OF） 5組等氮、等能的半純化飼料。經(jīng)72d池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖后， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： （1）氧化魚油顯著增加（P＜0.05）草魚血清和腸道MDA含量、增加腸道GSH含量（P＜0.05）， 但隨氧化產(chǎn)物含量上升GSH含量出現(xiàn)下降。（2）氧化魚油會顯著降低腸道內(nèi)膽汁酸的含量（P＜0.05）。（3）氧化魚油會顯著增加腸道絨毛中杯狀細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05）， 且隨著氧化產(chǎn)物的增加， 腸道微絨毛高度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。（4）氧化魚油會導(dǎo)致腸道緊密連接間隙增大， 增加腸道通透性， 使血清中D-乳酸及內(nèi)毒素含量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果表明， 飼料中魚油氧化產(chǎn)物損傷了草魚腸道組織結(jié)構(gòu)， 尤其是腸道上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重， 從而破壞了腸道黏膜的機(jī)械屏障功能， 使腸道通透性顯著增加， 腸道細(xì)菌內(nèi)毒素等發(fā)生轉(zhuǎn)移。魚油氧化產(chǎn)物會引起草魚腸道氧化與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)， 干擾草魚“肝-腸”正常膽汁酸循環(huán)， 致使草魚腸道膽汁酸不足。

氧化魚油； 腸道； 結(jié)構(gòu)； 通透性； 草魚

魚油因其富含EPA、DHA等高不飽和脂肪酸對魚類具有很好的營養(yǎng)作用， 而其高含量的不飽和脂肪酸會在光照、溫度和氧氣等因素的影響下迅速被氧化產(chǎn)生過氧化物、醛、酮等氧化產(chǎn)物而對動(dòng)物體造成損害［1］， 這就是魚油對于養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物所具有的營養(yǎng)作用、氧化損傷副作用的兩面性。已有研究表明氧化魚油會對動(dòng)物體機(jī)體有損傷作用， 但大多報(bào)道都集中在對生產(chǎn)性能［2—4］和肝胰臟［5—7］的研究上， 關(guān)于氧化油脂對水產(chǎn)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)與功能研究的還不夠系統(tǒng)、深入。

草魚是中國主要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類， 在實(shí)際養(yǎng)殖中也是病害較多養(yǎng)殖魚類之一， 其中腸炎作為“草魚三大病”之一， 一直被人們所關(guān)注［8］。腸道是動(dòng)物最大的消化、吸收器官， 也是最大的免疫、防御器官和內(nèi)分泌器官。其作為動(dòng)物體消化系統(tǒng)的第一道屏障， 起著分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)， 防止致病性抗原侵入的作用［9］。近年來， 飼料物質(zhì)對腸道組織結(jié)構(gòu)和功能的影響日益受到關(guān)注， 飼料營養(yǎng)物質(zhì)在維護(hù)魚類腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能方面有重要的作用， 而飼料中潛在的有毒有害物質(zhì)如油脂的氧化產(chǎn)物也是破壞腸道結(jié)構(gòu)屏障與功能的主要因素， 并可能作為病原生物感染的原發(fā)性因素［10］。已有研究表明，油脂氧化產(chǎn)物會引起小鼠腸道應(yīng)激而導(dǎo)致腸炎［11］。因此， 本文以草魚為實(shí)驗(yàn)對象， 以豆油為對照， 研究氧化魚油對草魚腸道結(jié)構(gòu)及其通透性的影響， 期望為闡述油脂氧化產(chǎn)物對魚體腸道結(jié)構(gòu)與功能損傷作用機(jī)制及其作用方式等科學(xué)問題提供依據(jù)， 為實(shí)際生產(chǎn)中飼料油脂的選擇與質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 草魚

草魚來源于浙江一星飼料有限公司養(yǎng)殖基地，為池塘培育的1冬齡魚種， 共350尾， 平均體重為（74.82±1.49） g。草魚隨機(jī)分為5組， 每組設(shè)3重復(fù)，每重復(fù)20尾。分組剩余草魚用于養(yǎng)殖前期取樣分析。

