陳科全葉元土蔡春芳吳 萍黃雨薇吳 韜林秀秀羅其剛張寶彤蕭培珍，

飼料氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷

陳科全1葉元土1蔡春芳1吳 萍1黃雨薇1吳 韜1林秀秀1羅其剛1張寶彤2蕭培珍1， 2

（1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘇州 215123；2. 北京營(yíng)養(yǎng)源研究所、水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)研究開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室， 北京 100000）

為了探討飼料氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟組織結(jié)構(gòu)及其功能的影響， 研究以豆油、魚(yú)油及氧化魚(yú)油作為飼料脂肪源， 分別設(shè)計(jì)魚(yú)油組（6F）、豆油組（6S）、2%氧化魚(yú)油（4S2OF）、4%氧化魚(yú)油（2S4OF）及6%氧化魚(yú)油（6OF）5組等氮、等能的半純化飼料， 在池塘網(wǎng)箱中養(yǎng)殖72d。結(jié)果顯示： 氧化魚(yú)油顯著增加草魚(yú)血清ALB、GLB、MDA和GSH含量（P＜0.05）， 顯著降低肝胰臟GSH和SOD含量（P＜0.05）； 氧化魚(yú)油會(huì)顯著增加草魚(yú)肝胰臟指數(shù)及肝胰臟脂肪含量（P＜0.05）， 且草魚(yú)血清TG含量顯著上升（P＜0.05）， HDL/LDL顯著下降（P＜0.05）； 氧化魚(yú)油使血清及肝胰臟TC含量顯著增加（P＜0.05）， 血清TBA顯著下降（P＜0.05）， 肝胰臟TBA顯著上升（P＜0.05）； 氧化魚(yú)油會(huì)引起草魚(yú)脂肪肝， 損傷肝胰臟細(xì)胞線粒體， 并導(dǎo)致肝胰臟細(xì)胞纖維化和組織萎縮。結(jié)果表明： 飼料添加氧化魚(yú)油會(huì)引起草魚(yú)氧化應(yīng)激， 并降低草魚(yú)肝胰臟抗氧化能力； 擾亂草魚(yú)肝胰臟脂肪代謝， 引起脂肪肝； 影響膽汁酸肝腸循環(huán)， 使膽汁酸在肝胰臟中堆積， 并損傷肝胰臟細(xì)胞線粒體， 最終增加草魚(yú)肝胰臟脂肪性肝炎發(fā)生率。

脂肪代謝； 膽汁酸； 線粒體； 草魚(yú)

魚(yú)油因其富含EPA、DHA等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸（LC-PUFA）而對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有很好的營(yíng)養(yǎng)作用， 但高含量的LC-PUFA會(huì)在光照、溫度和氧等因素的影響下迅速被氧化產(chǎn)生過(guò)氧化物、酯類(lèi)、多聚體等氧化產(chǎn)物而對(duì)動(dòng)物體造成損害［1］， 因此魚(yú)油對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有營(yíng)養(yǎng)作用和氧化損傷的二面性?，F(xiàn)有研究表明， 氧化魚(yú)油會(huì)導(dǎo)致虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟腫大， 并出現(xiàn)脂肪肝［2］； 鯉（Cyprinus carpio）肝胰臟抗氧化能力下降， 肝細(xì)胞受損［3， 4］。

草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）作為我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)， 在實(shí)際養(yǎng)殖中也是病害較多養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一［5］。肝胰臟是草魚(yú)最重要的代謝和解毒器官， 具有代謝脂肪、合成膽汁酸、分泌免疫蛋白、分解有毒物質(zhì)等眾多功能［6］。近年來(lái)， 通過(guò)保護(hù)動(dòng)物肝胰臟來(lái)加強(qiáng)其自身體抗力的途徑已成為水產(chǎn)動(dòng)物病害防治的關(guān)鍵點(diǎn)， 并越來(lái)越受到重視［7， 8］。但關(guān)于氧化魚(yú)油對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肝胰臟功能和結(jié)構(gòu)的損傷進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究和探討的報(bào)道尚少見(jiàn)。本文以草魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象， 以豆油為對(duì)照， 研究氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟細(xì)胞、線粒體結(jié)構(gòu)的損傷及對(duì)脂肪代謝、膽汁酸循環(huán)功能的影響， 期望為闡述油脂氧化產(chǎn)物對(duì)魚(yú)體肝胰臟結(jié)構(gòu)、功能損傷機(jī)制及其作用方式等科學(xué)問(wèn)題提供依據(jù)， 為實(shí)際生產(chǎn)中飼料油脂的選擇與質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 草魚(yú)

草魚(yú)來(lái)源于浙江一星飼料有限公司養(yǎng)殖基地，為池塘培育的1冬齡魚(yú)種， 共350尾， 平均體重為（74.8±1.0） g。草魚(yú)隨機(jī)分為5組， 每組設(shè)3重復(fù)， 每重復(fù)20尾。分組剩余草魚(yú)用于養(yǎng)殖前期取樣分析。

