葉元土蔡春芳許 凡林秀秀黃雨薇董嬌嬌張寶彤蕭培珍

（1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點試驗室， 蘇州 215123；2. 北京營養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放試驗室， 北京 100000）

氧化魚油對草魚腸道黏膜抗氧化應(yīng)激通路基因表達(dá)水平的影響

葉元土1蔡春芳1許 凡1林秀秀1黃雨薇1董嬌嬌1張寶彤2蕭培珍2

（1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點試驗室， 蘇州 215123；2. 北京營養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放試驗室， 北京 100000）

為了探討氧化魚油對草魚腸道黏膜損傷后， 參與抗氧化應(yīng)激的基因通路及其通路基因表達(dá)活性的變化，以草魚為試驗對象， 灌喂氧化魚油7d后， 采集腸道黏膜組織并提取總RNA， 采用RNA-seq方法， 進(jìn)行了氧化魚油組和正常魚油組草魚腸道黏膜基因注釋、IPA基因通路分析和基因表達(dá)活性差異分析。結(jié)果顯示， 組織切片觀察發(fā)現(xiàn)氧化魚油導(dǎo)致草魚腸道黏膜出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷； 腸道黏膜中具有較為完整的“Keap1-Nrf2-ARE”基因調(diào)控通路。腸道黏膜在受到氧化魚油的氧化損傷作用后， 激活了細(xì)胞的抗氧化損傷保護(hù)機(jī)制， 使NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路基因差異表達(dá)顯著性地上調(diào)， 并導(dǎo)致了下游的GSH/GSTs通路基因差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 促進(jìn)了GSH的生物合成和GSTs的抗氧化作用； 導(dǎo)致“Keap1-Nrf2-ARE”信號通路下游的熱休克蛋白和泛素-蛋白酶體通路基因差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 清除受損傷蛋白質(zhì)， 保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性。研究表明， 上述三類抗氧化應(yīng)激通路構(gòu)成了對腸道黏膜損傷細(xì)胞、損傷蛋白質(zhì)的降解系統(tǒng)和清除系統(tǒng)， 顯示其對腸道黏膜組織和黏膜細(xì)胞的保護(hù)、修復(fù)發(fā)揮了重要的作用。

草魚； 腸道黏膜； 氧化魚油； RNA-seq； Nrf2； GSH/GSTs； 泛素-蛋白酶體

油脂如魚油、豆油等是水產(chǎn)飼料中的主要能量物質(zhì)之一［1］， 而油脂中不飽和脂肪酸容易氧化酸敗， 其氧化產(chǎn)物如過氧化物、丙二醛等對養(yǎng)殖魚類如大西洋鮭（Salmo salar）［2］、草魚（Ctenopharyngodon idellus）［3］等的器官組織、魚體健康具有顯著的損傷作用， 其中損傷較大的器官組織為腸道黏膜［1， 4］。我們也分別研究了氧化豆油水溶物、丙二醛對草魚腸道離體黏膜細(xì)胞生長和結(jié)構(gòu)的影響， 均顯示出直接性的氧化損傷作用［5， 6］。魚體自身具備抗氧化損傷系統(tǒng)如谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)， 體內(nèi)也含有抗氧化物質(zhì)如維生素E［4］， 以便清除有毒有害物質(zhì)等， 保護(hù)細(xì)胞和組織免受進(jìn)一步的損傷打擊作用［4， 7］。灌喂氧化魚油可以在短期內(nèi)對魚體腸道黏膜造成急性損傷， 利用急性損傷的腸道組織提取總RNA并采用RNA-seq方法完成核酸序列分析、基因注釋， 并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)差異分析、代謝途徑基因表達(dá)通路分析， 可以從基因表達(dá)層面，更為宏觀地了解氧化魚油對腸道黏膜組織整體性的損傷用、黏膜細(xì)胞對損傷的應(yīng)答。本實驗室已經(jīng)進(jìn)行了灌喂氧化魚油后草魚腸道黏膜膽固醇、膽汁酸代謝通路基因差異表達(dá)的分析， 結(jié)果表明灌喂氧化魚油導(dǎo)致草魚腸道黏膜組織膽固醇、膽汁酸合成通路基因差異表達(dá)整體上調(diào)， 顯示出膽固醇、膽汁酸合成在應(yīng)對氧化魚油損傷方面具有重要的作用［8］。本文主要分析了灌喂氧化魚油對草魚腸道黏膜組織抗氧化應(yīng)激通路基因的差異表達(dá)， 包括Keap1-Nrf2-ARE通路、GSH/GSTs系統(tǒng)、熱休克蛋白和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)基因的差異表達(dá)結(jié)果，對于了解腸道黏膜組織抗氧化損傷作用機(jī)制、對黏膜組織和細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 氧化魚油