1.2 飼料

以酪蛋白和秘魯蒸汽魚粉為主要蛋白源， 采用等氮、等能方案設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼料， 設(shè)置了6%豆油組（簡稱6S組）、6%魚油組（6F組）、4%豆油組+2%氧化魚油（4S2OF組）、2%豆油組+4%氧化魚油（2S4OF組）、6%氧化魚油組（6OF組）共5種半純化飼料， 配方及實(shí)測營養(yǎng)指標(biāo)見表 1。

表 1 實(shí)驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平Tab. 1 Formulation and proximate compositions of experiment diets （DM basis）

飼料原料粉碎過60目篩， 用絞肉機(jī)制成直徑1.5 mm的長條狀， 切成1.5 mm×2 mm的顆粒狀， 風(fēng)干。飼料置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

豆油為“福臨門”牌一級大豆油。魚油來源于廣東省良種引進(jìn)服務(wù)公司生產(chǎn)的“高美牌”精煉魚油， 氧化魚油參考［12］方法制備。分別測定3種油脂過氧化值（POV）、酸價(jià)（AV）、丙二醛（MDA）， 并計(jì)算飼料中POV、AV、MDA值（飼料中AV、POV、MDA測定尚無有效方法， 故采用油脂測定結(jié)果的計(jì)算值）（表 2）。

由表 2可知， 在本實(shí)驗(yàn)中使用的魚油有一定程度的氧化， 由于其在飼料中比例為6%， 而氧化魚油組是由氧化魚油和豆油按比例混合作為脂肪源， 所以6F組的實(shí)際POV值比4S2OF組高12.25%， 而AV值則比4S2OF和2S4OF組分別高出100%和3.9%。

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在浙江一星飼料有限公司實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。在面積為5 m×667 m （平均水深1.8 m）的池塘中設(shè)置網(wǎng)箱， 網(wǎng)箱規(guī)格為1.0 m×1.5 m×2.0 m。將各組實(shí)驗(yàn)草魚隨機(jī)分配在5組、15個(gè)網(wǎng)箱中。

分別用實(shí)驗(yàn)飼料馴化實(shí)驗(yàn)魚1周后， 開始正式投喂， 每天7：00和16：00定時(shí)投喂， 投飼率為3%—4%。每10天據(jù)投飼量估算魚體增重并調(diào)整投飼率， 記錄每天投飼量。正式實(shí)驗(yàn)共養(yǎng)殖72d。

每周測定水質(zhì)1次， 實(shí)驗(yàn)期間溶解氧濃度＞8.0 mg/L， pH 7.8—8.4， 氨氮濃度＜0.2 mg/L， 亞硝酸鹽濃度＜0.01 mg/L， 硫化物濃度＜0.05 mg/L。養(yǎng)殖期間水溫25—33℃。

表 2 實(shí)驗(yàn)飼料中POV值、AV及MDA含量分析結(jié)果Tab. 2 Peroxide value， Acid value and MDA content in diets

1.4 樣品采集及其分析方法

經(jīng)72d養(yǎng)殖、禁食24h后進(jìn)行樣品采集。

腸道組織學(xué)樣品制備及分析 每網(wǎng)箱取4尾魚、每組12尾， 于中腸前1/4處取1—2 cm腸管1段，縱向剖開用磷酸緩沖液沖洗后， 立即將其投入4%戊二醛中固定， 用于透射和掃描電鏡分析。每網(wǎng)箱另取2尾、每組6尾魚于中腸前1/4處取腸管2段置于Bouin試液固定， 用于組織學(xué)切片分析。

組織學(xué)切片采用石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)切片， 蘇木精-伊紅染色， 中性樹膠封片， 光學(xué)顯微鏡下觀察腸道組織結(jié)構(gòu)并采用Nikon COOLPIX4500型相機(jī)進(jìn)行拍照。

透射電鏡采用鋨酸固定、丙酮脫水， 最后放入膠囊內(nèi)包埋切片染色， 用日立HT7700透射式電子顯微鏡觀察腸道組織結(jié)構(gòu)并拍照。

掃描電鏡采用鋨酸固定， 緩沖液洗滌， 乙醇梯度脫水， 醋酸異戊酯置換， 臨界點(diǎn)干燥， 鍍膜最后用導(dǎo)電膠膠于樣品臺， 采用飛利浦XL-20型掃描電子顯微鏡觀察腸道組織結(jié)構(gòu)、測量腸道微絨毛高度并拍照。

