焦紅梅,楊　慧,趙　丹,李國才,陳紅菊,嚴　華,季明春

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,江蘇 揚州,225001)

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論著

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表達及其在疫苗血清學(xué)檢測中的初步應(yīng)用

焦紅梅,楊慧,趙丹,李國才,陳紅菊,嚴華,季明春

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,江蘇 揚州,225001)

摘要:目的克隆并表達淋病奈瑟菌孔蛋白PorB,以重組蛋白為抗原，間接ELISA檢測免疫血清的抗體水平。方法利用PCR從淋病奈瑟菌WHO 株基因組中擴增出PorB的基因，克隆入原核表達載體 pET-30a 中，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒 pET30a-PorB,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)中，異丙基 β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)表達。表達的蛋白進行SDS-PAGE分析,Western blot檢測其反應(yīng)原性。以純化的重組蛋白 rPorB 作為檢測抗原建立間接ELISA 方法，用于檢測淋病疫苗 pVAX1-PorB 免疫小鼠后的血清抗體水平。結(jié)果PCR 擴增得到淋病奈瑟菌孔蛋白 PorB 基因，表達的重組蛋白rPorB相對分子質(zhì)量約40 kD,經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后的 rPorB 在SDS-PAGE中顯示單一條帶,Western blot 證明純化后的 rPorB 可與淋病奈瑟菌免疫血清特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性。間接 ELISA 結(jié)果表明，淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠血清PorB特異性抗體滴度為1∶200。結(jié)論成功構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET30a-PorB,PorB 在大腸桿菌中獲得表達。以純化的rPorB為檢測抗原，間接 ELISA 可以用于淋病疫苗免疫效果的評價。該研究為淋病奈瑟菌感染診斷、疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:淋病奈瑟菌; 孔蛋白PorB; 原核表達; 免疫檢測

淋病是一種由淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)引起的泌尿生殖系統(tǒng)黏膜的急性或慢性化膿性炎癥,是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的性傳播疾病(STD)之一。WHO[1-3]統(tǒng)計表明,全球每年新增病例1.06 億，淋病發(fā)病率居中國性傳播疾病首位，危害十分嚴重。淋病奈瑟菌主要經(jīng)性接觸傳播，主要感染女性的宮頸和男性的尿道，也可侵犯眼結(jié)膜、咽部、肛門和直腸。男性感染者可表現(xiàn)為尿道炎、前列腺炎等，女性感染者可表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎，甚至不孕等。超過一半的感染者呈現(xiàn)無癥狀感染狀態(tài)[4]。淋病奈瑟菌易于引起傳染和重復(fù)感染，且使 HIV 共感染的概率大大增加[5-7]?？椎鞍?B(Por B)是存在于淋病奈瑟菌外膜上抗原高度保守的外膜蛋白，是細菌中含量最多的外膜蛋白。研究[8-9]表明孔蛋白具有較強的免疫原性，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。本研究以淋病奈瑟菌 WHO-A株基因組DNA為模板擴增Por B基因，構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET30a -PorB,然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)中,IPTG 誘導(dǎo) PorB 蛋白的表達。

1材料與方法

1.1材料與試劑

淋病奈瑟菌WHO-A株購自中國藥品生物制品檢定所; E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)由本實驗室保存; 原核表達載體pET-30a購自Novagen公司。淋病奈瑟菌真核表達質(zhì)粒pVAX1-PorB 由本室構(gòu)建保存。質(zhì)粒小量提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ 及Xho Ⅰ 、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、DNA Marker和高保真酶Prime Star Max等購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司; IPTG購自上海生物工程有限公司。羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗和底物顯色液(TMD)購自北京天根生物工程公司; 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成:參照GenBank中淋病奈瑟菌PorB基因的序列，設(shè)計合成一對引物:上游引物(NPIBF):CGGCATATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG,含有Nde Ⅰ酶切位點；下游引物(XPIBR):CCCCTCGAGGAATTTGTGGCGCAGAACGAC,含有Xho Ⅰ酶切位點。這對引物覆蓋整個PorB基因，預(yù)期擴增目的片段大小為1053 bp,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.2PCR擴增PorB基因:以淋病奈瑟菌WHO株基因組DNA為模板,PCR擴增目的基因PorB，具體方法參照 Prime Star Max說明書進行。擴增體系:100 μL體系中含有基因組 50 ng,Prime Star Max 50 μL,NPIBF 4 μL,XPIBR 4 μL。循環(huán)條件:98 ℃ 10 s,55℃ 5 s,72℃ 30 s,30次循環(huán)。