以鳀和帶魚為原料提取、經(jīng)過精煉的精制魚油， 購自中國福建高龍實業(yè)有限公司。按照姚仕彬等［9］方法制備氧化魚油， 于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用常規(guī)方法測定魚油和氧化魚油的氧化指標(biāo)， 碘價（IV）分別為（67.19±3.32）和（61.99±4.03） g/ kg、酸價分別為（AV）（0.51±0.04）和（3.64±0.23） mg KOH/g、過氧化值（POV）分別為（10.86±1.26）和（111.27±2.85） meq/kg、丙二醛（MDA）分別為（7.50±1.600）和（72.20±10.0） μmol/mL。魚油經(jīng)過14d的氧化后， IV下降了7.74%， 而AV、POV、MDA分別增加了613.73%、924.59%和862.67%， 表明魚油已經(jīng)被深度氧化。

1.2 草魚及其氧化魚油灌喂方法

試驗草魚來自于江蘇常州養(yǎng)殖池塘， 用常規(guī)草魚飼料在室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖20d后， 選擇平均體重（108.4±6.2） g草魚42尾， 分別飼養(yǎng)于單體容積0.3 m3的6個養(yǎng)殖桶中， 每個養(yǎng)殖桶飼養(yǎng)7尾試驗草魚。設(shè)置魚油組和氧化魚油組、每組各3個平行。灌喂期間水溫（23±1）℃、溶解氧6.4 mg/L、pH7.2。

將魚油、氧化魚油分別與大豆磷脂（食品級）以質(zhì)量比4∶1的比例混勻、攪拌乳化， 作為灌喂用的魚油、氧化魚油， 于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選取內(nèi)徑2.0 mm的醫(yī)用軟管（長度5 cm）安裝在5 mL一次性注射器上， 作為灌喂工具。灌喂試驗開始前魚體停食24h， 將草魚用濕毛巾包住身體， 按照試驗魚體體重的1%分別吸取乳化后的魚油、氧化魚油， 待魚嘴張開時， 將灌喂軟管送入口中， 感覺到管口通過咽喉進(jìn)入食道時， 通過注射器注入魚油或氧化魚油。注射完畢后， 保持注射姿勢15—20s， 之后快速退出注射軟管， 將草魚放入養(yǎng)殖桶中。于每天上午9： 00對試驗魚定量灌喂， 下午投喂草魚飼料1次， 連續(xù)灌喂7d。

1.3 腸道黏膜腸道組織切片

在第7天灌喂后24h， 常規(guī)解剖取出腸道， 清除腸道外脂肪組織， 在腸道全長的1/2處， 按照組織學(xué)切片要求切出1 cm長的腸管， 生理鹽溶液清洗腸道。用苦杏仁酸固定腸道組織， 用冰凍切片機(jī)對腸道進(jìn)行切片， 切片厚度5 μm。蘇木精-伊紅染紅后，顯微鏡觀察腸道組織形態(tài)， 并照相。

1.4 腸道黏膜

在第7天灌喂后24h， 分別在氧化魚油組、魚油組的3個平行養(yǎng)殖桶中各取3尾、每組各9尾試驗草魚， 常規(guī)解剖、分離內(nèi)臟團(tuán)， 將腸道剖開， 浸于預(yù)冷PBS中漂洗2次， 之后轉(zhuǎn)入另一個預(yù)冷培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)皿置于冰盤上， 用手壓住前腸端、用解剖刀從前向后一次刮取得到黏膜， 裝入1.5 mL離心管中， 液氮速凍， 保存于-80℃?zhèn)溆?。每尾魚腸道黏膜獨立分裝、保存。

1.5 RNA提取

每尾試驗草魚腸道黏膜獨立用于提取總RNA。氧化魚油組、正常魚油組各9個腸道黏膜樣品， 按照總RNA提取試劑盒（NewBioIndustry）操作進(jìn)行。RNA提取后經(jīng)過電泳檢測RNA質(zhì)量， 在3個平行桶各取1尾、共3尾魚RNA質(zhì)量好的樣本（電泳條帶亮度高、清晰、無拖尾）進(jìn)行等量混合為1個樣本， 同樣方法再混合一個樣本， 其余的舍棄。魚油組、氧化魚油組分別得到2個（n=2）平行樣本、共4個混合RNA樣本， 分別用于RNA-seq?；旌虾蟮腞NA提取液輕輕吹打充分混勻后， 加入到專用的RNA保存管， 真空干燥， 一般60 μL干燥6—7h， 80 μL干燥9—10h。干燥樣品用于總RNA測序。