1.2 飼料

以酪蛋白和秘魯蒸氣魚(yú)粉為主要蛋白源， 采用等氮、等能方案設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼料， 設(shè)置了6%豆油組（簡(jiǎn)稱6S組）、6%魚(yú)油組（6F組）、2%氧化魚(yú)油+ 4%豆油組（4S2OF組）、4%氧化魚(yú)油+2%豆油組（2S4OF組）、6%氧化魚(yú)油組（6OF組）共5種半純化飼料， 配方及實(shí)測(cè)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)見(jiàn)表 1。各組蛋白含量為29.52%—30.55%， 無(wú)顯著差異； 各組能量為19.943—20.860 kJ/g， 無(wú)顯著差異。

表 1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平Tab. 1 POV value， AV value and MDA content in diets

飼料原料粉碎過(guò)60目篩， 用絞肉機(jī)制成直徑1.5 mm的長(zhǎng)條狀， 切成1.5 mm×2 mm的顆粒狀， 風(fēng)干。飼料置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

豆油為“福臨門(mén)”牌一級(jí)大豆油， 魚(yú)油來(lái)源于廣東省良種引進(jìn)服務(wù)公司生產(chǎn)的“高美牌”精煉魚(yú)油，氧化魚(yú)油參考文獻(xiàn)［9］方法制備。分別測(cè)定3種油脂過(guò)氧化值（POV）、酸價(jià)（AV）、丙二醛（MDA）， 并計(jì)算飼料中POV、AV、MDA值（飼料中AV、POV、MDA測(cè)定尚無(wú)有效方法， 故采用油脂測(cè)定結(jié)果的計(jì)算值）， 結(jié)果分別見(jiàn)表 2。

由表 2可知， 本試驗(yàn)中使用的魚(yú)油有一定程度的氧化， 由于其在飼料中比例為6%， 而氧化魚(yú)油組是由氧化魚(yú)油和豆油按比例混合作為脂肪源， 所以6F組的實(shí)際POV值比4S2OF組高12.25%， 而AV值則比4S2OF和2S4OF組分別高出100%和3.9%。

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在浙江一星飼料有限公司試驗(yàn)基地進(jìn)行。在面積為5 m×667 m （平均水深1.8 m）的池塘中設(shè)置網(wǎng)箱， 網(wǎng)箱規(guī)格為1.0 m×1.5 m×2.0 m。將各組試驗(yàn)草魚(yú)隨機(jī)分配在5組、15個(gè)網(wǎng)箱中。

分別用試驗(yàn)飼料馴化1周后， 開(kāi)始正式投喂， 每天7：00和16：00定時(shí)投喂， 投飼率為3%—4%， 每10d依據(jù)投飼量估算魚(yú)體增重并調(diào)整投飼率， 記錄每天投飼量。正式試驗(yàn)共養(yǎng)殖72d。

每周測(cè)定水質(zhì)一次， 試驗(yàn)期間溶解氧濃度＞8.0 mg/L， pH 7.8—8.4， 氨氮濃度＜0.2 mg/L， 亞硝酸鹽濃度＜0.01 mg/L， 硫化物濃度＜0.05 mg/L。養(yǎng)殖期間水溫25—33℃。

表 2 試驗(yàn)飼料中POV值、AV及MDA含量分析結(jié)果Tab. 2 POV value， AV value and MDA content in diets

1.4 樣品采集及其分析方法

經(jīng)72d養(yǎng)殖、禁食24h后進(jìn)行樣品采集。

肝胰臟組織學(xué)樣品制備及分析 每網(wǎng)箱取6尾魚(yú)、每組18尾， 單獨(dú)記錄其體重和肝胰臟重量，用于肝胰臟指數(shù)（HSI）計(jì)算， 并收集肝胰臟用索氏抽提法測(cè)定其粗脂肪。另每網(wǎng)箱取3尾魚(yú)， 于肝胰臟左葉取1 mm3和1 cm3組織塊各1塊， 分別放入4%戊二醛溶液及Bouin試液中固定， 用于透射電鏡和組織學(xué)切片分析。

組織學(xué)切片采用石蠟切片方法， 蘇木精-伊紅染色， 中性樹(shù)膠封片， 光學(xué)顯微鏡下觀察肝胰臟組織結(jié)構(gòu)并采用Nikon COOLPIX4500型相機(jī)進(jìn)行拍照。

透射電鏡采用鋨酸固定、丙酮脫水， 最后放入膠囊內(nèi)包埋切片染色， 用日立HT7700透射式電子顯微鏡觀察肝胰臟組織結(jié)構(gòu)并拍照。

肝胰臟組織勻漿樣品制備與分析 取部

分新鮮肝胰臟， 稱重后加入10倍體積0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）， 勻漿器10000 r/min勻漿1min，3000 r/min冷凍離心10min， 取上清液分裝， 液氮速凍后-80℃冰箱保存。丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）采用南京建成試劑盒測(cè)定， 膽固醇（TC）、膽汁酸（TBA）采用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

