關樺楠，韓博林，瑙阿敏，王 鑫，徐麗萍，孫 璐（.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 50076；.東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 50040）

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葡萄糖氧化酶脂質體的制備與表征

關樺楠1，2，韓博林1，瑙阿敏1，王 鑫1，徐麗萍1，孫 璐2
（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

摘 要：以大豆卵磷脂和膽固醇作為壁材，采用薄膜蒸發(fā)-凍融法制備葡萄糖氧化酶脂質體。以包封率作為指標，通過單因素和正交試驗設計優(yōu)化確定最佳制備工藝，并考察脂質體的形貌、粒徑分布和穩(wěn)定性指標。結果表明：最佳工藝參數(shù)為：大豆卵磷脂與膽固醇質量比4∶1、芯材質量5 mg（500 U）、水化時間15 min、凍融循環(huán)10 次，此條件下包封率可達到（87.7±2.1）%；粒徑分布均勻，分散性較好，平均粒徑為（164.75±2.55） μm；4 ℃和室溫（23.0±0.5）℃貯存條件下脂質體包封率無變化，酶活性穩(wěn)定。

關鍵詞：葡萄糖氧化酶；脂質體；穩(wěn)定性；薄膜蒸發(fā)-凍融法；表征

引文格式：

關樺楠， 韓博林， 瑙阿敏， 等.葡萄糖氧化酶脂質體的制備與表征［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 120-124.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613021. http://www.spkx.net.cn

GUAN Huanan， HAN Bolin， NAO Amin， et al.Preparation and characterization of glucose oxidase liposomes［J］.Food Science，2016， 37（13）: 120-124.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613021. http://www.spkx.net.cn

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種常見的需氧脫氫酶，在分子氧的存在下，利用氧為電子受體，特異性的催化氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸內酯，同時消耗氧生成過氧化氫［1］。GOD多分布在植物、動物和微生物中，具有專一性強、高效和生物相容性良好的特點［2］。目前，它被廣泛地應用于食品脫氧、除菌、面粉改良和防止褐變等諸多領域，是最為重要的食品工業(yè)用酶之一［3-7］。然而，游離的GOD在使用中易失活和貯存穩(wěn)定性差的缺點嚴重的制約了其在食品工業(yè)中的深層次應用［8］。為了解決這一問題，GOD固定化技術的探索與改良成為目前研究的熱點。脂質體是由磷脂類雙分子層所構成的一種單室或多室囊泡結構，其結構類似生物膜，又稱人工生物膜［9-11］。研究表明，脂質體可作為生物活性酶載體，通過囊化作用延長生物酶的壽命，有效地保持其活性［12］。常見的制備方法有薄膜法、凍融法、注入法、超聲波法和表面活性劑法等［13-17］。其中，薄膜蒸發(fā)法是將磷脂與膽固醇和藥物共溶于氯仿（或其他有機溶劑）中，通過減壓蒸發(fā)在容器內壁形成均勻薄膜［13，18］。這種方法制備的脂質體包裹容積較大，對脂溶性或水溶性藥物均可獲得較高的包封率，操作簡單［19］。如干擾素［20］、紫杉醇［21］、紅景天苷［22］等均用此法制得脂質體。凍融法是指快速冷凍過程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時存在，在緩慢融化過程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質體，采用此法制備的脂質體具有均一的粒徑分布，且膜壁機械強度較高［23-25］。本實驗結合兩種方法的優(yōu)勢，采用薄膜蒸發(fā)-凍融聯(lián)用法制備大粒徑GOD脂質體。通過對包封率的考察，確定脂質體的最佳制備工藝，并對其進行表征，評估脂質體中GOD的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶（100 U/mg）、魚精蛋白、大豆卵磷脂、膽固醇 美國Sigma-Aldrich公司；吐溫-20、靛藍胭脂紅（批號：20110607） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

R-201旋轉蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國惠普公司；JDG-0.2凍干機 蘭州科近真空凍干技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GOD脂質體制備工藝的單因素試驗

按照不同質量比例（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）分別稱取大豆卵磷脂和膽固醇（作為壁材），吸取一定質量的葡萄糖氧化酶粉末（0.05、1、3、5、10 mg）及吐溫-20共溶于10 mL的二氯甲烷中。30 ℃恒溫水浴，調節(jié)旋轉蒸發(fā)儀的轉速為100 r/min，待茄形瓶內有機溶劑除凈且內壁出現(xiàn)均勻的蜂窩狀透明薄膜后，加入5 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)水化一定時間（5、10、15、20、25 min），使薄膜溶脹水和完全，得到懸浮液后取出。微孔濾膜過濾去雜質，將濾液置于液氮中1 min，待冷凍完全后迅速放入37 ℃的水浴鍋中，完全融化后再次放入液氮中冷凍，如此反復，經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)（5、10、15、20、25 次），至樣品完全融化后，于室溫放置10 min，反復離心清洗3 次獲得GOD脂質體，4 ℃密封保存，以包封率為指標，選擇壁材質量比（大豆卵磷脂與膽固醇的質量比）、芯材質量（GOD的質量）、凍融次數(shù)和水化時間作為考察因素，優(yōu)化GOD脂質體的制備工藝。