1.6 RNA鑒定、文庫構(gòu)建、Illumina測序和基因注釋

采用RNA納米生物分析芯片和量子比特套件（RNA Nano Bioanalysis chip and Qubit Kit）測定（儀器為Agilent 2100）氧化魚油組和正常魚油組RNA完整性和濃度， RNA完整性RIN （RNA Integrity Number）值分別為9.10和8.70； RNA濃度分別為190和121 ng/μL。

分別取等量（約2.5 μg）的氧化魚油組和正常魚油組草魚腸道黏膜RNA， 采用Illumina公司TruSeq 的RNA試劑盒制備cDNA文庫， PCR循環(huán)15次。利用Illumina的HiSeq2000進(jìn)行文庫的聚類和序列分析， 配對末端（PE）的讀段為50 bp。原始測序讀段中除去接頭序列、序列質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20、讀長序列小于30的短讀段后用于基因的從頭組裝?；虻膹念^組裝使用Brujin圖形方式進(jìn)行裝配（CLC Bioversion5.5）。轉(zhuǎn)錄組的注釋和基因定位是利用UniProtKB/ SwissPro和NCBI進(jìn)行基因top hits （E-value為1e-6）的BLAST檢索?；虻淖⑨尣捎?UniProtKB/ SwissProt數(shù)據(jù)庫（Blast2GO version 2.5.1）進(jìn)行。

魚油和氧化魚油組分別合并2個平行RNA樣本的試驗數(shù)據(jù)， 依據(jù)RNA-seq分析結(jié)果和基因表達(dá)分析結(jié)果做差異表達(dá)分析和IPA （Ingenuity Pathways Analysis）基因通路分析， 在CLC Genomics Work bench （version5.5）進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析， 映射參數(shù)分別設(shè)置為95%， P＜0.05。以正常組草魚結(jié)果為對照， 灌喂氧化魚油組基因具有顯著差異表達(dá)的界定條件為fold絕對值大于2、讀段數(shù)大于10。fold絕對值越大表明差異表達(dá)越顯著， 其絕對值大于3可視為具有顯著性的差異。依據(jù)P值和具有顯著差異表達(dá)基因數(shù)占通路基因總數(shù)的比例確認(rèn)基因通路。

2 結(jié)果

2.1 腸道組織切片觀察結(jié)果

灌喂魚油和氧化魚油7d后， 草魚腸道組織學(xué)切片觀察結(jié)果見圖 1。魚油組腸道絨毛頂端（→指示點）完整， 絨毛邊緣清晰。氧化魚油組腸道絨毛頂端已經(jīng)破裂、黏膜脫落。從絨毛的頂端開始向腸道壁基部的黏膜出現(xiàn)梯次性的破裂、脫落。結(jié)果顯示，氧化魚油對草魚腸道黏膜造成了嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)性損傷， 這種損傷作用是從絨毛頂端開始的， 造成絨毛頂端損傷最為嚴(yán)重。

圖 1 氧化魚油導(dǎo)致草魚腸道黏膜組織損傷Fig. 1 Experimental grass carp intestinal tissue

2.2 Keap1-Nrf2-ARE 通路基因差異表達(dá)

依據(jù)基因注釋結(jié)果， 結(jié)合Keap1-Nrf2-ARE 通路基因組成， 得到該通路的19個差異表達(dá)顯著的基因信息， 被注釋的基因序列與斑馬魚、草魚等物種同類基因的相似度在68.6%—97.1%。由表 1可知，草魚在灌喂氧化魚油后， Keap1-Nrf2-ARE通路上游基因在腸道黏膜中KEAP1 （fold為2.87）和Nrf2b （fold為2.26）都差異表達(dá)上調(diào)， 顯示出對下游抗氧化基因通路具有差異表達(dá)上調(diào)的可能性。

由該通路調(diào)控的下游多種抗氧化基因和II相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)果也顯示差異表達(dá)， 只是不同的基因差異表達(dá)程度不同。通過IPA （Ingenuity Pathways Analysis）基因通路分析， 其通路基因差異表達(dá)“-log （p-value）”為5.39， 具有顯著性差異； 組成通路的不同基因差異表達(dá)結(jié)果顯示， Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路中有10個基因（基因全名見表 1）HO1、MGST1、USP14、ABCC2、DNAJA4、GCLC、SQSTM1、DNAJB1、ABCC4、GSTω1差異表達(dá)的fold值＞3， 差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 僅有AOX1差異表達(dá)顯著下調(diào)（fold值＜-3）。