血清樣品制備與分析 每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取10尾魚(yú)， 以無(wú)菌1 mL注射器自尾柄靜脈采血， 置于Eppenddorf離心管中室溫自然凝固0.5h， 3000 r/ min冷凍離心10min， 取上清液分裝后， 液氮速凍并于-80℃冰箱中保存。

MDA、SOD采用南京建成試劑盒。白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、血清膽固醇（TC）、膽汁酸（TBA）采用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

飼料油脂樣品分析 油脂過(guò)氧化值測(cè)定參照GB/T 5538-2005； 酸價(jià)測(cè)定參照GB/T 5530-2005；MDA采用南京建成試劑盒測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示， 在單因素方差分析的基礎(chǔ)上， 采用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)組間差異顯著性， 用Pearson分析方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)性， 以P＜0.05表示差異顯著， P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟功能的影響

飼料氧化魚(yú)油引起草魚(yú)抗氧化損傷應(yīng)激與氧化損傷 經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)血清ALB、GLB、MDA及SOD含量見(jiàn)表 3。

表 3 血清MDA、SOD、ALB、GLB、ALB/GLB測(cè)定結(jié)果Tab. 3 MDA， SOD， ALB， GLB content and ALB/GLB in serum

由表 3 可知， 相比6S組， 添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后， 草魚(yú)血清ALB、GLB、MDA、SOD含量， 除4S2OF、6OF組ALB含量與6S組差異不顯著外， 其余各組含量均顯著上升（P＜0.05）， 雖然ALB/GLB各組間沒(méi)有顯著差異， 但有下降趨勢(shì)。在相關(guān)性分析中， 血清MDA、SOD含量與飼料油脂中POV值、AV值相關(guān)性較大， R2為0.68—0.71， 且相關(guān)性極顯著（P＜0.01）。

血清酶學(xué)指標(biāo)能反映魚(yú)體整體的生理功能狀態(tài)， 上述結(jié)果顯示， ALB/GLB有下降趨勢(shì)， 表明草魚(yú)肝胰臟蛋白質(zhì)合成能力下降， 且血清中免疫細(xì)胞增多， 體內(nèi)可能有炎癥反應(yīng)； 氧化物質(zhì)MDA含量增加， 抗氧化的SOD含量增加， 說(shuō)明氧化損傷和抗氧化損傷加??； 血清中MDA、SOD含量與飼料油脂中POV、AV值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系， 但與飼料中MDA無(wú)顯著相關(guān)系， 說(shuō)明血清中的MDA并不是直接來(lái)源于飼料中的MDA， 而可能是來(lái)源于飼料中POV、AV引起魚(yú)體體內(nèi)氧化損傷所產(chǎn)生的MDA。上述結(jié)果表明， 飼料魚(yú)油氧化產(chǎn)物的影響是以氧化損傷為主， 魚(yú)體處于氧化損傷與抗氧化損傷的應(yīng)激狀態(tài)； 氧化損傷的程度與飼料中油脂氧化程度呈正相關(guān)關(guān)系。

飼料氧化魚(yú)油引起草魚(yú)肝胰臟抗氧化功能下降 經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)血清ALT、GGT含量及肝胰臟GSH、MDA、SOD含量見(jiàn)表 4。

表 4 血清ALT、GGT含量與肝胰臟GSH、MDA、SOD測(cè)定結(jié)果Tab. 4 ALT and GGT content in serum and GSH， MDA and SOD content in hepatopancreas

表 5 氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟指數(shù)、肝胰臟脂肪含量及血清TG、HDL和LDL含量的影響Tab. 5 Effects of oxidized fish oil on the HSI， lipid content of hepatopancreas and TG， HDL and LDL content in serum

由表 4 可知， 在添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后， 草魚(yú)血清ALT、GGT含量及肝胰臟MDA含量各組間差異不顯著， GSH和SOD含量均顯著下降（P＜0.05）。在相關(guān)性分析中， 肝胰臟GSH含量與飼料油脂中POV值、MDA含量相關(guān)性較大， R2分別為0.69與0.83， 且相關(guān)性極顯著（P＜0.01）

上述結(jié)果顯示， 血清ALT和GGT含量沒(méi)有差異，表明草魚(yú)肝胰臟細(xì)胞通透性沒(méi)有發(fā)生顯著性的改變； 雖然血清MDA隨飼料中魚(yú)油氧化產(chǎn)物含量增加而增加， 但肝胰臟組織中MDA沒(méi)有增加， 還有下降的趨勢(shì)， 同時(shí)GSH和SOD下降， 說(shuō)明肝胰臟抗氧化能力下降了。且肝胰臟GSH含量與飼料油脂POV值、MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

飼料氧化魚(yú)油有引起草魚(yú)發(fā)生損傷性脂肪肝的趨勢(shì) 經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)肝胰臟指數(shù)（HSI）、肝胰臟脂肪含量（Lipid）及血清TG、HDL、LDL和HDL/LDL測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 5。

