馮碩恒 蔡佐楠 麥康森 艾慶輝

（中國海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 266003）

大黃魚CCTα基因的克隆及其表達(dá)量隨稚魚生長發(fā)育的變化

馮碩恒 蔡佐楠 麥康森 艾慶輝

（中國海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 266003）

研究旨在克隆大黃魚磷脂酰膽堿合成關(guān)鍵基因磷脂酰膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶α （CCTα）基因全長， 并檢測其表達(dá)量隨稚魚生長發(fā)育的變化。利用同源克隆技術(shù)和RACE技術(shù)從大黃魚肝臟中成功擴(kuò)增出CCTα的全長。同時(shí)應(yīng)用real-time PCR法檢測不同日齡大黃魚稚魚CCTα的表達(dá)變化。序列分析表明， CCTα全長2419 bp （GenBank登錄號(hào)： KF006239.1）， 包括273 bp 的5'端非編碼區(qū)， 1107 bp的開放閱讀框， 1010 bp的3'端非編碼區(qū)，共編碼369個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， 相比其他物種， 大黃魚CCTα基因與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系較近。定量結(jié)果表明， 孵化后， 大黃魚仔稚魚CCTα的表達(dá)量隨日齡的變化先顯著升高， 在15日齡時(shí)達(dá)到最大值，隨后顯著下降并趨于平穩(wěn)， CCTα基因表達(dá)量的變化趨勢與大黃魚稚魚消化系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。

大黃魚； 磷脂； 合成代謝； 個(gè)體發(fā)育； 磷脂酰膽堿胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶

磷脂又稱“極性脂”， 是分子中含有磷酸的復(fù)合脂， 是生物膜的重要功能成分， 也是動(dòng)植物細(xì)胞不可缺少的成分［1］。磷脂在水產(chǎn)動(dòng)物， 尤其是仔稚魚上起著極為重要的作用。首先， 磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分［2］， 對維持細(xì)胞膜功能的完善起著重要作用； 其次， 魚類利用極性脂的能力要高于中性脂，因此在胚胎和稚魚早期階段， 磷脂可以作為脂肪的一種可以提供能量［3—5］； 此外磷脂分解代謝還能產(chǎn)生類二十烷酸、二脂酰甘油和肌醇等生物活性物質(zhì)， 對維持魚類正常的生理活動(dòng)具有重要的意義［6］。目前， 國內(nèi)外諸多研究已證明外源添加磷脂對仔稚魚正常生長的必要性。然而， 磷脂分子的多樣性、磷脂代謝的復(fù)雜性以及仔稚魚階段研究的難度系數(shù)大等原因， 使得國內(nèi)水產(chǎn)動(dòng)物上磷脂代謝的研究較少。

磷脂酰膽堿（PC）是生物體內(nèi)含量最豐富的磷脂， 對維持生物正常的生命活動(dòng)起著重要的作用。高等動(dòng)物的肝臟可以通過胞苷三磷酸（CDP）-膽堿和磷脂酰乙醇胺（PE）途徑合成PC［7］。肝臟PC的合成中CDP-膽堿途徑合成的占70%［8， 9］， 而研究表明磷脂酰膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶（CCT）是CDP-膽堿途徑的關(guān)鍵酶［2］。在哺乳動(dòng)物中， CCT有三種亞型， 由兩個(gè)基因編碼而成， 分別是Pyct1a和Pyct1b， 其中Pyct1a編碼CCTα， Pyct1b在人類中編碼CCTβ1和CCTβ2， 在小鼠中編碼CCTβ2和CCTβ3， 其中主要表達(dá)的CCT亞型為CCTα［2］。Holub和Leslie等［10， 11］在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟微粒體和金魚（Carassius auratus L.）的腦中檢測到CCTα的活力。盡管磷脂從頭合成途徑在魚類上沒有得到廣泛的研究， 但是磷脂合成必需的酶和蛋白質(zhì)家族在紅鰭東方鲀 （Takifugu rubripes）和斑馬魚（Danio rerio）上都有報(bào)道［7］。因此， 磷脂酰膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶（CCTα）作為PC合成的限速酶在魚類上逐漸得到重視， 然而關(guān)于CCTα轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究依然較少。近年來， 隨著生物技術(shù)的發(fā)展， 在大西洋鮭Salmo salar （ACI34248.1）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（XP_003438043.1）、青鳉（Oryzias latipes） （XP_ 004079211.1）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）（XP_003975731.1）、斑馬魚（Danio rerio） （NP_ 001017634.1）和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）（KC477399.1）上克隆到CCTα基因。因此， 本實(shí)驗(yàn)克隆了大黃魚磷脂合成代謝關(guān)鍵酶CCTα的全長，從mRNA水平上分析了磷脂合成代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)量隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化， 為海水魚類仔稚魚發(fā)育階段磷脂酰膽堿合成調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚與管理