屬于II相解毒酶基因的NAD （P） H醌氧化還原酶1 （NQO1）（fold為-1.20）差異表達(dá)下調(diào)， 過氧化氫酶（fold為-1.37）差異表達(dá)下調(diào)， 而3種超氧化物歧化酶（SOD1 的fold為2.33、SOD2的fold為1.54、SOD3的fold為1.12）則差異表達(dá)上調(diào)； 溶菌酶（fold為-2.41）差異表達(dá)下調(diào)。

上述結(jié)果顯示， 在灌喂氧化魚油的急性刺激下，腸道黏膜細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制被激活， 產(chǎn)生顯著的基因表達(dá)應(yīng)答， 主要表現(xiàn)為Keap1-Nrf2-ARE抗氧化應(yīng)激通路基因顯著性地差異表達(dá)， 其中， 清除氧化損傷物質(zhì)如過氧化物基因表達(dá)上調(diào)、清除受到損傷的細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)等通路的下游基因差異表達(dá)顯著上調(diào)， 而細(xì)胞質(zhì)中II相解毒酶基因差異表達(dá)下調(diào)。這是典型的抗氧化應(yīng)激生理反應(yīng)， 也表明氧化魚油對草魚腸道黏膜的損傷為氧化性損傷。

2.3 蛋白質(zhì)泛素化通路

通過IPA （Ingenuity Pathways Analysis）基因通路分析， 顯示蛋白質(zhì)泛素化通路基因差異表達(dá)， 其通路基因差異表達(dá)的“-log （p-value）”為10.4， 其中有19個基因的fold值＞3.0或＜-3.0， 達(dá)到顯著性水平（表2）。該通路基因主要有PSMβ7、PSMα6b、USP14、PSMβ5、PSMC4、PSMb3、PSMc1、PSMd1、PSMc5、PSMb6、PSMc2、UBE2V2、USP14、UCHL1、HSP10、HSP90αA1、PSMd6、PSMα5、DNAJB1共19個基因（基因全名見表 2）的fold值＞3， 差異表達(dá)顯著性地上調(diào)； 僅有PSMβ9的fold值＜-3.0， 為差異表達(dá)顯著性地下調(diào)。上述基因序列與斑馬魚等物種相同基因的相似度為84.7%—99.1%。

上述結(jié)果顯示， 灌喂氧化魚油后， 草魚腸道黏膜組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生改變， 被熱休克蛋白（如HSP90αA1）、泛素標(biāo)記（如泛素結(jié)合蛋白P62）， 再激活蛋白酶系統(tǒng)（如26S蛋白酶體）并被分解， 以清除受到損傷的蛋白質(zhì)， 保護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。這也是黏膜細(xì)胞自我保護(hù)、對抗氧化魚油損傷的應(yīng)答。

表 1 草魚腸道黏膜Keap1-Nrf2-ARE和NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反通路基因Tab. 1 Keap1-Nrf2-ARE and NRF2-mediated oxidative stress response pathway genes in the intestinal mucosal of grass carp （Ctenopharyngodon idella）

2.4 谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶通路

通過IPA （Ingenuity Pathways Analysis）基因通路分析， 顯示谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSH/GSTS）基因差異表達(dá)， 其通路基因差異表達(dá)的“-log （pvalue）”為5.53， 達(dá)到顯著差異水平。其中， 控制谷胱甘肽生物合成的G6PD、GCLC、GCLM、GGT1、GSS、GSR、GST、GSTω1、GSTα、GSTpi、GSTθ1b、MGSt1、PGD、GPX1a共14個基因的fold值＞3.0， 差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 其基因序列與斑馬魚、草魚、鰱等物種相同基因序列的相似度為76.9%—96.4%（表 3）。

上述結(jié)果表明， 草魚灌喂氧化魚油后， 腸道黏膜中的谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的蛋白和酶基因的表達(dá)增強(qiáng)， 以便及時清除氧化損傷物質(zhì)， 保護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。

