王　華，甄拴平，黨麗君，張樹琪

(陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科　721001)

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強直性脊柱炎與HLA-B27基因亞型的相關(guān)性研究

王華，甄拴平，黨麗君，張樹琪

(陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科721001)

摘要:目的探討不同人類白細胞抗原B27(HLA-B27)基因亞型與強直性脊柱炎(AS)的相關(guān)性。方法采集骨科、針灸風(fēng)濕科門診及住院患者靜脈全血,應(yīng)用基因分析法定性檢測HLA-B27，其中HLA-B27陽性的AS確診患者380例，并選取HLA-B27陽性健康對照組50例，同時通過序列特異性引物PCR(PCR-SSP)技術(shù)檢測AS患者和健康對照組的HLA-B27基因亞型。結(jié)果380例AS患者中，檢出HLA-B2704亞型217例(57.1%)，HLA-B2705亞型143例(37.6%)，HLA-B2707亞型11例(2.9%)，HLA-B2711亞型9例(2.4%)；50例HLA-B27陽性健康對照組中，檢出HLA-B2706亞型23例(46.0%)，HLA-B2709亞型21例(42.0%)，HLA-B2704亞型4例(8.0%)，HLA-B2705亞型2例(4.0%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。結(jié)論寶雞地區(qū)AS患者HLA-B27基因亞型以B2704和B2705為主，與寶雞地區(qū)漢族人群AS的發(fā)病呈強相關(guān)；B2706及B2709為該地區(qū)保護亞型。

關(guān)鍵詞:強直性脊柱炎；HLA-B27；PCR-SSP;亞型

強直性脊柱炎(AS)是一種自身免疫疾病，目前尚未明確病因，認為屬于遺傳性疾病。AS是一種以骶髂關(guān)節(jié)炎及中軸關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯穆匝仔匝尻幮约怪P(guān)節(jié)病。AS致殘率高，早期診斷對患者的治療非常重要。人類白細胞抗原B27(HLA-B27)的檢測有助于AS的診斷，在我國90%以上的AS患者HLA-B27呈陽性[1]，同時HLA-B27存在多個等位基因，不同亞型的分布有著地域和人種的差別。筆者選取了寶雞地區(qū)HLA-B27陽性AS患者及健康人進行HLA-B27基因亞型檢測，探討本地區(qū)主要致病亞型及可能的保護亞型，以期為本地區(qū)AS的防治提供有用的依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2010年1月至2014年7月本院骨科、針灸風(fēng)濕科門診及住院患者，均為寶雞及周邊地區(qū)漢族個體，其中HLA-B27陽性的AS確診患者380例(符合1984年AS紐約修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)[2])，男247例，女133例，男女比例1.86∶1，平均(35.00±8.37)歲；健康對照組50例，均為寶雞地區(qū)漢族HLA-B27 陽性健康人個體之間無血緣關(guān)系，男33例，女17例，男女比例1.94∶1，平均(34.00±6.40)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑PCR儀器購自杭州博日，HC-2517高速離心機購自安徽中佳公司；JY600C電泳儀購自北京君意公司，全血DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自臺灣貝索公司。BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight試劑盒和EXTRA-GENE試劑盒由德國BAG公司提供，上海培清JS-300凝膠圖像分析儀，Gene Quant Pro型DNA濃度測定儀。

1.3方法

1.3.1應(yīng)用序列特異性引物PCR(PCR-SSP)定性檢測外周血T淋巴細胞HLA-B27清晨空腹抽取患者及健康對照組靜脈血1.0 mL，EDTA抗凝，各項操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說明書步驟進行。

1.3.2HLA-B27基因亞型測定采用PCR-SSP技術(shù)檢測HLA-B27陽性患者及健康對照人群HLA-B27亞型的DNA。(1)DNA模板的制備：采用EXTRA-GEN試劑盒(鹽析法)，濃度>50 ng/μL，A260/A280的比值為1.6～2.0。(2)PCR擴增：使用BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight試劑盒(可檢測HLA-B2701至B2743亞型)，PCR反應(yīng)體系的配制和PCR擴增反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進行。(3)凝膠配制：準(zhǔn)確稱取2.0 g的瓊脂糖溶解于100 mL 0.5×TBE溶液(濃度為2.0%)。(4)PCR擴增產(chǎn)物分析：準(zhǔn)確吸取10 μL擴增產(chǎn)物加入電泳槽內(nèi)瓊脂糖凝膠中，采用150 mV電壓電泳10 min，然后用JS-300凝膠圖像分析儀照相，最后用BAG HISTO HYPE HLA-B27 Hight格局分析表進行HLA-B27亞型分型結(jié)果的判定。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用百分率表示，各組HLA-B27陽性率比較采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

HLA-B27陽性AS患者年齡分布情況，見表1。AS患者及健康對照組HLA-B27基因亞型檢出情況，見表2。AS患者及健康對照組HLA-B27基因亞型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