1.2.2 GOD脂質體制備工藝的正交試驗優(yōu)化設計

通過上述單因素優(yōu)化試驗結果，分別獲得4 個因素中最適的3 個水平，采用L9（34）正交試驗表，優(yōu)化制備工藝，以脂質體包封率作為衡量指標，并利用DPS 7.05軟件對正交結果進行分析，最終確定GOD脂質體的最佳制備工藝條件（n=5）。

1.2.3 GOD活力的測定

參照周建芹等［1］方法，采用靛藍胭脂紅褪色分光光度法繪制標準曲線，測定GOD活性。酶活力單位定義為：37 ℃條件下，1 min內催化葡萄糖氧化反應產生1 μg過氧化氫所需的酶量為1 U。

1.2.4 GOD脂質體包封率的測定

采用魚精蛋白沉淀法去除體系中游離的GOD［19］。準確稱取1 mg的GOD脂質體凍干粉末和1 mL的魚精蛋白液（10 mg/mL），漩渦振蕩混合均勻，靜置5 min，加去離子水1 mL混勻，1 000 r/min離心5 min，去上清液，除去游離的酶，再加入適量甲醇，漩渦振蕩器混勻，溶脹后檢測酶活力，此即為脂質體內酶活力。按下式計算GOD脂質體包封率［24］。

1.2.5 GOD脂質體的表征

按最佳工藝制備GOD脂質體，采用透射電子顯微鏡觀察脂質體凍干樣品的整體表觀形貌，利用激光散射粒度儀測定GOD脂質體的粒徑大小及分布范圍。

為了評估GOD脂質體所包埋酶的穩(wěn)定性，根據(jù)活性包封率計算結果，選取相同含量和活性的游離酶液為參照樣品。將5 mg GOD脂質體粉末懸浮于1 mL去離子水中并與相同含量活性的游離酶一起放置于4 ℃和室溫（23.0±0.5） ℃避光環(huán)境中，于不同的時間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）測定脂質體中GOD和游離GOD的相對酶活力（即實際酶活力與初始酶活力的比值）［8］。

2 結果與分析

2.1 壁材質量比對GOD脂質體包封率的影響

傳統(tǒng)的脂質體制備方法獲得的脂質體存在包封率低、穩(wěn)定性差的特點，因此本實驗選擇改良后的薄膜蒸發(fā)法-凍融聯(lián)用法來制備GOD脂質體，采用魚精蛋白沉淀法去除游離的GOD，以檢測不到游離酶活性為標準，評估GOD脂質體的包封率，并以此為指標進行單因素優(yōu)化試驗。首先，篩選設計不同壁材質量比（m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，其中膽固醇為0.01 g）參與優(yōu)化試驗。由圖1可知，當壁材質量比為3∶1、4∶1和5∶1時，包封率較大，其中當壁材質量比為4∶1時，包封率達到最大值81.46%。方差分析結果（表1）表明，壁材質量比對脂質體的包封率具有顯著影響。部分研究結果證實，膽固醇是一種兩性化合物，可以插入脂質雙層膜間，親水性基團趨向水相表面，脂肪鏈平行排列在脂質雙層膜中心的烷基鏈；但是，當膽固醇含量大于某一范圍時，它可以降低藥物分子在雙層膜間的分配，從而引起包封率的下降，這與本試驗的結果基本相似［10］。綜上所述，選擇壁材質量比為3∶1、4∶1和5∶1這3 個水平參與正交設計試驗。

注：*.差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 芯材質量對GOD脂質體包封率的影響

脂質體既可以包埋水溶性的芯材，也可以包埋脂溶性的芯材，但多項研究結果表明，水溶性芯材的包埋效果明顯不如脂溶性芯材［25-27］。本實驗的芯材為溶于水相的葡萄糖氧化酶，因此選擇芯材質量作為優(yōu)化因素。分別選擇0.05、1、3、5、10 mg的葡萄糖氧化酶進行實驗。結果如圖2所示，當芯材（GOD）質量增加，包封率逐漸提高，當GOD質量達到5 mg時，包封率數(shù)值基本穩(wěn)定，約為74.0%。原因是當GOD質量超過5 mg時，超出了脂質膜的飽和限度，造成了脂質體的溶脹，進而影響了包封率。方差分析（表2）表明，芯材質量對脂質體的包封率具有顯著性影響。因此選擇芯材質量3（約300 U）、5（約500 U）、10 mg（約1 000 U）3 個水平參與正交試驗設計。