腸道組織勻漿樣品制備與分析 取部分新鮮中腸， 稱重后加入10倍體積0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）， 勻漿器10000 r/min勻漿1min， 3000 r/min冷凍離心10min， 取上清液分裝， 液氮速凍后-80℃冰箱保存。MDA、GSH采用南京建成試劑盒測定。

MDA采用南京建成試劑盒， D-乳酸、內(nèi)毒素采用購于南京建成的Elisa試劑盒測定。血清膽固醇、膽汁酸采用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測定。

飼料油脂樣品分析 油脂過氧化值測定參照GB/T 5538-2005， 酸價(jià)測定參照GB/T 5530-2005，MDA采用南京建成試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示， 在單因素方差分析的基礎(chǔ)上， 采用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)組間差異顯著性， 用Pearson分析方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)性， 并用Excel 2013作回歸分析， 以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 草魚血清、腸道丙二醛（MDA）及腸道谷胱甘肽（GSH）含量

以丙二醛作為氧化標(biāo)志物， 以谷胱甘肽作為抗氧化損傷標(biāo)志物， 經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 測定各組草魚血清、腸道MDA及GSH含量（表 3）。

由表11可知，以上39個(gè)處理組合中，單位面積合格插穗數(shù)在8333-62223個(gè)之間，其中處理A1B4(株行距30cm×50cm，定芽數(shù)4)最高為62223個(gè)。

表 3 氧化魚油對草魚血清、腸道丙二醛（MDA）及腸道谷胱甘肽（GSH）含量的影響Tab. 3 Effects of oxidized fish oil on serum and intestine MDA and GSH content of Ctenopharyngodon idellus

由表 3可知， 相對于6S組， 添加魚油或氧化魚油組草魚血清及腸道MDA含量均出現(xiàn)上升。其中，血清中6F、4S2OF及2S4OF組顯著大于6S組（P＜0.05）， 6OF組則顯著大于6S及6F組（P＜0.05）； 腸道中6S與6F組無顯著差異（P＞0.05）， 4S2OF及6OF組顯著大于6S及6F組（P＜0.05）， 2S4OF組顯著大于所有組（P＜0.05）。4S2OF、2S4OF及6OF組腸道GSH含量則顯著大于6S組（P＜0.05）， 6F組除與4S2OF組差異不顯著（P＞0.05）外， 顯著大于其他3組（P＜0.05）。

2.2 草魚腸道膽固醇及膽汁酸含量

前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［13］， 氧化魚油損傷腸道后，會導(dǎo)致腸道組織膽固醇、膽汁酸生物合成通路基因表達(dá)活性顯著上調(diào)， 顯示膽固醇、膽汁酸在腸道結(jié)構(gòu)與功能維護(hù)中具有重要的作用。經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 測定各組草魚腸道膽固醇及膽汁酸含量（表 4）。

表 4 氧化魚油對草魚腸道膽固醇及膽汁酸含量的影響Tab. 4 Effects of oxidized fish oil on intestine bile acid and cholesterol content of Ctenopharyngodon idellus

由表 4可知， 在添加魚油或氧化魚油后， 草魚腸道中膽汁酸含量出現(xiàn)不同程度下降， 下降率為50.9%—97.1%， 且差異具有顯著性（P＜0.05）； 腸道膽固醇含量出現(xiàn)不同程度上升， 上升率為3.9%—29.4%， 其中6F組及2S4OF組顯著大于其余3組（P＜0.05）。

2.3 草魚血清內(nèi)毒素及D-乳酸含量

經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 測定各組草魚血清內(nèi)毒素及D-乳酸含量（表 5）。由表 5可知， 6OF組草魚血清中內(nèi)毒素及D-乳酸均顯著高于其他組（P＜0.05），6S組則具有最小值， 除內(nèi)毒素中與6F組沒有顯著差異外（P＞0.05）均顯著小于其他各組（P＜0.05）。