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為福建省寧德水產(chǎn)技術(shù)推廣站。所用魚苗為該推廣站人工繁育的大黃魚魚苗。試驗(yàn)期間所用海水經(jīng)室外蓄水池沉淀， 2級(jí)砂濾池濾過，進(jìn)育苗池前再經(jīng)過濾袋過濾。將3000尾剛孵化出的大黃魚魚苗平均分配到3個(gè)桶內(nèi)， 每個(gè)桶水容積約為500 L。從3—8日齡投喂輪蟲（Brachionus plicatilis）， 6—11日齡投喂鹵蟲無節(jié)幼體， 10—16日齡投喂鮮活橈足類， 之后到40日齡投喂冷藏橈足類，每天飽食投喂5次（06：00、08：30、12：00、14：30和17：00） 。在試驗(yàn)期間， 水溫22—23℃， pH 7.8—8.0，鹽度21‰—22‰。

1.2 取樣

在1、3、7、11、15、19、25、30、35 和40日齡分別從3個(gè)養(yǎng)殖桶內(nèi)隨機(jī)取50尾魚， 樣品保存在-80℃。在40日齡時(shí)， 隨機(jī)取6尾大黃魚仔稚魚的肝臟， 取后馬上置于液氮中， 并儲(chǔ)存于-80℃中， 用于CCTα基因的克隆。

1.3 RNA提取、cDNA合成和CCTα基因的克隆

大黃魚稚魚全魚及肝臟總RNA提取采用Trizol法， 通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性， 并用分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度及純度。采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄用PrimerScript RT?reagent Kit合成第一鏈。參考斑馬魚、大西洋鮭、尼羅羅非魚、青鳉、紅鰭東方鲀、人和鼠等物種的氨基酸序列， 利用CODHOP （http：//bioinformatics. weizmann.ac.il/blocks/codehop.html）設(shè)計(jì)兼并引物CCT 01F和CCT 01R （表 1）， 通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 克隆大黃魚CCTα核心片段。CCT 5'端和3'端非編碼區(qū)的擴(kuò)增采用特異性引物： CCT 02F和CCT 02R （表 1），并通過Clonetech SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒， 按照說明書進(jìn)行操作。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pEASY-T1載體上， 轉(zhuǎn)化為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞上， 挑選陽性克隆送往上海博尚生物科技有限公司（Shanghai， China）進(jìn)行測序。

表 1 本研究中用到的引物Tab. 1 Primers used in the study

1.4 序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用BLAST工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/）將克隆的基因在不同物種間進(jìn)行同源性比對分析， 并推斷其開放閱讀框和編碼的氨基酸序列。使用軟件TMHMM （http：www.cbs.dtu.dk/services）來預(yù)測基因的跨膜域。使用SMART （http：// smart.emblheidelberg.de/）和PROSITE軟件（http：// kr.expasy.org/prosite/）來預(yù)測氨基酸序列中的功能位點(diǎn)或氨基酸結(jié)構(gòu)域。使用ProtParam program （http：//www.expasy.ch/tools/protparam. html）來計(jì)算氨基酸序列的物理和化學(xué)參數(shù)。根據(jù)選擇的相關(guān)基因序列使用CLUSTAL X1.83［10］和MEGA 4.0［11］軟件來構(gòu)建物種間CCTα的物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。使用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹［12］。