表 2 方差分析Table 2 Analysis of variance項目 平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 3 318.291 4 829.573 267.547 *組內 31.007 10 3.101總數(shù) 3 349.297 14

2.3 水化時間對GOD脂質體包封率的影響

在脂質體的制備過程中，水化的作用是極為重要的，本實驗中磷脂與膽固醇在形成薄膜后加入水化液，才可以使貼在內壁的磷脂層有序的卷曲脫離形成脂質體［26］。由圖3可知，水化時間越長包封率越大，且該因素具有一定的顯著性影響（表3），但是相關研究中提到［10，27］，水化時間過長容易造成壁材和芯材的氧化，綜合考慮，選擇15、20、25 min作為最適的3 個水平。

表 3 方差分析Table 3 Analysisof variance項目 離差平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 808.231 4 202.058 125.866 *組內 16.053 10 1.605總數(shù) 824.284 14

2.4 凍融次數(shù)對GOD脂質體包封率的影響

在循環(huán)凍融的過程中，較適宜的凍融次數(shù)，可以使脂質體粒徑趨于均勻化，使包封率及穩(wěn)定性有所改良［11］。由表4可知，凍融次數(shù)對脂質體的包封率具有顯著性影響。由圖4可知，隨著凍融次數(shù)的增加，脂質體的包封率有所提高，達到最大值64.80%；而達到最大包埋程度后，隨著次數(shù)的增加，包封率有下降的趨勢。其原因可能是過多的凍融次數(shù)會造成脂質體在冷凍形成冰晶的過程中，部分脂質體發(fā)生分子間的碰撞，導致部分脂質體球發(fā)生破裂；再有可能發(fā)生在重新緩慢融化的脂質體，膜間相互融合的過程中，使得脂質體的尺寸變大，包埋的GOD酶量雖然變多，但是脂質體生物外膜會相對變薄，導致脂質體更容易破裂，使得包封率降低［13］。綜合考慮，選擇凍融循環(huán)10、15、20 次作為3 個最適水平。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance項目 平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 3 551.429 4 887.857 224.774 *組內 39.500 10 3.950總數(shù) 3 590.929 14

2.5 GOD脂質體制備工藝的正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，以包封率作為考察指標，設定壁材質量比（A）、芯材質量（B）、凍融次數(shù)（C）和水化時間（D）四因素三水平進行正交試驗，利用正交表L9（34）進行設計優(yōu)化分析，選擇包封率最高的配方作為制備脂質體的最佳工藝。

表 5 正交試驗設計方案及結果Table 5 Orthogonal array designL9（34）withexperimentalresults試驗號 A壁材質量比 B芯材質量/mg C凍融次數(shù) D水化時間/min 包封率% 1 1（3∶1） 1（3） 1（10） 1（15） 63.4 2 1 2（5） 2（15） 2（20） 60.8 3 1 3（10） 3（20） 3（25） 62.8 4 2（4∶1） 1 2 3 72.4 5 2 2 3 1 79.4 6 2 3 1 2 78.6 7 3（5∶1） 1 3 2 56.8 8 3 2 1 3 81.4 9 3 3 2 1 86.3 K1187.0 192.6 223.4 229.1 K2234.4 221.6 219.5 196.2 K3224.5 227.7 199.0 216.6 k162.333 64.200 74.467 76.367 k276.800 73.867 73.167 65.400 k374.833 75.900 66.333 72.200極差R 14.467 11.700 8.134 10.967因素主次 A＞B＞D＞C最優(yōu)組合 A2B3C1D1

由表5可知，4 個因素影響包封率的次序分別為：A＞B＞D＞C，即壁材質量比＞芯材質量＞水化時間＞凍融次數(shù)。利用正交設計優(yōu)化獲得的最佳制備處方工藝優(yōu)化為：A2B3C1D1，即大豆卵磷脂與膽固醇質量比4∶1、葡萄糖氧化酶質量10 mg、凍融次數(shù)10 次、水化時間15 min。根據(jù)最佳制備工藝條件再進行酶脂質體的制備，并重復5 次，測定最佳工藝下的平均包封率為（87.7±2.1）%，相對標準偏差為1.24%。與此前的方法相比，采用此法所制備的脂質體較大程度提高了包封率［15-17，23］。即1 mg的凍干葡萄糖氧化酶脂質體中平均包埋0.326 mg的葡萄糖氧化酶。

