劉經(jīng)緯 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 周慧慧 艾慶輝

（中國海洋大學農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室， 中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 青島 266003）

谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚非特異性免疫相關(guān)酶活力和低氧應(yīng)激后HIF-1α表達的影響

劉經(jīng)緯 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 周慧慧 艾慶輝

（中國海洋大學農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室， 中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室， 青島 266003）

為探討飼料中谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚非特異性免疫以及低氧應(yīng)激后HIF-1α表達的影響， 實驗共設(shè)計了4種谷氨酰胺添加量分別為0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微顆粒飼料（游離谷氨酰胺測定值分別為0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%）， 飼喂35日齡半滑舌鰨稚魚［平均干重（10.64±0.86） mg］。每天飽食投喂5次，養(yǎng)殖周期30d， 養(yǎng)殖結(jié)束后進行低氧應(yīng)激實驗。研究結(jié)果表明， 谷氨酰胺添加量為0.5%時半滑舌鰨稚魚魚體溶菌酶（LZM）活力顯著高于未添加組（P＜0.05）。飼料中不同谷氨酰胺水平對魚體總一氧化氮合酶（TNOS）活力和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活力沒有顯著影響（P＞0.05）。實驗克隆了半滑舌鰨低氧應(yīng)激關(guān)鍵基因——缺氧誘導因子1α （HIF-1α）， 得到749 bp半滑舌鰨HIF-1α核心序列， 系統(tǒng)進化樹分析表明半滑舌鰨HIF-1α氨基酸序列與大部分魚類具有較高同源性。定量PCR結(jié)果顯示， 飼料中谷氨酰胺水平對低氧應(yīng)激后半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團HIF-1α表達量未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。綜上所述， 在飼料中添加谷氨酰胺能夠顯著增強半滑舌鰨稚魚魚體溶菌酶活力（P＜0.05）， 提高非特異性免疫水平。

谷氨酰胺； 半滑舌鰨； 仔稚魚； 非特異性免疫； HIF-1α； 基因克隆及定量

“條件必需氨基酸”谷氨酰胺（Glutamine）是機體內(nèi)含量豐富的一種氨基酸， 在供能、蛋白質(zhì)和核苷酸合成、免疫以及抗氧化等生理活動中發(fā)揮著重要的功能［1—5］。有關(guān)谷氨酰胺對哺乳動物免疫作用的研究較為深入， 近年來， 谷氨酰胺在魚類免疫中的應(yīng)用成為研究熱點之一。仔稚魚階段的主要免疫方式為非特異性免疫［6］。溶菌酶是非特異性免疫防御中重要的組成部分， 其活力可以從一定程度上反映機體非特異性免疫水平［7］。此外， 一氧化氮（NO）作為一種由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的分子， 除了參與細胞內(nèi)和細胞間的信號調(diào)節(jié)以外， 還在抵御病原菌方面發(fā)揮著重要的免疫功能［8］。在美國紅魚（Sciaenops ocellatus）、雜交鱘（Acipenser schrenckii × Huso dauricus）和建鯉（Cyprinus carpio var. Jian）幼魚中的研究發(fā)現(xiàn)， 在飼料中添加適量谷氨酰胺能夠增強頭腎巨噬細胞溶菌酶活力， 提高血清C3和 C4補體水平， 調(diào)節(jié)頭腎和脾臟中細胞因子的基因表達［9—11］。但是有關(guān)谷氨酰胺對仔稚魚非特異性免疫功能影響的研究還十分缺乏， 且作用機理并不明確。