3 討論

本試驗是以正常魚油為對照， 在灌喂氧化魚油7d后， 采用RNA-seq方法［10， 11］， 即利用草魚腸道黏膜組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后， 通過核酸序列分析、基因拼接、基因注釋而獲得轉(zhuǎn)錄組基因信息，并與灌喂正常魚油腸道黏膜的結(jié)果對比進(jìn)行差異表達(dá)分析， 得到灌喂氧化魚油試驗組腸道黏膜基因的差異表達(dá)結(jié)果。首先， 能夠被注釋的基因都是已經(jīng)轉(zhuǎn)錄為RNA的基因， 即得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因； 其次， 得到的差異表達(dá)結(jié)果就是與正常魚油組對比的差異結(jié)果， 當(dāng)fold絕對值＞2時具有較顯著性的差異表達(dá)， 當(dāng)≥3時達(dá)到顯著差異水平， 如果fold值為正值表示是差異表達(dá)上調(diào)， 負(fù)值則為差異表達(dá)下調(diào)。

表 2 草魚腸道黏膜蛋白質(zhì)泛素化通路基因Tab. 2 Protein ubiquitination pathways in the intestinal mucosal of grass carp （Ctenopharyngodon idella）

3.1 灌喂氧化魚油導(dǎo)致草魚腸道黏膜抗氧化應(yīng)激基因差異表達(dá)上調(diào)

魚油氧化的產(chǎn)物包括過氧化物、游離脂肪酸、丙二醛等物質(zhì)， 對動物具有普遍的毒副作用［1， 2， 5］。Keap1-Nrf2-ARE通路是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激代謝通路［12—14］， 其主要生理作用是及時清除來自于外界的、或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化損傷物質(zhì)如氧自由基、過氧化物等， 是細(xì)胞內(nèi)的廣泛性抗氧化代謝途徑，保護(hù)多種細(xì)胞和組織免收氧化損傷， 維持機(jī)體氧化-抗氧化的生理平衡。

Keap1-Nrf2-ARE通路的反應(yīng)基本過程為， 在正常生理條件下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1 結(jié)合， 形成Nrf2-Keap1復(fù)合體， 并處于非活性狀態(tài)； 在受到細(xì)胞內(nèi)、外界自由基或化學(xué)物質(zhì)刺激時， Keap1 的構(gòu)象改變、或者Nrf2磷酸化被激活，導(dǎo)致Nrf2 與Keap1解離［12， 13］， Nrf2處于活化狀態(tài)； 活化的Nrf2由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核， 與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶（熱休克蛋白泛素化系統(tǒng)）、GSH/GST系統(tǒng)等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)， 以抵抗內(nèi)外界的有害刺激［12—14］， 成為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)制， 保護(hù)多種細(xì)胞和組織， 維持機(jī)體氧化-抗氧化的生理平衡。ARE是一個特異的DNA啟動子結(jié)合序列，是II相解毒酶和細(xì)胞保護(hù)蛋白基因表達(dá)的上游調(diào)節(jié)區(qū)，Nrf2是這一序列的激活因子［13， 14］。

表 3 草魚腸道黏膜谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶通路基因Tab. 3 GSH/GSTSMetabolism pathways in the intestinal mucosal of grass carp （Ctenopharyngodon idella）

在本試驗中， 作為NRF2誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激通路的主要組成部分， DNAJA4、DNAJB1與底物蛋白質(zhì)結(jié)合防止其聚合［13， 14］。USP14則通過對Ubiquitination 鏈的修剪防治基質(zhì)的降解。多藥耐藥相關(guān)蛋白ABCC4 （MRP4）、ABCC2 （MRP2）是重要的跨膜轉(zhuǎn)運解毒體系； 血紅素氧化合酶（HO-1）是血紅素降解的限速酶， HO1及其酶解產(chǎn)物直接影響抗氧化損傷能力的變化， 是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一。MGST1、GCLC、GSTω1作為II相代謝過程主要物質(zhì)［15］， 清除細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)和氧化物質(zhì)， 避免對DNA及生物功能蛋白的破壞， 以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這些基因差異表達(dá)均顯著上調(diào)， 表明草魚腸道受到氧化魚油急性損傷后， 使這些基因的表達(dá)增強(qiáng)， 腸道黏膜細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)， 以便清除魚油氧化產(chǎn)物， 尤其是受到魚油氧化產(chǎn)物損傷而導(dǎo)致死亡或凋亡的腸道黏膜細(xì)胞碎片、損傷蛋白質(zhì)等， 并參與修復(fù)細(xì)胞的損傷、保護(hù)其他細(xì)胞免受損傷， 是一種典型的抗氧化損傷與修復(fù)、保護(hù)生理機(jī)制。