1.5 CCTα的定量表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量PCR來檢測CCTα的表達(dá)量隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化。實(shí)時(shí)定量引物序列詳見表 1。

定量PCR體系如下： 上游引物（10 μmol/L） 1 μL；下游引物（10 μmol/L） 1 μL； 第一鏈cDNA 1 μL； 2× SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa， Japan） 12.5 μL；無菌水9.5 μL； 總體積25 μL。

定量儀器為實(shí)時(shí)定量PCR儀（Mastercycler ep realplex， Eppendorf， Germany）。實(shí)時(shí)定量的程序?yàn)椋?預(yù)變性階段95℃ 2min， 一個(gè)循環(huán)； 擴(kuò)增階段95℃ 10s， 58.7℃ 10s， 72℃ 20s， 共計(jì)40個(gè)循環(huán)。之后， 進(jìn)行熔解曲線反應(yīng)以檢驗(yàn)每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。對每一個(gè)稀釋模板， 都用目的基因和內(nèi)參基因的定量引物進(jìn)行擴(kuò)增得到CT值， 每個(gè)模板重復(fù)三次。以Lg （相對模板拷貝數(shù)）為橫坐標(biāo)， 以平均Ct為縱坐標(biāo)， 得到一條回歸直線。RT-qPCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率（Efficiency， E）可以從回歸直線上計(jì)算得到［E=10（-1/斜率）-1］。然后以Lg （相對模板拷貝數(shù)）為橫坐標(biāo)， 以平均ΔCt目的-內(nèi)參為縱坐標(biāo)， 建立目的基因和內(nèi)參基因的模板濃度梯度稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物的ΔCt曲線。通過判斷ΔCt曲線的斜率絕對值來判斷目的基因和內(nèi)參基因的E是否一致。在本實(shí)驗(yàn)中CCTα的擴(kuò)增效率為0.9461， β-actin的擴(kuò)增效率為0.9783。ΔCt1=（目的基因-β-actin）， 由于ΔCt1的絕對值為0.025， 約等于0， 表明目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致， 采用2-ΔΔCt方法測定目的基因的表達(dá)量［13］。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用SPSS 16.0 （SPSS， Chicago， IL， USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 在單因素方差分析（ANOVA）達(dá)到顯著水平時(shí)（P＜0.05）， 采用Tukey's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較， 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 基因序列特征分析

CCTα全長2419 bp， 含5'端非編碼區(qū)273 bp， 開放閱讀框（ORF） 1107 bp， 3'端非編碼區(qū)1010 bp， 共編碼369個(gè)氨基酸， 預(yù)測得到該氨基酸分子量為42.26 kD， 理論等電點(diǎn)6.69 （GenBank登錄號(hào)：KF006239.1）。PHD分析軟件預(yù)測， 該蛋白在8和197位點(diǎn)有兩個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)。在206位點(diǎn)有一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)， 在20、55、69、199、224、323和360位點(diǎn)有7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。在12、116、192、224、313和332位點(diǎn)有6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。在66位點(diǎn)存在cAMP和cGMP依賴型的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。在229位點(diǎn)存在一個(gè)N糖基化位點(diǎn)。