表 5 氧化魚油對草魚腸道通透性的影響Tab. 5 Effects of oxidized fish oil on the permeability of intestine of Ctenopharyngodon idellus

2.4 草魚腸道、血清生化指標(biāo)與飼料油脂氧化產(chǎn)物的相關(guān)性分析

將血清MDA、內(nèi)毒素、D-乳酸和腸道MDA、GSH含量分別與飼料油脂POV、AV及MDA做Pearson相關(guān)性分析， 檢驗(yàn)雙側(cè)顯著性， 樣本量n=5（表 6）。

表 6 草魚腸道、血清生化指標(biāo)與飼料油脂氧化產(chǎn)物的相關(guān)性分析Tab. 6 The correlation analysis of the biochemical criterion of intestine and serum with the oxidative product of oil in diets

由表 6可知， 血清MDA與內(nèi)毒素含量與飼料油脂POV值的相關(guān)性顯著水平（雙側(cè)）檢測值小于0.05，即血清MDA與內(nèi)毒素含量與飼料油脂POV值顯著相關(guān)。血清MDA含量與飼料油脂AV值顯著相關(guān)，血清內(nèi)毒素與飼料油脂MDA含量顯著相關(guān)。將上述指標(biāo)做回歸分析發(fā)現(xiàn)， 血清MDA與飼料油脂POV及AV值以冪函數(shù)關(guān)系擬合度最高， 血清內(nèi)毒素與飼料POV值及MDA含量以二次函數(shù)關(guān)系擬合度最高（圖 1 a-d）。

由圖 1 a-d可知， 血清MDA和內(nèi)毒素含量與飼料中POV、AV 值及MDA含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系， 即血清MDA、內(nèi)毒素含量變化很大程度上受飼料油脂氧化程度的影響。

2.5 草魚腸道黏膜組織觀察結(jié)果

經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 各組草魚腸上皮黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)見圖版Ⅰ-A-E。A-E分別為6S、6F、4S2OF、2S4OF及6OF組。由圖版Ⅰ-B-D可以得到以下結(jié)果：

氧化魚油影響了腸道絨毛組織形態(tài)， 并使微絨毛高度下降 相比較6S組6F、4S2OF及2S4OF組腸道絨毛間隙擴(kuò)大， 排列不整齊， 中央乳糜管明顯擴(kuò)增。圖版Ⅰ-E中6OF組腸道絨毛明顯增生水腫。

經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 各組草魚腸道微絨毛高度（表 6）。腸道微絨毛高度中6OF具有最小值， 且顯著小于其余各組（P＜0.05）。除6OF組外， 其余各組差異不顯著（P＞0.05）， 但相對于6S組有升高的趨勢。

圖 1 血清MDA、內(nèi)毒素含量與飼料中油脂POV、AV值及MDA含量的關(guān)系Fig. 1 Relationship between serum MDA and endotoxin content with dietary oil POV value， AV value and MDA content

氧化魚油使草魚腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量增加

經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后， 各組草魚腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量（表7）。由表 7可知， 添加魚油或氧化魚油后草魚腸道絨毛杯狀細(xì)胞個(gè)數(shù)增加56.7%—312.8%， 且各組間具有顯著性差異（P＜0.05）。

表 7 氧化魚油對草魚腸道草魚腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量、微絨毛高度的影響Tab. 7 Effects of oxidized fish oil on the number of goblet cell and the height of microvilli of intestine of Ctenopharyngodon idellus

2.6 氧化魚油對草魚腸道緊密連接結(jié)構(gòu)有破壞作用

經(jīng)72d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后各組草魚腸道緊密連接結(jié)構(gòu)見圖版Ⅰ-F-J。

圖版Ⅰ-F-J分別為6S、6F、4S2OF、2S4OF及6OF組。圖中尖頭所示為草魚腸道緊密連接結(jié)構(gòu)，圖版Ⅰ-F可見 6S組緊密連接結(jié)構(gòu)沒有空隙， 圖版Ⅰ-G-J箭頭所示處可以發(fā)現(xiàn)緊密連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空隙， 并且逐步擴(kuò)大， 6OF組整個(gè)通路基本已打開。