低氧應(yīng)激是仔稚魚工廠化養(yǎng)殖過程中的潛在威脅之一， 適宜的營養(yǎng)狀況有助于維持魚體健康，增強免疫水平并提高機體抗應(yīng)激能力［12］。缺氧誘導因子1 （HIF-1）是由缺氧誘導產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子， 在低氧應(yīng)答的調(diào)控機制中起著核心作用， 可以通過控制相關(guān)基因表達來調(diào)節(jié)葡萄糖運輸、糖酵解和血紅細胞生成等生理過程從而增強機體對低氧的耐受性［13， 14］。HIF-1由α和β兩個亞基組成， HIF-1β在細胞內(nèi)呈結(jié)構(gòu)性表達， 不受細胞氧濃度的調(diào)節(jié)，HIF-1α在低氧條件下大量表達， 是HIF-1的活性亞基［15］。相較于哺乳動物而言， 魚類HIF-1的研究十分有限， 有關(guān)飼料中谷氨酰胺對魚類HIF-1α表達的影響的研究還未見報道。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是我國海水養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟魚類， 由于其肉質(zhì)細膩，營養(yǎng)豐富， 野生資源十分缺乏， 因而具有極高的經(jīng)濟價值。但是半滑舌鰨仔稚魚階段， 由于免疫系統(tǒng)發(fā)育并不完善、抗應(yīng)激能力較弱， 因而死亡率較高。本實驗旨在探討在飼料中添加不同水平的谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚非特異性免疫相關(guān)酶活力以及低氧應(yīng)激后HIF-1α mRNA表達影響， 闡明谷氨酰胺在魚類營養(yǎng)免疫中的作用機制， 為提高半滑舌鰨仔稚魚成活率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗飼料配方以劉峰等［16］對半滑舌鰨微顆粒飼料開發(fā)的研究結(jié)果為基礎(chǔ)并改進而成。以低溫白魚粉、磷蝦粉、肉骨粉、魷魚粉和魚肉水解蛋白作為主要蛋白源， 魚油和大豆卵磷脂作為脂肪源，分別添加0、0.5%、1.0%和2.0%的谷氨酰胺， 并用甘氨酸調(diào)節(jié)總蛋白水平保持一致， 配制成4種等氮等脂的飼料。谷氨酰胺購自青島福林生物技術(shù)有限公司（中國青島）， 純度≥99%（表 1）。實驗飼料的制作采用微黏合技術(shù)， 將所有原料經(jīng)超微粉碎后充分混勻， 混勻的過程中搓入水、魚油和大豆卵磷脂，隨后制成顆粒飼料并恒溫干燥， 最后將所得的顆粒飼料再破碎后過篩， 得到適宜粒徑的實驗飼料， 并儲存在-20℃冰箱中備用， 以防止脂質(zhì)過氧化。

表 1 實驗基礎(chǔ)飼料配方及化學組成（% 干物質(zhì)）Tab. 1 Formulation and proximate analysis of the experimental diets （% dry matter）

1.2 實驗動物與養(yǎng)殖條件

實驗在山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司進行，所用魚苗為該場人工繁殖的35日齡半滑舌鰨稚魚［平均干重（10.64±0.86） mg］。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個桶內(nèi)魚苗150尾（養(yǎng)殖桶規(guī)格為65 cm×65 cm× 90 cm， 水容積約200 L）。養(yǎng)殖期間， 采用循環(huán)水系統(tǒng)， 水溫25—26℃， pH 7.8—8.0， 鹽度29‰—30‰，氨氮含量≤0.19 mg/L。每天飽食投喂5次（6：00，9：00， 14：00， 18：00和21：00）， 養(yǎng)殖周期30d。

1.3 應(yīng)激實驗

在30d養(yǎng)殖實驗結(jié)束時， 從每個養(yǎng)殖桶中隨機撈取8尾半滑舌鰨稚魚， 放入裝滿海水的600 mL密封絲扣瓶中。當50%稚魚死亡時， 將其余存活的稚魚在冰面上解剖出內(nèi)臟團并用1.5 mL無RNA酶的離心管收集， 迅速放入液氮中， 隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲存以備隨后進行基因表達分析。

1.4 取樣與解剖

在實驗結(jié)束后， 停食24h以充分排空腸道內(nèi)容物后取樣， 全部魚苗用2 mL和5 mL離心管液氮冷凍隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲存保存?zhèn)溆?。在進行酶活力分析時， 將半滑舌鰨稚魚全魚稱重后， 用0℃的生理鹽水（pH 7.4）勻漿， 全魚組織（g）和生理鹽水（mL）的比例為1∶9。隨后全魚勻漿在3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min， 收集離心后的勻漿上清液， 用于隨后的分析。

1.5 分析方法

非特異性免疫相關(guān)酶活力分析 半滑舌鰨稚魚魚體溶菌酶（LZM）檢測方法（濁度比色法）參考Ellis［17］的方法； 以磷酸緩沖液（pH， 6.1）配制微壁溶球菌（Micrococcus lysodeikticus， Sigma， USA）懸液作反應(yīng)底物， 組織勻漿與菌懸液按1∶19混合，25℃水浴反應(yīng)10min后， 測定530 nm波長下一段時間內(nèi)吸光值的變化， 每隔 1min 讀數(shù)一次。LZM活力的測定結(jié)果表示為U/mg·protein， 每個活力單位（U）定義為每毫克可溶蛋白每分鐘使吸光值降低0.001的倍數(shù)。