依賴NAD （P） H醌氧化還原酶1是降解醌、醌亞胺、氮氧化合物的酶［15］， 其基因差異表達(dá)下調(diào)，溶菌酶基因差異表達(dá)下調(diào)， 以及依賴過氧化氫酶清除過氧自由基的基因差異表達(dá)下調(diào)， 而三種超氧化物酶SOD1、SOD2和SOD3清除過氧化物的基因均差異表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果顯示， 氧化魚油對草魚腸道黏膜的損傷不是產(chǎn)生過氧化氫、醌類有毒物質(zhì)損傷作用類型， 從前面的分析結(jié)果看， 屬于自由基為主的氧化損傷、蛋白質(zhì)直接性損傷的氧化損傷類型。

試驗表明， 在灌喂氧化魚油后， 作為“Keap1-Nrf2-ARE”信號調(diào)控的下游靶向通路， 谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSH/GSTs）代謝通路基因、熱休克蛋白和蛋白質(zhì)泛素化通路基因顯著性上調(diào)， 這些結(jié)果同時也表明： “Keap1-Nrf2-ARE”信號通路在轉(zhuǎn)錄水平參與了腸道黏膜細(xì)胞對氧化魚油損傷的應(yīng)激反應(yīng)， 表明在草魚腸道中存在Keap1-Nrf2-ARE通路所需要的主要基因， 并且在氧化魚油損傷下被激活。灌喂氧化魚油對草魚腸道的損傷作用是以氧化損傷、對細(xì)胞蛋白質(zhì)損傷為主要損傷類型。草魚腸道在受到氧化損傷后， 激活了多個抗氧化應(yīng)激基因通路以應(yīng)對氧化性損傷和對蛋白質(zhì)的損傷作用， 使NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)信號通路、GSH/GSTs系統(tǒng)、熱休克蛋白和蛋白質(zhì)泛素化通路基因等差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 以便清除氧化損傷物質(zhì)、修復(fù)氧化損傷細(xì)胞， 對黏膜組織、細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)和保護(hù)。

3.2 灌喂氧化魚油使草魚腸道黏膜谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶代謝通路基因差異表達(dá)上調(diào)

GSH/GSTs是動物重要的解毒、抗氧化系統(tǒng)［15］。在本試驗中， 涉及到GSH的合成系列酶、轉(zhuǎn)移解毒系列酶或蛋白質(zhì)的基因， 構(gòu)成了一個完整的GSH/ GSTs功能系統(tǒng)， 以谷氨酸、半胱氨酸為原料的谷胱甘肽合成途徑和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶通路示意圖見圖 2所示。GSH/GSTs系統(tǒng)的基因差異表達(dá)顯著，且均是顯著上調(diào)， 成為氧化魚油對腸道黏膜損傷后被激活的主要抗氧化損傷應(yīng)激作用系統(tǒng)之一。

圖 2 GSH/GSTs通路示意圖（黑體斜體為催化反應(yīng)的酶縮寫）Fig. 2 GSH/GSTs pathway （Italics is abbreviation of the enzyme）

谷氨酸-半胱氨酸合成酶（GCL）是GSH生物合成的限速酶［16］， 由催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM）組成， 其活性影響著GSH 合成的速度， 如果GCL 的活性增高， 則可使GSH 合成加速， 從而提高細(xì)胞內(nèi)外GSH 濃度。GSR保持了GSH處于還原狀態(tài)。本試驗中， 它們都差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 表明灌喂氧化魚油激活了GSH 合成速度。

GSH作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑， 一方面， GSH可直接單獨作用于許多自由基（如烷自由基、過氧自由基、半醌自由基等）， 另一方面， 作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物， 發(fā)揮清除細(xì)胞內(nèi)過氧化物的作用［15， 16］。GSH能夠把機(jī)體內(nèi)有害的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)， 排泄出體外， 減少氧化應(yīng)激對脂質(zhì)、DNA及蛋白質(zhì)造成損傷， 因此GSH通常被認(rèn)為是機(jī)體抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。本試驗中， GSH生物合成途徑控制反應(yīng)的酶的基因均達(dá)到顯著性的差異表達(dá)上調(diào)， GSH生物合成量增加是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激損傷、加強(qiáng)自我保護(hù)的重要途徑之一。表明草魚腸道在受到氧化魚油急性損傷后， 顯著性地刺激了腸道黏膜細(xì)胞GSH生物合成的強(qiáng)度， 合成了大量的GSH以用于抗氧化應(yīng)激的需要。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）有多個亞類， 如GST、GSTω1、GSTα、GSTpi、GSTθ1b、MGSt1等［15， 16］。在本試驗中， 這些亞類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的基因均達(dá)到差異表達(dá)顯著性的上調(diào)。GSTs 的主要功能是催化內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基（-SH）結(jié)合， 形成更易溶解的、沒有毒性的衍生物。例如， GSTω1是細(xì)胞內(nèi)降解生物異源物質(zhì)的一類酶， 能夠催化還原型谷胱甘肽上的硫原子親核攻擊底物上的親電子基團(tuán)，降低細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)水平。此外， GSTS 還可以結(jié)合一些親脂性化合物， 甚至還作為過氧化酶和異構(gòu)酶發(fā)揮作用。