3 討論

3.1 氧化魚油對草魚腸道健康有顯著的損傷作用

在飼料中， 魚油高不飽和脂肪酸的營養(yǎng)作用、脂肪酸氧化產(chǎn)物的毒副作用交互影響， 對草魚腸道的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生重大的影響。

（1）魚體氧化損傷程度及其抗氧化能力的強(qiáng)弱與飼料中油脂氧化產(chǎn)物及其含量有直接關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 氧化魚油對草魚腸道健康具有損傷作用。魚油氧化會產(chǎn)生大量的氫過氧化物、醛、酮等氧化產(chǎn)物， 對草魚機(jī)體造成損害。過氧化氫能引發(fā)生物膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)中多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生MDA［14］， MDA可交聯(lián)蛋白質(zhì)及磷脂的氨基， 生成Scihff氏堿， 從而進(jìn)一步降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性［15］。而谷胱甘肽GSH作為抗氧化劑能有效清除超氧自由基， 保護(hù)細(xì)胞膜， 抵御膜損傷［16， 17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出， 隨飼料中油脂氧化產(chǎn)物含量的上升， 草魚血清MDA含量呈上升趨勢，且血清MDA含量與飼料油脂POV及AV值呈冪函數(shù)正相關(guān)關(guān)系。這說明飼料油脂氧化程度、氧化產(chǎn)物含量（POV及AV值）對草魚血清MDA含量有促進(jìn)作用， 并且飼料中較低的POV和AV值即會顯著提高草魚血清中MDA的含量， 但隨著POV與AV值的增大其對血清MDA含量的影響將減小。在飼料中添加魚油或氧化魚油后， 腸道MDA含量除6OF組外呈上升趨勢， 最大值出現(xiàn)在2S4OF組。結(jié)合腸道透射電鏡結(jié)果， 腸道MDA含量在6OF組出現(xiàn)下降的原因很可能是， 高濃度的油脂氧化產(chǎn)物破壞腸道結(jié)構(gòu)， 增加腸道通透性， 使腸道中MDA大量進(jìn)入血液循環(huán)所導(dǎo)致的。

一般認(rèn)為腸道對氧化油脂的吸收與腸道GSH的含量呈負(fù)相關(guān)［18］， 而本實(shí)驗(yàn)中腸道GSH含量與飼料油脂POV、AV值及MDA含量相關(guān)性為0.002—0.083， 說明腸道GSH含量與飼料油脂中氧化產(chǎn)物含量基本不相關(guān)。這可能是由于少量的氧化產(chǎn)物即會引起草魚體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激， 從而使作為GSH主要合成器官的肝胰臟［19］的GSH產(chǎn)量上升，因此6F組腸道GSH含量具有最大值。但隨著飼料中氧化產(chǎn)物含量的上升， 超過草魚的耐受范圍后，草魚肝胰臟功能受到損傷而使其抗氧化能力下降（待發(fā)表）， GSH分泌量下降， 腸道GSH含量便出現(xiàn)下降， 腸道對氧化油脂的吸收增加。這與本實(shí)驗(yàn)中6S與6F組腸道MDA含量差異不顯著， 而4S2OF、2S4OF及6OF組中血清MDA含量上升相一致。

（2）在氧化魚油對腸道損傷作用下， 腸道組織膽汁酸、膽固醇的作用值得進(jìn)一步的研究。魚體生理性的“腸-肝軸”中， 膽汁酸的“腸-肝循環(huán)”是其重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。肝胰臟、腸道組織都具有以乙酰輔酶A為原料的膽固醇生物合成的能力。肝胰臟以膽固醇為原料合成初級膽汁酸， 初級膽汁酸進(jìn)入腸道后， 在腸道細(xì)菌等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭壞懼幔⒃谀c道后段被重新吸收回到肝胰臟， 這就是典型的膽汁酸“肝-腸循環(huán)”通路。