1.2.3重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定:用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho Ⅰ分別雙酶切PCR 產(chǎn)物和原核表達載體pET-30a。目的基因片段和載體片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET30a-PorB，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行分析。

1.2.4重組菌的誘導(dǎo)表達及目的蛋白的純化:將測序正確的重組質(zhì)粒pET30a-PorB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中，涂布于含卡那霉素的LB 瓊脂平板。挑取陽性克隆接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，以1∶500接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.4～0.5時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG,37 ℃ 振蕩培養(yǎng)4 h。菌液經(jīng)離心、重懸后，進行SDS-PAGE分析。同時設(shè)空載體pET-30a轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)作為對照。用Ni-NTA親和層析柱對目的蛋白進行純化，具體方法參照說明書進行。

1.2.5重組蛋白的Western blot鑒定:重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,PBST洗膜后，用含有10% FCS的PBST封閉過夜。PBST洗膜后，以1:200稀釋的淋病奈瑟菌免疫血清為一抗,HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，觀察特異蛋白條帶。同時設(shè)空載體為對照。

1.2.6間接ELISA方法的檢測:淋病奈瑟菌重組質(zhì)粒pVAX1-PorB經(jīng)肌肉途徑免疫6～8周齡BALB/c小鼠3次，每次免疫間隔2周，于末次免疫后2周采集小鼠血清，間接ELISA檢測PorB抗體。以純化的PorB蛋白包被酶標板,4 ℃過夜。次日用PBST清洗3次，用含10%小牛血清的PBS進行封閉。以稀釋的免疫鼠血清為一抗，同時設(shè)PBS免疫組為陰性對照。HRP標記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，加入底物TMB顯色，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后測 OD450值。以P(待測樣品 OD450值)/N(陰性對照OD450值)≥2.1判為陽性。

2結(jié)果

2.1PorB的PCR擴增結(jié)果

根據(jù)PorB基因序列設(shè)計一對引物，以淋病奈瑟菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1.0 kb處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的片段大小相符。見圖1。

M.250 bp DNA ladder Marker; 1.PorB基因擴增產(chǎn)物

圖1PCR擴增PorB 基因

2.2重組原核表達質(zhì)粒pET30a- PorB的構(gòu)建和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入原核表達載體 pET-30a 中，經(jīng)雙酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)1.0 kb的目的片段和5.4 kb的載體片段。見圖2。序列測定結(jié)果表明,PorB大小為1053 bp,與GenBank公布的多株淋病奈瑟菌孔蛋白PorB 的序列具有100%的同源性。說明重組質(zhì)粒 pET30a-PorB 構(gòu)建成功。

M.Wide Range DNA Marker (100-6，000);1.pET30a-PorB digested by restriction enzymes Nde I and XhoI

圖2重組表達質(zhì)粒pET30a- PorB的雙酶切鑒定

2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE分析

將含有重組質(zhì)粒pET30a-PorB的大腸桿菌 BL21(DE3)在37 ℃誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)的菌液相比，誘導(dǎo)表達的BL21(DE3)-pET30a-PorB在40 kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，目的蛋白經(jīng)鎳柱純化后得到純化蛋白。見圖3。

M:蛋白質(zhì)marker;1,3:BL21(DE3)-pET30a-PorB(誘導(dǎo));2:BL21(DE3)-pET30a-PorB(未誘導(dǎo));4:BL21(DE3)-pET30a(未誘導(dǎo));5:BL21(DE3)-pET30a(誘導(dǎo));6:BL21(DE3)-pET30a-PorB(誘導(dǎo)純化后)圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.4重組蛋白的 Western blot鑒定

將重組蛋白 rPorB 進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以鼠抗淋病奈瑟菌免疫血清為一抗，以辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blot分析。結(jié)果表明，rPorB在相應(yīng)位置上出現(xiàn)特異性條帶(圖4),表明rPorB與鼠抗淋病奈瑟菌抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性。

M:蛋白質(zhì)marker;1:BL21(DE3)-pET30a;2:BL21(DE3)-pET30a-PorB圖4 重組蛋白的Westernblot分析

2.5間接ELISA檢測

通過方陣實驗確定蛋白最佳包被濃度為5μg/mL,間接ELISA檢測免疫小鼠血清特異性抗體水平。結(jié)果表明，淋病奈瑟菌疫苗pVAX1-PorB三免后免疫小鼠血清抗體水平在1∶200。見圖5。以上結(jié)果說明表達的重組蛋白rPorB具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖5 免疫血清的ELISA檢測