由表 5 可知， 添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后， 草魚(yú)肝胰臟脂肪含量、HSI顯著上升（P＜0.05）， 血清TG含量也顯著上升（P＜0.05）。血清HDL和LDL含量都有先上升后下降的趨勢(shì)， 但HDL/LDL結(jié)果顯示， 6S、6F及4S2OF組差異不顯著， 2S4OF及6OF組則顯著下降（P＜0.05）。上述結(jié)果顯示， 在飼料中添加氧化魚(yú)油后， 肝胰臟指數(shù)和肝胰臟脂肪含量、血脂含量均增加， 部分達(dá)到脂肪肝標(biāo)準(zhǔn)， 說(shuō)明草魚(yú)肝胰臟有發(fā)生脂肪肝的趨勢(shì)。

氧化魚(yú)油導(dǎo)致草魚(yú)肝胰臟膽汁酸淤積 經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)血清及肝胰臟中TBA和TC含量見(jiàn)表 6。

表 6 血清、肝胰臟TBA和TC測(cè)定結(jié)果Tab. 6 TBA and TC content in serum and hepatopancreas

由表 6 可知， 相比6S組， 添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后， 草魚(yú)血清、肝胰臟膽汁酸、膽固醇含量變化如下： ①血清TBA含量顯著下降（P＜0.05）， TC含量顯著上升（P＜0.05）； ②肝胰臟TC含量除6F和2S4OF組、TBA含量除6F組外， 其余各組均顯著上升（P＜0.05）。在相關(guān)性分析中， 肝胰臟TBA含量與飼料油脂MDA含量相關(guān)性較大， R2為0.65， 且相關(guān)性極顯著（P＜0.01）。

上述結(jié)果顯示， 血清膽汁酸含量顯著下降、而肝胰臟膽汁酸顯著上升， 說(shuō)明膽汁酸在肝胰臟中大量淤積； 肝胰臟膽固醇含量上升與HDL/LDL顯著下降結(jié)果相一致， 說(shuō)明肝胰臟將膽固醇等脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至外周組織的能力下降， 脂肪在肝胰臟聚積可能性增加。且肝胰臟TBA含量與飼料油脂MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.2 氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟結(jié)構(gòu)的影響

草魚(yú)肝胰臟組織學(xué)觀察 經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)肝胰臟組織切片結(jié)果見(jiàn)圖版Ⅰ-A-E。

由圖版Ⅰ-A-E可知： 6S、6F組草魚(yú)肝胰臟細(xì)胞排列整齊， 大小均一； 4S2OF組草魚(yú)肝胰臟出現(xiàn)部分因肝胰臟增生而導(dǎo)致相互擠壓變形的細(xì)胞（見(jiàn)圖中箭頭所示）； 2S4OF組草魚(yú)肝胰臟出現(xiàn)部分細(xì)胞細(xì)胞核由細(xì)胞中央轉(zhuǎn)移至細(xì)胞邊緣（見(jiàn)圖中箭頭所示）；6OF組草魚(yú)肝胰臟出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常， 結(jié)締組織增生， 且有明顯纖維化趨勢(shì)（圖中箭頭所示）。

由表 7可知， 6S、6F、4S2OF和2S4OF組Mn/Mc有減小趨勢(shì)， 但無(wú)顯著差異， 而6OF組則顯著小于所有組， 說(shuō)明6OF組中草魚(yú)肝胰臟出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性損傷。

氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟細(xì)胞線粒體的損傷

經(jīng)72d養(yǎng)殖試驗(yàn)后， 各組草魚(yú)肝胰臟線粒體透射電鏡結(jié)果見(jiàn)圖版Ⅰ-F-J。

由圖版Ⅰ-F-J可知， 6S和6F組草魚(yú)肝胰臟線粒體呈正常長(zhǎng)桿型， 內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰， 嵴形態(tài)明顯；4S2OF組線粒體形態(tài)正常， 但嵴形態(tài)模糊； 2S4OF組線粒體形態(tài)發(fā)生明顯變化， 內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊， 嵴形態(tài)消融； 6OF組線粒體接近圓形， 內(nèi)部出現(xiàn)大面積空缺， 嵴已基本消融。

上述結(jié)果顯示， 氧化魚(yú)油會(huì)損傷草魚(yú)肝胰臟中線粒體， 而導(dǎo)致肝胰臟發(fā)生炎癥， 這與本實(shí)驗(yàn)血清ALB和GLB結(jié)果相一致。

3 討論

魚(yú)油因其富含高不飽和脂肪酸而極易容易被氧化， 所產(chǎn)生的多種中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物如醛類(lèi)、酮類(lèi)、脂類(lèi)、多聚體等， 會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成氧化損傷與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)［10， 11］。