Dibner等［20］通過標(biāo)記公雞腸絨毛上皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)， 氧化油脂會降低腸上皮細(xì)胞的存活率并促進(jìn)細(xì)胞增殖更新。而前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示出［13， 21， 22］， 飼料氧化油脂對腸道黏膜造成了嚴(yán)重?fù)p傷， 同時(shí)也會引起草魚肝胰臟、腸道膽固醇生物合成通路基因表達(dá)活性顯著上調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 添加魚油及氧化魚油后， 中腸膽汁酸呈現(xiàn)明顯下降趨勢， 這是由于魚油氧化產(chǎn)物損傷肝胰臟而使大量膽汁酸淤積在肝胰臟中所導(dǎo)致的（待發(fā)表）。而膽固醇含量有不同程度的上升， 這與前期實(shí)驗(yàn)［21］得到的氧化魚油導(dǎo)致草魚腸道黏膜膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)代謝減弱， 腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加及腸道黏膜膽固醇生物合成能力及其調(diào)節(jié)作用增加的結(jié)果相一致。

上述結(jié)果表明膽固醇、膽汁酸在維護(hù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)與功能完整性方面可能具有特殊的生理作用， 其具體原理有待進(jìn)一步研究。

3.2 氧化魚油對草魚腸道結(jié)構(gòu)造成顯著性的損傷作用

（1）飼料魚油氧化產(chǎn)物對腸道組織結(jié)構(gòu)、腸道上皮細(xì)胞間緊密連接有顯著的損傷作用?，F(xiàn)有研究表明氧化油脂會對動(dòng)物消化系統(tǒng)造成損傷， 如魚腸道內(nèi)無食物［23］， 腸壁變?。?4］， 腸絨毛萎縮［25］， 降低消化道內(nèi)酶活性［26］等。正常腸道屏障功能中， 最關(guān)鍵的屏障是腸黏膜上皮屏障， 腸黏膜上皮屏障由腸黏膜表面的黏液層、腸上皮細(xì)胞及其緊密連接、黏膜下固有層等組成的。一般認(rèn)為氧化油脂對腸道的損傷都是通過氧化產(chǎn)物如過氧化物、MDA等影響細(xì)胞膜的完整性， 增加細(xì)胞內(nèi)ATP的消耗而導(dǎo)致ATP耗竭和酸中毒， 而從破壞腸道黏膜以增加腸道通透性［27， 28］。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)c道切片結(jié)果顯示， 魚油氧化產(chǎn)物增加了腸道絨毛的間隙， 擴(kuò)大了中央乳糜管。榮新洲等［29］在大鼠嚴(yán)重?zé)齻蟮哪c道也發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象， 他認(rèn)為中央乳糜管的擴(kuò)張是一種代償性改變以增加腸道絨毛的吸收能力。Berman等［30］發(fā)現(xiàn)， 腸道受損時(shí)中央乳糜管中淋巴管會擴(kuò)張以增加腸道抵御細(xì)菌和毒素的能力。史桂芝等［31］在誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠腸道絨毛水腫、中央乳糜管擴(kuò)張， 這與Elias等［32］在羊上得到的結(jié)果相一致。她認(rèn)為這個(gè)現(xiàn)象可能是脂多糖及其誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)作用下致使血漿滲出、組織液增多， 機(jī)體相應(yīng)淋巴液生成增加所導(dǎo)致的。這與本實(shí)驗(yàn)草魚血清內(nèi)毒素含量顯著增加結(jié)果相一致。