一氧化氮合酶（NOS）測定操作按照試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所， 中國南京）。測定原理根據(jù)NOS可催化L-Arg和分子反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物， 在530 nm波長下測定吸光度， 根據(jù)吸光度大小可計算出NOS活力。NOS主要有兩種類型——結(jié)構(gòu)型（cNOS）和誘導型（iNOS）。cNOS主要存在于神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞內(nèi)， 依賴鈣； iNOS主要存在于巨噬細胞內(nèi)， 不依賴鈣。根據(jù)此原理可以測定分型。NOS活力測定結(jié)果表示為U/mg·protein， 將每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO定義為一個酶活力單位（U）。

蛋白濃度的測定參照Bradford［18］的方法， 用牛血清蛋白（BSA，A-2153，Sigma， USA）作底物。

RNA提取、cDNA合成和缺氧誘導因子1α （HIF-1α）核心片段的克隆 半滑舌鰨內(nèi)臟團總RNA提取按照Trizol法， 并將提取RNA用DNase （TaKaRa， Japan）處理去除其中殘留DNA。利用NanoDrop ND-1000核酸分析儀（Wilmington， DE）測定RNA的質(zhì)量和濃度， 并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit （PerfectRealTime）（TaKaRa， Japan）試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

參考許氏平鲉（Sebastes schlegelii）（GenBank No. KC918362.1）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）（GenBank No. DQ171936.2）、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）（GenBank No. AY735010.1）、細須石首魚（Micropogonias undulates）（GenBank No. DQ363931.1）、金頭鯛（Sparus aurata）（GenBank No. JQ308830.1）、川鰈（Platichthys flesus） （GenBank No. EF100709.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（GenBank No. NM_001124288.1）、大西洋鮭（Salmo salar）（GenBank No. BT059247.1）的HIF-1α核苷酸序列， 利用Primer Premier 5.0 設(shè)計HIF-1α的簡并引物（表 2）。

表 2 本實驗中所用到的引物序列Tab. 2 Primers used in the current study

HIF-1α PCR擴增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler gradient （Eppendorf， German）中進行， 反應(yīng)程序設(shè)定： PCR 反應(yīng)程序設(shè)置依次為： 94℃ 3min （預(yù)變性， 1個循環(huán)）； 94℃ 30s （變性）， 58℃ 30s （退火），72℃ 1min （延伸）， 30次循環(huán)； 72℃ 10min （終延伸，1個循環(huán)）。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；目的片段產(chǎn)物經(jīng)EazyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒回收并連接到pEasy-T1載體（TransGen Biotech， China）； 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Escherichia coli TOP10中； 固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜； 經(jīng)菌落PCR后， 挑選4個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序， 在NCBI上BLAST比對測序結(jié)果。

序列分析 用DNAMAN對HIF-1α克隆片段進行氨基酸序列預(yù)測， Clustal X 進行氨基酸序列的多重比對分析后， 用MEGA4.0軟件的Neighbour-Joining法（1000 runs）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

HIF-1α實時熒光定量 根據(jù)克隆所得HIF-1α核心片段設(shè)計出特異性引物（表 2）， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參， 進行定量PCR。反應(yīng)體系為25 μL， 其中上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL， 模板cDNA 1 μL， 2×SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa， Japan） 12.5 μL和9.5 μL的無菌水。定量PCR的程序設(shè)定為95℃， 2min， 1個循環(huán)； 95℃， 10s，58.7℃ 10s， 72℃， 20s， 40個循環(huán)； 之后進行熔解曲線以檢驗每個PCR反應(yīng)只有1個PCR產(chǎn)物。通過制作濃度標準曲線來進行的基因和內(nèi)參基因擴增效率一致性檢驗， 擴增效率的計算公式E=10（-1/Slope）-1 （Slope為斜率）。在本實驗中， HIF-1α和GAPDH的擴增效率分別為0.9884和0.9494。采用2-ΔΔCt方法計算HIF-1α的相對表達量［19］。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析， 在單因素方差分析（one-way ANOVA）達到顯著水平（P＜0.05）時， 采用Tukey's檢驗進行多重比較， 數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。