3.1 氧化魚(yú)油導(dǎo)致草魚(yú)氧化應(yīng)激并造成肝胰臟氧化損傷

MDA作為油脂氧化的終產(chǎn)物［12］， 會(huì)交聯(lián)蛋白質(zhì)及磷脂的氨基， 從而降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性［13］， 而細(xì)胞膜流動(dòng)性下降后更易被過(guò)氧化氫氧化從而產(chǎn)生MDA［14］。SOD和GSH水平作為機(jī)體抗氧化狀態(tài)的標(biāo)志［15］， 常作為機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后草魚(yú)血清中MDA和SOD含量均出現(xiàn)顯著上升， 且與飼料油脂中POV、AV值呈正相關(guān)關(guān)系； 而肝胰臟SOD和GSH含量顯著下降， 肝胰臟GSH含量與飼料油脂中POV值、MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)性關(guān)系。這說(shuō)明在本試驗(yàn)中草魚(yú)魚(yú)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)， 肝胰臟的抗氧能力顯著下降， 且抗應(yīng)激程度很大程度上取決于飼料油脂的氧化程度。

表 7 肝胰臟細(xì)胞核與細(xì)胞個(gè)數(shù)比值（Mn/Mc）結(jié)果Tab. 7 The ratio of hepatopancreas nucleus to hepatopancreas cells

而在本試驗(yàn)中各組草魚(yú)肝胰臟MDA含量沒(méi)有顯著差異， 這與Mourente等［16］在用氧化油脂飼喂金頭鯛（Sparus aurata）后得到結(jié)果相一致， 他們認(rèn)為油脂氧化產(chǎn)物在肝胰臟CAT、SOD等抗氧化酶的作用下， 其在肝胰臟中的含量并不會(huì)上升。

ALB只能由肝胰臟合成， 而GLB是機(jī)體主要的血清免疫球蛋白， 兩者的比值常用來(lái)反映肝胰臟的病理?yè)p傷程度［17］。在本試驗(yàn)中6F、4S2OF和2S4OF組血清ALB較6S組顯著上升， 而6OF組與6S組無(wú)顯著差異， 說(shuō)明草魚(yú)肝胰臟功能在少量氧化產(chǎn)物的情況下會(huì)出現(xiàn)代償性增強(qiáng)， 當(dāng)氧化產(chǎn)物過(guò)高后其功能會(huì)受到抑制， 這與HSI結(jié)果相一致。而ALB/GLB的顯著下降則表示肝胰臟有因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生炎癥的可能。

血清中ALT和GGT都主要來(lái)自肝胰臟， 當(dāng)肝胰臟受到實(shí)質(zhì)性損傷其細(xì)胞通透性增加后血清中ALT和GGT含量會(huì)顯著上升［18］。而在本試驗(yàn)中各組血清ALT和GGT沒(méi)有顯著升高， 說(shuō)明肝胰臟細(xì)胞通透性沒(méi)有增加。

結(jié)果表明， 魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)引起草魚(yú)氧化應(yīng)激，且應(yīng)激程度與魚(yú)油氧化程度正相關(guān)； 草魚(yú)肝胰臟有發(fā)生炎癥的可能， 且炎癥主要發(fā)生在肝胰臟細(xì)胞內(nèi)部， 尚未對(duì)細(xì)胞通透性造成影響。

3.2 氧化魚(yú)油干擾草魚(yú)膽固醇、膽汁酸代謝

膽汁酸是以膽固醇為原料在肝臟中合成的一種重要物質(zhì)， 其對(duì)膽固醇代謝的調(diào)控、及膽汁膽固醇的溶解和對(duì)腸道脂類(lèi)物質(zhì)的消化、吸收具有重要意義［19］。在正常情況下機(jī)體存在“膽汁酸腸肝循環(huán)”［20］以循環(huán)利用膽汁酸。膽汁酸的腸肝循環(huán)是調(diào)節(jié)膽汁酸合成速率的重要調(diào)節(jié)機(jī)制［21］， 以防止具有毒性的疏水性膽汁酸在肝胰臟內(nèi)大量聚積而損傷肝胰臟。膽汁酸的腸肝循環(huán)過(guò)程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙， 都會(huì)導(dǎo)致膽汁酸在肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管內(nèi)淤積， 從而發(fā)生肝胰臟增大、黃疸等疾病［22］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致肝胰臟膽汁酸、膽固醇含量顯著上升。與6S組比較， 在飼料中添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后， 草魚(yú)血清膽汁酸量顯著下降、膽固醇含量增加， 而肝胰臟是膽汁酸、膽固醇含量均顯著增加， 表明飼料中氧化魚(yú)油顯著干擾草魚(yú)的膽固醇、膽汁酸代謝， 草魚(yú)膽汁酸腸肝循環(huán)發(fā)生障礙， 膽汁酸大量淤積在肝胰臟中， 且肝胰臟膽汁酸含量與飼料油脂MDA含量極顯著正相關(guān)。