2.6 GOD脂質體的表征

利用優(yōu)化后的工藝體系制備GOD脂質體，平均包封率為（87.7±2.1）%，采用光學顯微鏡和激光粒度分布儀對GOD脂質體粉末的表觀形貌和粒徑分布進行表征。由圖5A可知，GOD脂質體的基本呈現(xiàn)規(guī)則的圓球形，沒有明顯的聚集現(xiàn)象，且表面沒有缺陷。由圖5B可知，GOD脂質體的粒徑分布較為均勻，主要集中（約50%的脂質體微粒）在100～250 μm的范圍內，有效平均粒徑約為（164.75±2.55） μm，多分散系數(shù)（polydispersity，PDI）為0.258，數(shù)值較小，分散性較好，體系較為均勻。

脂質體作為新型藥物載體，具有類似于生物膜的磷脂雙分子層，可將脂溶性或水溶性藥物包覆于脂膜內部，隔絕外界不良環(huán)境對藥物的影響，進而提高所包覆藥物的穩(wěn)定性。本實驗中，考察脂質體內GOD與游離的GOD在相同時間間隔內的酶活性變化，可以有效評估脂質體中GOD的穩(wěn)定性。由圖6可知，在4 ℃和室溫避光貯藏條件下，脂質體中的GOD與游離GOD的相對酶活力都隨時間的延長而下降。由圖6A可知，在相同的時間間隔內脂質體中的GOD相對酶活力比游離的GOD的高。相對酶活力的檢測初始值皆為96%，游離的GOD相對酶活力呈下降的趨勢，說明酶活性開始逐漸喪失，到達35 d時相對酶活力基本達到平衡，維持在30%。脂質體中GOD在60 d的間隔時間內依然維持較高的相對酶活力，達到了93%。由圖6B可知，在室溫條件下，游離的GOD在貯存40 d后，相對酶活力就已下降至25%；與此同時，脂質體中的GOD相對酶活力仍然維持在83%。結果表明，GOD脂質體分別在4 ℃和室溫條件下貯存60 d和40 d后，包封率基本不變，說明脂質體沒有破裂溶出。所包覆的GOD在脂膜的保護下，能夠有效隔絕外界環(huán)境對酶活性的影響，進而提高了酶的貯存穩(wěn)定性。

3 結 論

目前，葡萄糖氧化酶被廣泛應用食品工業(yè)中，但是其提純過程繁瑣，加工成本偏高，且游離態(tài)的GOD穩(wěn)定性差，因此探索適合的固定化技術對葡萄糖氧化酶的應用具有重要意義。本實驗采用薄膜蒸發(fā)-凍融聯(lián)用法成功制備出了GOD脂質體，并考察了脂質體的理化性質和穩(wěn)定性。結果表明，GOD脂質體的最佳制備工藝為壁材質量比4∶1、芯材質量5 mg（500 U）、水化時間15 min、凍融循環(huán)10 次。利用此工藝所制備的脂質體的平均包封率可達到（87.7±2.1）%；在不同溫度條件下，脂質體中的GOD的酶活力穩(wěn)定性得到提高。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613021

中圖分類號：Q84

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0120-05

收稿日期：2015-09-15

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（31201376）；中國博士后科學基金資助項目（2014T70304；2013M531009）；黑龍江省博士后基金資助項目（LBH-Z13002）；黑龍江省科學基金項目（C2016034）

作者簡介：關樺楠（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：guanhuanan3@163.com

Preparation and Characterization of Glucose Oxidase Liposomes

GUAN Huanan1，2， HAN Bolin1， NAO Amin1， WANG Xin1， XU Liping1， SUN Lu2
（1.College of Food Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China；2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract:Egg phosphatidylcholine and cholesterol were used as coating materials to prepare glucose oxidase （GOD）liposomes by a thin film evaporation-freezing thawing method.Single factor experiments and orthogonal array design methods were used to optimize the preparation conditions based on encapsulation efficiency.The shape， stability and particle size distribution of liposome-encapsulated glucose oxidase were systematically investigated.The optimal process parameters were obtained as follows: mass ratio between egg phosphatidylcholine and cholesterol of 4:1， 5 mg （500 U） of GOD， hydration time of 15 min， and 10 freezing-thawing cycles.The encapsulation efficiency of GOD liposomes was up to （87.7 ± 2.1）%， with an average diameter of approximately （164.75 ± 2.55） μm under the optimized conditions.The encapsulation efficiency did not significant change at 4 ℃ and room temperature （23.0 ± 0.5） ℃， and the activity of GOD remained stable.

Key words:glucose oxidase； liposome； stability； film evaporation-freezing thawing method； characterization