2.2 序列比對和進(jìn)化樹分析

推導(dǎo)的大黃魚CCTα氨基酸序列與其他魚類CCT的氨基酸序列具有極高的同源性。這些物種包括斑馬魚 Danio rerio （84.28%）、尼羅羅非魚（93.22%）、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes （92.68%）、大西洋鮭Salmo salar （87.53%）、半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis （90.79）和青鳉（92.58%）。與人類CCTα也有超過78%的相似性。然而， 大黃魚CCTα氨基酸序列與斑馬魚、紅鰭東方鲀、青鳉尼羅羅非魚和人類CCTβ的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)相似度都低于70%。系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)系顯示， 大黃魚CCTα氨基酸序列與上述魚類CCTα的氨基酸序列聚為一支，魚類CCTβ的氨基酸序列聚為另一支（圖 1）。因此，可以斷定本實(shí)驗(yàn)克隆到的大黃魚中的CCT確實(shí)屬于屬于α類型。

2.3 CCT表達(dá)量隨大黃魚稚魚生長發(fā)育的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 孵化后， 大黃魚仔稚魚CCTα的表達(dá)量隨日齡的變化先顯著升高后， 在15日齡時(shí)達(dá)到最大值， 隨后顯著下降并趨于平穩(wěn)（P＜0.05）（圖 2）。

3 討論

CCT是磷脂合成的關(guān)鍵限速酶， CCT的催化是磷脂合成過程中最慢的一步， 它決定磷酸膽堿的合成［2］。在哺乳動(dòng)物中， CCT有三種亞型， 由兩個(gè)基因編碼而成， 分別是Pyct1a和Pyct1b， 其中Pyct1a編碼CCTα， Pyct1b在人類中編碼CCTβ1和CCTβ2， 在小鼠中編碼CCTβ2和CCTβ3， 其中主要表達(dá)的CCT亞型為CCTα［2］由于CCTα的重要作用， 使得CCTα得到廣泛的研究， 但是多集中于高等動(dòng)物上。雖然在許多魚類上已經(jīng)克隆到CCTα基因序列， 但是關(guān)于CCTα調(diào)控的研究相對較少。本研究， 首次采用同源克隆和RACE技術(shù)克隆到大黃魚CCTα的全長。通過序列比發(fā)現(xiàn)N-端和C端差異較大， 而連接N-端和C-端的中間區(qū)域高度保守。從進(jìn)化樹上分析發(fā)現(xiàn)大黃魚CCT與其他魚類CCTα同屬一支， 而與CCTβ相聚較遠(yuǎn)， 證實(shí)克隆到的為大黃魚的CCTα。已有的研究發(fā)現(xiàn)， CCT基因包括核定位信號(hào)域、催化區(qū)域、膜結(jié)合區(qū)域（α螺旋）和磷酸化區(qū)域四部分［12， 13］。通過NLS Mapper軟件（http：//nls-mapper. iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_ form.cgi）預(yù)測發(fā)現(xiàn)， 本實(shí)驗(yàn)得到的大黃魚CCTα的核定位信號(hào)域可能在9—41個(gè)氨基酸處。除此之外， 還發(fā)現(xiàn)HxGH和RTEGISTS兩個(gè)高度保守的模序。HxGH是核苷酸轉(zhuǎn)移酶的象征［14］， 參與核苷酸的結(jié)合， 同樣的在胞苷酸?；D(zhuǎn)移酶中HxGH起著同樣的作用［15］。Veitch首次提出了HxGH在CCTα催化過程中的重要性［16， 17］。RTEGISTS在胞苷酸?；D(zhuǎn)移酶中也起著重要的作用， 它與HxGH環(huán)結(jié)合調(diào)節(jié)甘油三磷酸-胞苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈倪^渡狀態(tài)［18］。

圖 1 來自不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 1 Phylogenetic tree based the amino acid sequences of CCT and 30 other available CCT