在肝胰臟中高含量的膽汁酸會(huì)引起疏水性膽汁酸在肝內(nèi)聚積， 疏水性膽汁酸會(huì)溶解細(xì)胞膜， 從而引起肝胰臟細(xì)胞的壞死， 是膽汁淤積性肝損傷的主要原因［23］。Hino等［24］在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)， 加入抗氧化劑可顯著降低疏水性膽汁酸的毒性， 并且降低肝臟中MDA的含量， 他認(rèn)為氧自由基與疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒作用之間存在某種關(guān)系。劉菁菁［25］在用富含?；悄懰岬暮懼幚肀贿^(guò)氧化物損傷的乳鼠心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)， ?；悄懰峥梢蕴岣呒?xì)胞的抗氧化能力， 降低MDA含量。黃延風(fēng)等［26］在用大黃治療幼鼠肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)發(fā)現(xiàn)， 熊去氧膽酸也能有效的治療肝內(nèi)膽汁淤積。富含熊去氧膽酸的熊膽粉可以有效降低因氧化損傷而產(chǎn)生的MDA［27， 28］?？梢?jiàn)親水性膽汁酸具有一定的抗氧化能力， 并且親水性膽汁酸可在腸道膽汁酸重吸收時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性抑制疏水性膽汁酸的重吸收， 從而減少體內(nèi)膽汁酸中疏水性膽汁酸的含量［29］。

因此， 本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 可能是魚(yú)油氧化產(chǎn)物大量消耗體內(nèi)親水性膽汁酸、導(dǎo)致膽汁酸中疏水性膽汁酸比例上升， 從而堵塞膽管致使草魚(yú)肝胰臟中膽汁酸大量淤積， 最終引發(fā)肝胰臟炎癥。其具體機(jī)理有待進(jìn)一步分析。

另外， 魚(yú)油富含膽固醇， 肝胰臟膽固醇含量的增加是否是由于飼料中魚(yú)油添加量增加所致？6F 與6OF組相比較， 在飼料中魚(yú)油添加量均為6%， 飼料所含膽固醇量相等。但是， 由表 6結(jié)果顯示，6OF組草魚(yú)血清、肝胰臟TC含量均高于6F組， 且肝胰臟TC含量顯著高于6F。這個(gè)結(jié)果表明， 血清、肝胰臟TC含量的增加并不是源于飼料中TC， 而是由于魚(yú)油的氧化所致。飼料中氧化魚(yú)油引起魚(yú)體自身膽固醇生物合成量顯著增加， 這與我們以前的研究結(jié)果［30， 31］相一致。膽固醇的去路之一是合成膽汁酸， 對(duì)于各組草魚(yú)膽汁酸含量的差異， 6F組與6OF組飼料魚(yú)油添加量均為6%， 6S組為6%的豆油，6OF組肝胰臟膽汁酸顯著高于6F組、6F組與6S組無(wú)顯著差異； 6OF組血清膽汁酸含量顯著高于6F組，表明本試驗(yàn)中添加氧化魚(yú)油后（6OF組）， 草魚(yú)肝胰臟膽汁酸含量的增加并非由不同油脂源（6F、6S）所引起的， 而是由于魚(yú)油的氧化程度所致。

3.3 氧化魚(yú)油增加草魚(yú)肝胰臟發(fā)生脂肪性肝炎的機(jī)率

脂肪肝是指由肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多而導(dǎo)致肝臟病變的一種慢性肝臟?。?2］。Lin等［33］認(rèn)為， 草魚(yú)HSI大于3%， 肝胰臟脂肪含量大于5%即可稱為脂肪肝。但魚(yú)類(lèi)HSI會(huì)隨著生長(zhǎng)階段和種類(lèi)的變化而變化［34］， 魚(yú)類(lèi)攝食不同脂肪源其肝胰臟在不發(fā)生病變的情況下脂肪含量也會(huì)發(fā)生較明顯變化［35， 36］。因此， 目前對(duì)于魚(yú)類(lèi)脂肪肝還沒(méi)有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)。但可以肯定的是， 魚(yú)類(lèi)發(fā)生脂肪肝后其肝胰臟脂肪含量會(huì)顯著上升， HSI在脂肪肝前期會(huì)代償性增加， 后期可能會(huì)因肝胰臟實(shí)質(zhì)性損傷而減小， 且肝胰臟中脂肪氧化會(huì)加?。?7］， 血脂含量也會(huì)增加［38］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 添加魚(yú)油或氧化魚(yú)油后草魚(yú)HSI顯著增大， 但6OF組有減小的趨勢(shì)（可能是肝胰臟嚴(yán)重?fù)p傷后出現(xiàn)萎縮性變化）， 肝胰臟脂肪含量顯著增加， 說(shuō)明肝胰臟脂肪代謝功能受干擾；HDL/LDL顯著下降， 也說(shuō)明魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)降低草魚(yú)將外周組織膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝胰臟的能力， 致使血脂含量的上升； 血清TG、TC、HDL和LDL含量均顯著上升， 說(shuō)明試驗(yàn)草魚(yú)血脂含量顯著上升。上述結(jié)果表明， 草魚(yú)有發(fā)生脂肪肝的趨勢(shì)， 再結(jié)合杜震宇［39］有關(guān)營(yíng)養(yǎng)型與氧化型脂肪肝的表型比較結(jié)果來(lái)看， 本試驗(yàn)草魚(yú)脂肪肝接近氧化型脂肪肝。