光學(xué)顯微鏡觀察黏膜上皮柱狀細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)， 杯狀細(xì)胞數(shù)量在草魚攝食魚油和氧化魚油后明顯增加。杯狀細(xì)胞是一種糖蛋白分泌細(xì)胞， 其分泌的黏蛋白能潤滑腸道， 保護(hù)腸上皮黏膜［33］。并且它產(chǎn)生的三葉狀蛋白， 能在上皮黏膜受損時(shí)與細(xì)胞因子和生長因子的協(xié)同下加快上皮細(xì)胞的愈合［34］。因此，杯狀細(xì)胞的增多表明草魚腸道黏膜受到了損傷。腸道掃描電鏡結(jié)果顯示， 除6OF組腸道微絨毛高度低于6S組外， 其余幾組均高于6S組。這可能是由于魚油氧化產(chǎn)物對草魚造成損傷， 使草魚需要更多營養(yǎng)物質(zhì)來修復(fù)這些損傷， 從而使腸道微絨毛增生以增加腸道吸收營養(yǎng)的能力， 這與人類短腸綜合癥病人殘余腸道的代償、適應(yīng)過程［35］有相似之處。6OF組微絨毛高度減小可能是魚油氧化產(chǎn)物超出草魚的耐受范圍而造成微絨毛的萎縮。從腸道透射電鏡圖版Ⅰ-F中可以看出， 6S組腸道緊密連接結(jié)構(gòu)為一條黑色的致密電子帶， 而添加魚油或氧化魚油后此結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯空隙。緊密連接常見于單層柱狀上皮， 位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面［36］， 具有滲透性調(diào)節(jié)功能［37］和維持細(xì)胞極性［38］這兩個(gè)功能。緊密連接在細(xì)菌及其毒素或炎癥細(xì)胞因子等外界因素的影響下功能會喪失［39］， 最終導(dǎo)致組織浮腫和損傷［40］， 并使腸道通透性增加。

（2）飼料魚油氧化產(chǎn)物導(dǎo)致腸道通透性顯著增加， 形成對其他器官組織損傷作用通路。D-乳酸是腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物， 動(dòng)物體內(nèi)一般不具有將其快速代謝分解的酶， 因而血中D-乳酸水平常用來反應(yīng)腸道通透性［41］。內(nèi)毒素是G-菌細(xì)胞璧的脂多糖部分， 可以引起黏膜水腫并引起缺血， 腸絨毛頂端細(xì)胞壞死， 腸道通透性增加［42］， 同時(shí)還能引起谷氨酰胺代謝紊亂， 進(jìn)而影響腸道黏膜的修復(fù)［43］。本實(shí)驗(yàn)添加魚油和氧化魚油后， 血清中D-乳酸和內(nèi)毒素含量均出現(xiàn)不同程度的上升。尤其是6OF組，其D-乳酸和內(nèi)毒素含量較6S組分別上升146.5%和234.2%， 這說明魚油氧化產(chǎn)物會導(dǎo)致腸道通透性增加。內(nèi)毒素含量的上升可能是由于魚油氧化產(chǎn)物導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)能力和機(jī)械清除能力減弱， 進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)菌易位和定植的能力， 而需氧菌的大量聚集和繁殖可產(chǎn)生高濃度的內(nèi)毒素［44］。血清中內(nèi)毒素含量與飼料油脂中POV值和MDA呈二元函數(shù)正相關(guān)，這表明血清內(nèi)毒素含量增加的速率會隨著飼料油脂中POV值及MDA含量的上升而增快。血清D-乳酸含量與飼料油脂氧化產(chǎn)物含量也呈正相關(guān)， 其相關(guān)系數(shù)為61.8%—75.7%。因此腸道通透性和飼料油脂氧化程度呈正相關(guān)。

腸道通透性增加可以有2個(gè)通路， 一是細(xì)胞內(nèi)通路， 即由于上皮細(xì)胞微絨毛、腸腔方面細(xì)胞膜損傷， 導(dǎo)致內(nèi)毒素等經(jīng)過上皮細(xì)胞→基底層→毛細(xì)血管的通路進(jìn)入血液循環(huán)； 二是細(xì)胞間通絡(luò)， 即由于上皮細(xì)胞間緊密連接的破壞， 導(dǎo)致內(nèi)毒素等經(jīng)過上皮細(xì)胞間隙通路進(jìn)入血液系統(tǒng)［45， 46］。當(dāng)腸道黏膜組織的屏障結(jié)構(gòu)完整性受到破壞后， 腸道內(nèi)的細(xì)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素等即可越過腸道屏障而進(jìn)入血液系統(tǒng)， 并對其他遠(yuǎn)程器官組織如肝胰臟等形成損傷作用。因此， 腸道損傷、尤其是腸道屏障完整性損傷常常被視為體內(nèi)炎癥的始發(fā)器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 魚油氧化產(chǎn)物會損傷腸道并使其通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸道內(nèi)有害物質(zhì)大量進(jìn)入血液循環(huán)而對草魚造成進(jìn)一步損傷。并且結(jié)合血清內(nèi)毒素、D-乳酸和腸道切片及透射電鏡結(jié)果可知， 在6F、4S2OF及2S4OF組中， 腸道黏膜并沒有被嚴(yán)重?fù)p傷，只有緊密連接明顯被損傷。且6OF組血清內(nèi)毒素和D-乳酸較2S4OF分別上升92.2%和133.5%， 而2S4OF較6S組分別上升40.2%和43.1%， 由此可見血清內(nèi)毒素和D-乳酸在6OF組中出現(xiàn)較大幅度上升，再結(jié)合切片照片結(jié)果， 推測只有在6OF組中腸道黏膜才明顯受損， 進(jìn)而導(dǎo)致有害物質(zhì)通過腸道黏膜直接進(jìn)入血液循環(huán)。