上述結(jié)果顯示， 在灌喂氧化魚油后， 草魚腸道黏膜中的GSH/GSTs被激活， 通過清除自由基、過氧化合物等抗氧化應(yīng)激作用， 實現(xiàn)對腸道黏膜進(jìn)行保護(hù)。這個結(jié)果也顯示， 氧化魚油對草魚腸道黏膜的損傷類型為氧化性損傷作用。

3.3 灌喂氧化魚油使草魚腸道黏膜熱休克蛋白-蛋白質(zhì)泛素化通路基因差異表達(dá)上調(diào)

飼料油脂、或動物體內(nèi)脂質(zhì)（如細(xì)胞膜磷脂）氧化后可能產(chǎn)生丙二醛， 而丙二醛則通過其醛基（-CHO）與蛋白質(zhì)肽鏈中賴氨酸、精氨酸的ε-NH2發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)， 形成丙二醛-肽鏈復(fù)合體［17］， 導(dǎo)致這類蛋白質(zhì)變性、失去原有的生理功能， 形成對細(xì)胞蛋白質(zhì)的損傷作用。在動物體內(nèi)， 泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)較普遍的一種非依賴溶酶體的內(nèi)源蛋白降解方式， 主要是對損傷蛋白進(jìn)行識別、標(biāo)記和酶解， 是細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制。

當(dāng)細(xì)胞蛋白質(zhì)損傷后， 細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制將被激活， 如激活熱休克蛋白表達(dá)并對損傷蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記、或?qū)p傷的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化標(biāo)記， 之后通過蛋白酶體對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解。這里需要有2個主要過程， 首先是要將細(xì)胞不再需要的蛋白質(zhì)、或者受到損傷的蛋白質(zhì)進(jìn)行識別并進(jìn)行標(biāo)記，包括熱休克蛋白和蛋白質(zhì)泛素化來完成這類工作。熱休克蛋白主要有Hsp90、Hsp70、Hsp27等［18］， 主要作用是提高泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性， 對錯誤的、損傷的蛋白質(zhì)進(jìn)行識別和泛素化標(biāo)記， 而泛素連接酶也可以直接對錯誤的、損傷的蛋白質(zhì)進(jìn)行識別和泛素化標(biāo)記［19， 20］。之后， 依賴蛋白酶體的作用對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解， 所產(chǎn)生的氨基酸再被利用。蛋白酶體的主要作用是降解細(xì)胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)， 這一作用是通過斷裂肽鍵的化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)。這種包括泛素化和蛋白酶體降解的整個系統(tǒng)被稱為“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”［19， 20］。

在本試驗中， 依據(jù)通路分析方法， 泛素-蛋白酶體通路的-log （p-value）為10.4， 差異顯著。有19個基因進(jìn)入該通路。作為對錯誤或損傷蛋白質(zhì)的識別， 并完成泛素化標(biāo)記、包括對泛素化調(diào)控的生理反應(yīng)， 以熱休克蛋白識別和標(biāo)記為主的HSP10 （fold為7.08）、HSP90αA1 （fold為6.96）二種熱休克蛋白得到顯著性的差異表達(dá)上調(diào)； 以泛素化識別、標(biāo)記的UBE2V2 （fold為3.33）、USP14 （fold為3.24）、DNAJB1 （fold為15.24）也是差異表達(dá)顯著性的上調(diào)。關(guān)于被識別、標(biāo)記的損傷蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)過程中， PSMb3 （fold為4.89）、PSMβ7 （fold為5.48）、PSMβ5 （fold為4.54）、PSMc4 （fold為4.17）、PSMα6b （fold為3.88）、PSMc1 （fold為3.75）、PSMd1 （fold為3.71）、PSMc5 （fold為3.63）、PSMb6 （fold為3.56）、PSMc2 （fold為3.55）、PSMd6 （fold為3.22）、PSMα5 （fold為3.13）、UCHL1 （fold為9.44）等蛋白質(zhì)或酶， 是26S蛋白酶體的主要構(gòu)件物質(zhì)， 其主要作用是完成對識別、標(biāo)記蛋白質(zhì)的完全降解過程。在草魚腸道黏膜被氧化魚油損傷后， 均得到差異表達(dá)顯著性的上調(diào)。