2 結(jié)果

2.1 非特異性免疫相關(guān)酶活力

LZM活力 不同的谷氨酰胺添加水平顯著影響了半滑舌鰨稚魚魚體LZM活力（P＜0.05）。魚體LZM活力最高值出現(xiàn)在0.5%添加組， 顯著高于未添加組（P＜0.05）， 但與1.0%和2.0%添加組沒有顯著差異（P＞0.05， 圖 1）。

圖 1 飼料中添加谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚全魚溶菌酶活力的影響Fig. 1 Effects of dietary glutamine supplementation on activities of lysozyme in whole body of C. semilaevis post larvae

NOS活力 飼料中游離谷氨酰胺含量為0、0.5%、1.0% 和2.0%時， 半滑舌鰨稚魚魚體總一氧化氮合酶（TNOS）活力分別為1.06、1.81、1.09和1.54 U/mg·protein （圖 2）， iNOS活力分別為0.81、1.42、1.00和1.11 U/mg·protein （圖 3）。但是， 不同谷氨酰胺添加組半滑舌鰨稚魚魚體TNOS和iNOS活力均沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖 2 飼料中添加谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚全魚總一氧化氮合酶活力的影響Fig. 2 Effects of dietary glutamine supplementation on total activities of nitric oxide synthase in whole body of C. semilaevis post larvae

2.2 半滑舌鰨HIF-1α核心片段的克隆、序列分析及定量表達

HIF-1α核心片段的克隆和序列分析 片段克隆得到HIF-1α核心序列749 bp， 序列已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫， GenBank Accession No. KP723543。通過BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨HIF-1α核苷酸序列與大黃魚（Larimichthys crocea）（GenBank No. KM593915.1）相似性最高， 為94%； 與南極冰魚（Chaenocephalus aceratus）（GenBank No. GU362090.1）的相似度為90%； 與鰱（Hypophthalmichthys molitrix）（GenBank No. HM146310.1）的相似度為81%； 與齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）（GenBank No. KJ679876.1）的相似度為77%； 與林蛙（Rana temporaia）（GenBank No. EU262663.1）相似度為77%。

圖 3 飼料中添加谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚全魚誘導型一氧化氮合酶活力的影響Fig. 3 Effects of dietary glutamine supplementation on activities of inducible nitric oxide synthase in whole body of C. semilaevis post larvae

將克隆的HIF-1α部分核酸序列經(jīng)DNAMAN翻譯， 得到半滑舌鰨HIF-1α氨基酸序列片段（249個氨基酸）， BLASTP分析得到半滑舌鰨HIF-1α氨基酸片段與點帶石斑魚（GenBank No. AAW29027.1）的相似度最高， 為71%； 與短頭壯綿鳚（Pachycara brachycephalum） （GenBank No. AAZ52828.1）的相似度為70%； 與河鱸（Perca fluviatilis）（GenBank No. ABO26717.1）的相似度為69%； 金頭鯛（GenBank No. AFV39804.1）的相似度為68%， 與大西洋鮭（GenBank No. ACN10960.1）的相似度為61%； 與南極冰魚（GenBank No. ADC55888.1）的相似度為54%；與人（Homo sapiens）（GenBank No. NP_851397.1）的相似度為48%； 與山羊（Capra hircus）（GenBank No.AEW10558.1）、家兔（Oryctolagus cuniculus）（GenBank No. NP_001076251.1）的相似度為47%；與小鼠（Mus musculus）（GenBank No. AAC53455.1）的相似度為46%。

根據(jù)半滑舌鰨與其他9種脊椎動物HIF-1α氨基酸序列構(gòu)建脊椎動物NJ系統(tǒng)進化樹， 半滑舌鰨HIF-1α與大西洋鮭、點帶石斑魚和金頭鯛、河鱸等其他魚類分聚一支； 人、山羊和小鼠等哺乳動物分聚為一支， 禽類聚為另一支（圖 4）。

圖 4 根據(jù)Neighbour-Joining法（1000 runs）構(gòu)建的HIF-1α氨基酸序列進化樹Fig. 4 A phylogenetic tree constructed by Neighbour-joining method （1000 runs） for amino acid sequences of HIF-1α

低氧應(yīng)激后舌鰨內(nèi)臟團HIF-1α的表達量

低氧應(yīng)激后各處理組半滑舌鰨內(nèi)臟團HIF-1α mRNA相對表達量接近， 雖然在未添加組表達量較高， 但各處理組之間HIF-1α mRNA表達量差異不顯著（P＞0.05， 圖 5）。