大黃魚仔稚魚處于快速生長時(shí)期， 細(xì)胞分裂加快， 因此磷脂作為細(xì)胞膜的重要成分在保證細(xì)胞分裂以及組織生長中必然起到重要作用。目前， 有關(guān)CCTα的表達(dá)量隨仔稚魚生長發(fā)育變化的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中， 大黃魚仔稚魚CCTα的表達(dá)量在7日齡時(shí)逐漸升高， 在15日齡時(shí)達(dá)到最大， 之后顯著下降， 最后趨于平穩(wěn)。CCTα基因表達(dá)量的上升可能是大黃魚肝細(xì)胞分裂需要合成大量細(xì)胞膜的一種適應(yīng)性的調(diào)節(jié)。PC合成的最后一步是以甘油二酯和CDP-膽堿為底物， 在CPT催化下進(jìn)行。已有報(bào)道表明， 飼料脂肪中甘油三酯經(jīng)腸道脂肪酶水解后的產(chǎn)物甘油一酯重新?；螽a(chǎn)生的甘油二酯是PC合成的重要底物［20］。在15日齡以后， 大黃魚的生物餌料由鮮活橈足類變?yōu)楸r橈足類， 而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道冰鮮橈足類的營養(yǎng)成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如生物餌料， 尤其是脂肪含量偏低［21］， 這會(huì)導(dǎo)致大黃魚仔稚魚攝入的甘油三酯及偏低， 進(jìn)而減少其水解產(chǎn)物甘油一酯以及重?；a(chǎn)物甘油二酯。而甘油二酯缺乏可能導(dǎo)致CDP-膽堿的異常積累， 從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)CCT的表達(dá)， 這可能是導(dǎo)致CCTα表達(dá)量在15日齡以后顯著下降的原因。由此可見， 合適的餌料對維持大黃魚仔稚魚正常的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。

圖 2 大黃魚稚魚CCT基因表達(dá)量隨日齡的變化Fig. 2 The expression of CCT over time in larval large yellow croaker

綜上所述， 本文首次在大黃魚上克隆到PC合成關(guān)鍵酶CCTα cDNA的全長， 并檢測了CCTα轉(zhuǎn)錄水平隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化。研究表明，CCTα轉(zhuǎn)錄水平在大黃魚仔稚魚發(fā)育過程中的變化情況可以作為大黃魚仔稚魚發(fā)育及餌料利用情況的輔助指標(biāo)。

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MOLECULAR CLONING AND GENETIC ONTOGENY OF CCTα DURING THE DEVELOPMENT OF LARGE YELLOW CROAKER LARVAE （LARIMICHTHYS CROCEA）

FENG Shuo-Heng， CAI Zuo-Nan， MAI Kang-Sen and AI Qing-Hui
（The Key Laboratory of Mariculture （Ministry Education of China）， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）

In the present study， the full length of CCTα （CTP： choline phosphate cytidylyltranferase） cDNA from large yellow croaker （Larimichthys crocea） was obtained by homology-based cloning and rapid amplification of cDNA ends （RACE） techniques. Sequence analysis showed that the full length of CCTα cDNA （GenBank accession No. KF006240.1） was 2419 bp， which consisted of 1107 bp open-reading frame （ORF） encoding 369 amino acids， a 273 bp 5'-untranslated region （5'UTR） and a 1010 bp 3'-untranslated region （3'UTR）. Phylogenetic tree analysis showed that the CCTα gene of large yellow croaker had a closer relationship with Takifugu rubripes than others. The expression of CCTα increased significantly at first， and then decreased， and peaked at 15 day after hatching. The genetic ontogeny of CCTα was related to the development of large yellow croaker digestive system.

Large yellow croaker； Phospholipid； Anabolism； Development； Choline phosphate cytidylyltranferase （CTP）

Q344+.1

A

1000-3207（2016）04-0752-06

10.7541/2016.99

2016-02-29；

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金“大黃魚仔稚魚磷脂營養(yǎng)代謝研究”（31172425）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China “Study on Phospholipids Metabolism of Large Yellow Croaker Larvae” （Grant No. 31172425）］

馮碩恒（1988—）， 男， 山東濰坊人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料。E-mail： bdwgl@126.com

艾慶輝， 教授； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料。E-mail： qhai@ouc.edu.cn