上述結(jié)果表明， 油脂氧化產(chǎn)物會(huì)干擾草魚(yú)脂肪正常代謝， 但低氧化程度的油脂會(huì)引起草魚(yú)應(yīng)激，從而使其肝胰臟代償性增生來(lái)代謝一定量的氧化產(chǎn)物。而高氧化程度的油脂， 其氧化產(chǎn)物含量超出草魚(yú)耐受范圍后， 會(huì)對(duì)肝胰臟造成損傷， 使肝胰臟代謝脂肪能力下降， 從而導(dǎo)致脂肪在草魚(yú)體內(nèi)大量沉積， 最終降低草魚(yú)生長(zhǎng)速度。并且本試驗(yàn)中［40］氧化魚(yú)油導(dǎo)致草魚(yú)蛋白沉積率下降、脂肪沉積率上升也和Chen等［41］得到氧化魚(yú)油會(huì)增加魚(yú)類(lèi)使用蛋白質(zhì)代替脂肪作為能量消耗的結(jié)果相一致。

結(jié)合肝胰臟組織切片（圖版Ⅰ-A-E）可以發(fā)現(xiàn)：6S、6F組肝胰臟細(xì)胞大小均勻、細(xì)胞核明顯； 4S2OF組中可發(fā)現(xiàn)， 部分肝胰臟細(xì)胞出現(xiàn)因增生而相互擠壓導(dǎo)致細(xì)胞大小明顯不一； 2S4OF組中則出現(xiàn)部分細(xì)胞細(xì)胞核向細(xì)胞邊緣靠近； 6OF組中肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變， 排列不規(guī)則， 有明顯纖維化趨勢(shì)。這些結(jié)果與大口黑鱸（Micropterus salmoides）［42］、紅姑魚(yú)（Sciaenops ocellatus）［43］脂肪肝組織學(xué)觀察結(jié)果相一致， 進(jìn)一步說(shuō)明魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)引起草魚(yú)脂肪肝。

通過(guò)肝胰臟透射電鏡結(jié)果（（圖版Ⅰ-F-J）可以發(fā)現(xiàn)： 6S、6F組肝胰臟細(xì)胞中線粒體為長(zhǎng)桿狀的正常形態(tài)， 且內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整， 嵴形態(tài)明顯； 2OF組中肝胰臟線粒體形態(tài)尚正常， 但是內(nèi)部嵴較分散， 有消融趨勢(shì)； 4OF組中肝胰臟線粒體形態(tài)發(fā)生變化， 內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊， 嵴結(jié)構(gòu)混亂明顯消融； 6OF組中肝胰臟線粒體形態(tài)接近圓形， 內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本全部消融。這與因人工飼喂引起鱸（Lateolabrax japonicas）脂肪肝［44］及用氧化魚(yú)油飼喂鯉造成肝胰臟損傷的電鏡結(jié)果相一致［3］。

肝胰臟作為各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和解毒中心， 對(duì)氧化魚(yú)油的毒性極為敏感。一般認(rèn)為氧化油脂在腸道消化吸收后， 其結(jié)合在乳糜微粒中的氧化產(chǎn)物，一部分會(huì)隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟［45］， 另一部分會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)給脂蛋白， 并由脂蛋白運(yùn)送到各組織， 但其中以轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的最多［46］。而運(yùn)送至肝臟的次級(jí)氧化產(chǎn)物可能先在線粒體中性脂肪上代謝， 然后轉(zhuǎn)運(yùn)至微粒體磷脂上代謝［47］。

線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器， 生物體內(nèi)90%以上的氧分子是在線粒體中被消耗的， 而此過(guò)程在生物體內(nèi)具有兩重性： 一方面， 線粒體利用氧分子產(chǎn)生APT， 這是生物體的重要能量代謝過(guò)程；另一方面， 線粒體體內(nèi)的呼吸作用及氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量有害的氧自由基， 并造成細(xì)胞損傷， 導(dǎo)致疾病和衰老［48］。研究發(fā)現(xiàn)， 脂肪性肝炎患者普遍存在線粒體腫脹， 氧化呼吸復(fù)合體功能下降等［49］， 并認(rèn)為線粒體反應(yīng)性氧體系與脂肪肝的發(fā)生密切相關(guān)。

上述結(jié)果表明魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)引發(fā)草魚(yú)肝胰臟脂肪肝， 并會(huì)損傷肝胰臟細(xì)胞線粒體而引起脂肪性肝炎。