圖 5 飼料中添加谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚低氧應(yīng)激后內(nèi)臟團HIF-1α的影響Fig. 5 Effects of dietary glutamine supplementation on HIF-1α mRNA expression in visceral mass of post larval C. semilaevis

3 討論

3.1 谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚非特異性免疫相關(guān)酶活力的影響

營養(yǎng)和免疫密切相關(guān)， 通過營養(yǎng)調(diào)控來提高魚體抗病力已被證明是一種行之有效的方法［12］。已有研究結(jié)果顯示， 谷氨酰胺可以促進魚類生長、改善腸道結(jié)構(gòu)， 并且在提高免疫力方面具有良好功效［9， 10， 20—23］。溶菌酶和補體等其他一些因子作為魚體非特異性免疫的組成部分， 對殺滅病原菌具有重要作用。Cheng等［9， 21］的研究結(jié)果表明飼料中添加谷氨酰胺能夠提高美國紅魚和雜交鱘（Morone chrysops × M. saxatilis）幼魚頭腎巨噬細胞中的溶菌酶活力； Zhu等［10］的研究得到類似結(jié)論， 發(fā)現(xiàn)飼料中添加丙氨酰-谷氨酰胺二肽對雜交鱘（A. schrenckii× H. dauricus）幼魚血清溶菌酶活力具有促進作用。在本實驗中， 谷氨酰胺添加水平為0.5%時魚體溶菌酶活力顯著高于未添加組（P＜0.05）， 說明谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚的非特異性免疫能力也具有一定的促進作用， 與在幼魚中的研究結(jié)論一致。

iNOS可以在致炎因子的刺激下迅速表達并產(chǎn)生大量NO， 從而起到殺菌作用［8］。Wei等［24］的研究表明， iNOS基因突變小鼠對寄生蟲（Leishmania major）的感染率較高， 由角叉藻引起的非特異性抗炎反應(yīng)降低。值得注意的是， NO雖然可以殺滅病原菌， 但是如果濃度過高、持續(xù)時間過長則會引起DNA損傷， 線粒體呼吸抑制等［25］。谷氨酰胺對NO的合成起著重要的調(diào)控作用， 能夠劑量依賴性抑制精氨酸生成NO過程［26］。已有研究表明， 在斑點叉尾鮰巨噬細胞培養(yǎng)液中加入精氨酸和/或谷氨酰胺能夠促進其產(chǎn)生NO［27］。本實驗室先前在大菱鲆中的研究發(fā)現(xiàn)， 飼料中精氨酸和谷氨酰胺水平對大菱鲆幼魚血清和肝臟中的iNOS活力的影響存在顯著交互作用（P＜0.05）， 可以促進或抑制iNOS活力［28］。然而，在本實驗中， 飼料中谷氨酰胺水平對半滑舌鰨稚魚魚體TNOS和iNOS活力均沒有顯著影響。推測本實驗的研究結(jié)果與先前研究結(jié)論不一致的原因， 可能與取樣時間點的差異有關(guān)。此外， 實驗動物不同，生長階段、環(huán)境因子、生理狀態(tài)和代謝水平等也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

谷氨酰胺提高動物非特異性免疫能力的作用機理在哺乳類中的研究較為深入， 研究表明谷氨酰胺可以通過促進淋巴細胞增殖和激活巨噬細胞功能來增強哺乳動物的免疫力［29—32］， 但在魚類中相關(guān)研究還十分有限。已有研究表明， 谷氨酰胺可以提高血清補體水平［10， 11］， 提高中性粒細胞氧化自由基產(chǎn)量、頭腎巨噬細胞胞內(nèi)和胞外超氧陰離子濃度［9］。在本實驗中， 飼料中添加0.5%谷氨酰胺顯著增強了魚體LZM的活力， 推測谷氨酰胺對溶菌酶活力的提升作用機制可能與在哺乳動物中相似， 與促進淋巴細胞增殖和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子有關(guān)［10］。脾臟是魚類重要的免疫器官， Hu等［11］研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加谷氨酰胺后上調(diào)了建鯉幼魚脾臟中TOR的磷酸化水平， 提高了脾臟蛋白質(zhì)含量。谷氨酰胺對魚類免疫作用研究的具體機制還需要進一步探討。