3討論

淋病奈瑟菌外膜蛋白主要有外膜蛋白Ⅰ (PⅠ ,稱孔蛋白)、外膜蛋白Ⅱ(PⅡ,又稱不透明蛋白) 和外膜蛋白Ⅲ(PⅢ,又稱還原修飾蛋白)。其中,PⅠ 是主要外膜蛋白，占有外膜蛋白含量的60%,在淋病奈瑟菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用。孔蛋白單體主要由β-蛋白折疊和無規(guī)則卷曲組成的三聚體結(jié)構(gòu)，分為PorA 和PorB兩種亞型。流行病學(xué)研究顯示,PorB是主要亞型。研究[10-13]表明，它可以介導(dǎo)離子交換，在免疫應(yīng)答的過程中可通過活化B細胞和其他抗原遞呈細胞發(fā)揮佐劑的活性?？椎鞍卓梢院腿斯つ?、脂質(zhì)雙層膜和靶細胞膜直接作用。通過細菌和細胞緊密接觸的區(qū)域，孔蛋白可結(jié)合和進入上皮細胞膜、易位于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電勢降低，介導(dǎo)細胞的凋亡[14-15]?？椎鞍啄艹掷m(xù)在淋病奈瑟菌細胞膜表面表達，具有較強的免疫原性，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，是理想的淋病疫苗侯選成分。同時，其抗原變異相對緩慢，可作為重要的診斷抗原。本研究通過PCR擴增獲得淋病奈瑟菌WHO株孔蛋白PorB的開放讀碼框全長序列為1 053個堿基，編碼351個氨基酸。序列分析結(jié)果表明，與GenBank 公布的淋病奈瑟菌MS11株等的孔蛋白PorB 序列具有100%的同源性。以pET30a為表達載體，構(gòu)建了pET30a-PorB重組質(zhì)粒并實現(xiàn)了在E.coli BL21(DE3)中的表達，表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后得到純度較高的重組蛋白rPorB。Western blot 檢測結(jié)果表明重組蛋白rPorB能被淋病奈瑟菌免疫鼠血清識別。為了進一步檢測重組蛋白rPorB的免疫特性，以重組蛋白rPorB為檢測抗原，建立了間接ELISA方法，檢測淋病奈瑟菌疫苗的免疫原性。結(jié)果表明，重組蛋白rPorB可以用于檢測淋病奈瑟菌疫苗誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答，為淋病奈瑟菌感染診斷和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期:2016-04-03

基金項目:國家自然科學(xué)基金(31100652; 81471906); 江蘇省自然科學(xué)基金(14KJB310025)

中圖分類號:R 759.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201615001

Prokaryotic expression of PorB gene from neisseria gonorrhoeae and its primary application in serological detection

JIAO Hongmei,YANG Hui,ZHAO Dan,LI Guocai, CHEN Hongju,YAN Hua,JI Mingchun

(Department of Pathogenic Biology and Immunology,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo clone the PorB protein of neisseria gonorrhoeae and use indirect ELISA to evaluate the titers of antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine.MethodsThe complete PorB gene from neisseria gonorrhoeae strain WHO was amplified by PCR and subcloned into the pET-30a vector to construct recombinant plasmid pET30a-PorB.Then the resultanting plasmid pET30a-PorB was transformed into E.coli BL21(DE3) and the expression of the Por B protein was induced with IPTG.The expressed PorB protein was purified by Ni2+-chelating chromatography and detected by SDS-PAGE and Western blot.ResultsPorB gene was 1053 bp in length.SDS-PAGE analysis indicated that the molecular weight of the recombinant protein was about 40 kD.The recombinant protein could react with polyclonal antibody against neisseria gonorrhoeae.Mouse antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine recognized rPorB,indicating that rPorB had a good immunogenicity.ConclusionThe rPorB is successfully expressed and the indirect ELISA with it as coating antigen can be used to evaluate the titers of antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine.These results lay foundation for the diagnosis of neisseria gonorrhoeae infection and the research of vaccine of neisseria gonorrhoeae.

KEYWORDS:neisseria gonorrhoeae; rPorB; prokaryotic expression; indirect ELISA