4 結(jié)論

在飼料中魚油氧化產(chǎn)物損傷了草魚腸道組織結(jié)構(gòu)， 尤其是腸道上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，從而破壞了腸道黏膜的機(jī)械屏障功能， 使腸道通透性顯著增加， 腸道細(xì)菌內(nèi)毒素等發(fā)生轉(zhuǎn)移， 可能對其他器官組織也形成損傷作用。魚油氧化產(chǎn)物會引起草魚腸道氧化與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)， 可干擾草魚“肝-腸”正常膽汁酸循環(huán)， 致使草魚腸道膽汁酸不足。

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EFFECTS OF DIETARY OXIDIZED FISH OIL ON THE INTESTINAL STRUCTURE AND PERMEABILITY OF GRASS CARP （CTENOPHARYNGODON IDELLUS）

CHEN Ke-Quan1， YE Yuan-Tu1， CAI Chun-Fang1， WU Ping1， HUANG Yu-Wei1， WU Tao1，LIN Xiu-Xiu1， LUO Qi-Gang1， ZHANG Bao-Tong2and XIAO Pei-Zhen1， 2
（1. Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition in Jiangsu Province， Preclinical Medicine and Biological Science College of Soochow University， Suzhou 215123， China； 2. Beijing Institute of Nutrition， Laboratory of Aquatic Animal Nutrition Research System， Beijing 100000， China）

To investigate effects of oxidized fish oil on the structure and permeability of intestine of grass carp （Ctenopharyngodon idellus）， five iso-nitrogen and iso-energy diets were formulated with soybean oil， fish oil and oxidized fish oil at different concentrations： 6% fish oil， 6% soybean oil， 2% oxidized fish oil and 4% soybean oil， 4% oxidized fish oil， and 2% soybean oil， 6% oxidized fish oil， respectively. Compared with the 6% soybean oil， the oxidative product of fish oil at low level increased serum and intestine MDA and GSH content but diminished the GSH content at high level. The oxidized fish oil significantly reduced intestine bile acid content （P＜0.05）. The oxidized fish oil enhanced the number of goblet cell （P＜0.05）， The microvilli of intestine was enlarged by low oxidized fish oil level and atrophied by high level. Serum D-lactic acid and endotoxin content increased significantly by oxidized fish oil because of the enlarged gap between tight junction， the hyperplasia and edema of villi. Thus， the oxidized fish oil might damage the intestinal epithelial tight junction and destroy the intestinal mucosal epithelium， which would increase intestinal oxidative stress and interfere the bile acids-cholesterol circulation of grass carp.

Dxidized fish oil； Intestine； Structure； Permeability； Ctenopharyngodon idellus

圖版Ⅰ 氧化魚油對草魚中腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響Plate Ⅰ Effects of oxidized fish oil on the morphology and structure of grass carp midgut

S965.1

A

1000-3207（2016）04-0804-10

10.7541/2016.104

2015-06-05；

2015-10-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172417）； 蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（SYN201316）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （31172417）； Applied Basic Research Programs of Suzhou City （SYN201316）］

陳科全（1990—）， 男； 浙江諸暨人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料。E-mail： 326088246@qq.com

葉元土， 教授， 碩士生導(dǎo)師； E-mail： yeyt@suda.edu.cn