在本試驗(yàn)中魚(yú)油氧化產(chǎn)物對(duì)線粒體的損傷可能由兩方面造成的： （1）線粒體膜富含多不飽和脂肪酸極易被魚(yú)油氧化產(chǎn)物中氫過(guò)氧化物所氧化， 使線粒體膜流動(dòng)性下降、通透性增加［50］， 進(jìn)而肝胰臟中氧化產(chǎn)物大量進(jìn)入線粒體， 最后導(dǎo)致線粒體變形與溶酶體融合［51］； （2）線粒體反應(yīng)性氧體系的形成可啟動(dòng)不飽和脂肪酸氧化從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生［52］，且魚(yú)油氧化產(chǎn)物導(dǎo)致肝胰臟產(chǎn)生應(yīng)激而消耗大量的GSH及維生素E， 從而降低線粒體抗氧化能力， 最終導(dǎo)致線粒體內(nèi)部被破壞。

4 結(jié)論

飼料中魚(yú)油氧化產(chǎn)物會(huì)引起肝胰臟氧化應(yīng)激，其抗氧化能力下降； 使肝胰臟中脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙、脂肪積累增加； 引起草魚(yú)肝胰臟中線粒體損傷、肝細(xì)胞纖維化； 飼料氧化魚(yú)油對(duì)肝胰臟的損傷類(lèi)型為氧化性損傷， 并導(dǎo)致肝胰臟由脂肪肝轉(zhuǎn)變成脂肪性肝炎、肝纖維化或肝萎縮。氧化魚(yú)油會(huì)導(dǎo)致草魚(yú)體內(nèi)膽汁酸中親水性膽汁酸含量下降， 從而引起疏水性膽汁酸堵塞膽管， 造成其在肝胰臟中大量淤積， 進(jìn)而擾亂膽汁酸、膽固醇的正常代謝循環(huán)；膽汁酸在肝胰臟淤積會(huì)導(dǎo)致肝胰臟脂肪代謝異常，致使草魚(yú)肝胰臟成為脂肪肝， 并增加其發(fā)生脂肪性肝炎的機(jī)率。

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DAMAGE OF OXIDIZED FISH OIL ON THE STRUCTURE AND FUNCTION OF HEPATOPANCREAS OF GRASS CARP （CTENOPHARYNGODON IDELLUS）

CHEN Ke-Quan1， YE Yuan-Tu1， CAI Chun-Fang1， WU Ping1， HUANG Yu-Wei1， WU Tao1， LIN Xiu-Xiu1，LUO Qi-Gang1， ZHANG Bao-Tong2and XIAO Pei-Zhen1， 2
（1. Preclinical Medicine and Biological Science College of Soochow University， Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition in Jiangsu Province， Suzhou 215123， China； 2. Laboratory of Aquatic Animal Nutrition Research System， Beijing Institute of Nutrition，Beijing 100000， China）

To investigate effects of oxidized fish oil on the structure and permeability of hepatopancreas of grass carp （Ctenopharyngodon idellus）， five iso-nitrogen and iso-energy diets were formulated with soybean oil， fish oil and oxidized fish oil at different concentrations， 6% fish oil， 6% soybean oil， 2% oxidized fish oil and 4% soybean oil， 4% oxidized fish oil and 2% soybean oil， 6% oxidized fish oil for a 72d experiment. Result showed that oxidized fish oil significantly increased （P＜0.05） the content of ALB， GLB， MDA， GSH of grass carp serum and significantly reduced（P＜0.05） the content of GSH， SOD of grass carp hepatopancreas. Oxidized fish oil significantly increased （P＜0.05） the HSI， content of lipid of hepatopancreas and TG content of serum， and significantly reduced （P＜0.05） the ratio of HDL and LDL at the same time. Oxidized fish oil significantly enhanced the content of TC on serum and hepatopancreas and the content of TBA on hepatopancreas （P＜0.05） but significantly diminished the content of serum TBA （P＜0.05）. Oxidized fish oil caused fatty liver by disrupting the fat metabolism， mitochondrial damage of hepatopancreas by impacting bile acid accumulation， hepatopancreas cell fibrosis， and tissue atrophyin grass carp. In conclusion， products of oxidized fish oil may cause grass carp oxidative stress and decrease antioxidant capacity of grass carp hepatopancreas.

Fat Metabolism； Bile Acid； Mitochondrial； Ctenopharyngodon idellus

圖版Ⅰ 氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)肝胰臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響PlateⅠ Effect of oxidized fish oil on morphology and structure of grass carp hepatopancreas

S963.1

A

1000-3207（2016）04-0793-11

10.7541/2016.103

2015-01-13；

2015-11-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172417）； 蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（SYN201316）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （31172417）； Applied Basic Research Programs of Suzhou City （SYN201316）］

陳科全（1990—）， 男， 浙江諸暨人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail： 326088246@qq.com

葉元土， 教授， 碩士生導(dǎo)師； E-mail： yeyt@suda.edu.cn， Tel./Fax：+86-0512-65880179