上述結(jié)果表明， 草魚腸道黏膜在受到氧化魚油的嚴(yán)重氧化損傷后， 產(chǎn)生的大量的損傷細(xì)胞或損傷蛋白質(zhì)， 激活了腸道黏膜細(xì)胞中熱休克蛋白和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)， 并得到差異表達(dá)顯著性的上調(diào)， 以便清除這些損傷或錯誤的蛋白質(zhì)， 保護(hù)腸道黏膜組織和細(xì)胞。

4 結(jié)論

在魚油氧化后， 可產(chǎn)生自由基、過氧化物、丙二醛等產(chǎn)物， 對動物具有毒副作用。對草魚灌喂氧化魚油后， 腸道黏膜組織受到顯著損傷， 對腸道黏膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 草魚腸道黏膜組織中存在著完整的“Keap1-Nrf2-ARE”基因調(diào)控通路， 并激活了其下游通路-GSH/GSTs通路基因差異表達(dá)顯著性上調(diào)， 促進(jìn)了GSH的生物合成和GSTs的抗氧化作用； 同時， 也激活了“Keap1-Nrf2-ARE”通路下游的泛素-蛋白酶體通路基因差異表達(dá)及顯著性上調(diào)， 對損傷的細(xì)胞蛋白質(zhì)經(jīng)熱休克蛋白和泛素標(biāo)記后被26S蛋白酶體水解， 及時清除受損傷的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果也表明， Keap1-Nrf2-ARE信號通路在轉(zhuǎn)錄水平顯著地參與了對對氧化魚油導(dǎo)致的腸道黏膜病理損傷的應(yīng)答。依據(jù)參與氧化魚油損傷應(yīng)答的主要蛋白（酶）基因的差異表達(dá)結(jié)果， 表明氧化魚油誘導(dǎo)的草魚腸道黏膜損傷作用類型為以自由基、過氧化物、丙二醛等造成的損傷為主的氧化損傷和蛋白質(zhì)損傷是主要損傷類型； 而以激活溶酶體的蛋白降解機(jī)制、以清除過氧化氫或醌類有毒物質(zhì)損傷的解毒作用機(jī)制表現(xiàn)不顯著。

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EFFECTS OF OXIDIZED FISH OIL ON OXIDATIVE STRESS PATHWAYS OF INTESTINAL MUCOSA OF GRASS CARP （CTENOPHARYNGODON IDELLUS）

YE Yuan-Tu1， CAI Chun-Fang1， XU Fan1， LIN Xiu-Xiu1， HUANG Yu-Wei1，DONG Jiao-Jiao1， ZHANG Bao-Tong2and XIAO Pei-Zhen2
（1. Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition， School of Basic Medicine and Biological Science， Soochow University， Suzhou 215123， China； 2. Open Lab for Aquatic Animal Nutrition， Beijing Research Institute for Nutritional， Beijing 100000， China）

To evaluate effects of the oxidized fish oil on the antioxidative stress pathways of intestine， grass carp Ctenopharyngodon idellus were fed oxidized fish oil and normal fish oil for 7d before collecting intestinal mucosa for histology and RNA-seq. The gene differential expression， the gene annotation and IPA gene pathway were analyzed. Severe damage was observed in the intestine of grass carp by oxidized fish oil. The RAN-seq results indicated increased “Keap1-Nrf2-ARE” signal pathway and GSH/GSTs pathway by oxidized fish oil treatment. The heat shock proteins and ubiquitin - proteasome system genes were also significantly up-regulated. The activations of these three anti-oxidation pathway systems serve the main components to remove the damaged cells and decompose the harmful proteins，which play the essential roles to protect the intestinal mucosa tissue and its cells and to repair the intestinal mucosa response to the oxidation injury.

Grass carp Ctenopharyngodon idellus； Intestinal mucosa； Oxidized fish oil； RNA-seq； Nrf2； GSH/GSTs；Protein ubiquitination

S963.1

A

1000-3207（2016）04-0758-09

10.7541/2016.100

2015-07-06；

2015-12-10

國家自然基金（31172417）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31172417）］

葉元土， 教授； 研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。E-mail： yeyt@suda.edu.cn， Tel./Fax：+86-0512-65880179