3.2 半滑舌鰨HIF-1α基因克隆以及谷氨酰胺對半滑舌鰨稚魚低氧應(yīng)激后HIF-1α mRNA表達的影響

低氧應(yīng)激所引起的相關(guān)基因表達的變化是魚體適應(yīng)低氧環(huán)境的重要途徑。常氧條件下， HIF-1α在翻譯后即被泛素-蛋白酶水解復(fù)合體降解， 在缺氧條件下HIF-1α降解被抑制并與HIF-1β結(jié)合形成二聚體HIF-1， HIF-1可以轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄［15］。Soitamo等［33］在虹鱒中第一次克隆到魚類的HIF-1α基因序列， 隨后其他學者陸續(xù)在虹鱒、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、波紋絨須石首魚（Micropogonias undulatus）、斑馬魚、團頭魴（Megalobrama amblycephala）、歐洲鱸、胭脂魚（Chinese sucker）等魚種中克隆到了HIF-1α基因［34—39］。Blast比對結(jié)果顯示， 本實驗中所克隆到的半滑舌鰨HIF-1α基因序列片段與大部分魚類具有較高的相似性。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示舌鰨HIF-1α氨基酸序列與大西洋鮭的進化地位最近， 并且與其他魚類緊密聚為一支， 與哺乳類和禽類的進化關(guān)系較遠。

在本實驗中， 飼料中不同谷氨酰胺水平對低氧應(yīng)激后舌鰨內(nèi)臟團HIF-1α mRNA表達量的影響不顯著， 出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是由于HIF-1α在轉(zhuǎn)錄水平上不受營養(yǎng)調(diào)控［40， 41］， 具體谷氨酰胺是否能在轉(zhuǎn)錄后水平上影響低氧應(yīng)激后半滑舌鰨HIF-1α的表達還需要進一步的研究探討。

綜上所述， 飼料中添加谷氨酰胺能夠顯著增強半滑舌鰨稚魚魚體溶菌酶活力（P＜0.05）， 提高非特異性免疫水平， 但是飼料中谷氨酰胺水平對低氧應(yīng)激后半滑舌鰨稚魚HIF-1α mRNA表達量影響不顯著（P＞0.05）。

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EFFECTS OF DIETARY GLUTAMINE ON ACTIVITIES OF NON-SPECIFIC IMMUNE RELATED ENZYMES AND HIF-1α EXPRESSION AFTER HYPOXIA OF HALF-SMOOTH TONGUE SOLE POST LARVAE

LIU Jing-Wei， MAI Kang-Sen， XU Wei， ZHANG Yan-Jiao， ZHOU Hui-Hui and AI Qing-Hui
（Key Laboratory of Mariculture， Certificated by Education Ministry of China， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）

To investigate effects of dietary glutamine on activities of non-specific immune related enzymes and antihypoxia stress capacity of half-smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevis Günther） post larvae， four isonitrogenous and isolipidic experimental diets supplemented with 0， 0.5%， 1.0% and 2.0% gluta-mine （with dietary free glutamine estimated to be about 0.03%， 0.46%， 0.91% and 1.73%） were formulated and fed 5 times per day to C. semilaevis post larvae （35 days after hatching， 10.64±0.86 mg dry weight） for 30 days before hypoxia stress test. Results revealted that the 0.5% glutamine supplemented diet significantly increased activities of lysozyme in fish whole body compared to the control group （P＜0.05）， but different glutamine level did not impact the activities of total nitric oxide synthase and inducible nitric oxide synthase in fish whole body （P＞0.05）. C. semilaevis HIF-1α gene were cloned and 749 bp partial cDNA sequence were obtained， which shared high identities with many other fish species. Quantitative Real-time PCR showed that glutamine supplementation did not regulate the expressions of HIF-1α in fish after hypoxia stress （P＞0.05）. In summary， dietary glutamine could enhacne the activities of LZM and the non-specific immunity of C. semilaevis post larvae.

Glutamine； Cynoglossus semilaevis； Post larvae； Non-specific immune； HIF1-α； Gene cloning and expression

S963.7

A

1000-3207（2016）04-0736-08

10.7541/2016.97

2015-04-08；

2015-11-24

國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號： CARS50-G08）資助 ［Supported by the National Flatfish Industry System Construction Programme （No. CARS50-G08）］

劉經(jīng)緯（1989—）， 女， 河北承德人； 碩士； 研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。E-mail： kivi_liu@163.com

艾慶輝， 教授； qhai@ouc.edu.cn