表1　　HLA-B27陽性AS患者年齡分布情況

表2　　AS患者及健康對照組HLA-B27基因亞型檢出情況[n(%)]

3討論

目前AS確診主要是依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)、實驗室檢查結(jié)果。成年患者AS的診斷主要依賴于詳細的病史和細致的體格檢查，臨床表現(xiàn)為腰、骶及下肢關(guān)節(jié)疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活動受限，甚至引起其他組織的傷害，嚴(yán)重影響患者的生活[3]；對于有慢性炎性背痛的青少年，特別是缺乏足夠的骶髂關(guān)節(jié)炎影像學(xué)證據(jù)時，HLA-B27檢測就顯得尤為重要。AS患者遍及世界各地，其總體發(fā)病率約為7.3/100 000，在我國AS發(fā)病率約為0.3%，多見于中青年男性，且AS致殘率高，故早期確診并及時治療對患者非常重要。

本研究中，11～20、21～30、31～40歲的HLA-B27陽性率分別為38.6%、34.5%、33.1%，顯著高于其他年齡段，且這些青壯年人群的臨床癥狀和體征普遍不夠典型，大多數(shù)缺乏足夠的骶髂關(guān)節(jié)炎影像學(xué)證據(jù)。因此，對本地區(qū)疑似AS患者應(yīng)盡早檢測HLA-B27，有助于青壯年AS患者的早期診斷和針對性治療，同時結(jié)合AS家族史對于AS的預(yù)防具有積極的意義。盡管HLA-B27有助于AS診斷，但HLA-B27也可能出現(xiàn)于銀屑病性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和腸性關(guān)節(jié)炎等疾病，因此，臨床上對于不典型病例有必要進行HLA-B27基因亞型檢測，這樣有利于AS與上述疾病的鑒別診斷。

目前認為HLA-B27與AS可能有以下關(guān)系[4]：HLA-B27為AS的致病菌或者感染因子受體；HLA-B27與外來的抗原反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗原耐受性；HLA-B27增強了中性粒細胞活性；HLA-B27為免疫應(yīng)答基因，與機體是否容易感染起決定性因素。

資料顯示，HLA-B27有81個亞型，分別命名B2701～B2782(B2722等位基因后被刪除)。B2705為分布最廣的亞型，可能是其他基因的祖基因，即其他基因是由其進化而來[5],本研究采用的分型方法可檢測HLA-B2701～B2743共43個亞型，涵蓋了大多數(shù)的常見基因亞型。

研究顯示，AS的患病率與HLA-B27的出現(xiàn)頻率和種族分布差異緊密相關(guān)，約90%的AS白人患者HLA-B27呈陽性，而在非洲黑人和日本人中，幾乎不存在AS和HLA-B27相關(guān)性(HLA-B27的陽性率低于1%)。同時不同HLA-B27亞型有著不同的地域和人種分布特點[6]。在世界范圍內(nèi)，除了西非的塞內(nèi)加爾、岡比亞外，B2705和AS及相關(guān)的脊柱關(guān)節(jié)病有明顯相關(guān)性。B2702主要存在于白種人，中東猶太人和北非人；B2704、B2706、B2707只在東方人種中發(fā)現(xiàn)，在我國也以B2704最多見，約占55%，是主要的HLA-B27亞型，但B2704的分布頻率在東方各民族間又存在一定差異[6]，究其原因，主要受HLA-B27易感性因素或地理環(huán)境因素差異的影響。

有報道認為，B2705、B2704、B2702亞型與AS的發(fā)生呈正相關(guān)，B2703、B2708、B2709、B2707與AS的發(fā)生呈負相關(guān)[7-9]，而B2706亞型則被普遍認為是AS的保護性基因。本研究結(jié)果顯示，寶雞地區(qū)HLA-B27陽性患者亞型分布依次為B2704、B2705、B2707、B2711，且B2704亞型占57.1%，B2705亞型占37.6%。50例HLA-B27陽性健康對照組檢出4種亞型：HLA-B2706亞型23例(46.0%)，HLA-B2709

亞型21例(42.0%)，HLA-B2704亞型4例(8.0%)，HLA-B2705亞型2例(4.0%)，經(jīng)統(tǒng)計分析，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。證實本地區(qū)AS患者中HLA-B27主要亞型分布為B2704亞型與B2705亞型，且B2704亞型為優(yōu)勢亞型；而B2706亞型及B2709亞型僅見于HLA-B27 陽性健康者，提示B2706亞型及B2709亞型為本地區(qū)保護亞型。

綜上所述，通過對寶雞地區(qū)HLA-B27陽性的患者及健康對照人群HLA-B27分型研究，發(fā)現(xiàn)了本地區(qū)HLA-B27基因主要致病亞型和可能的保護亞型，對于癥狀體征不典型患者和疑難患者的診斷和鑒別診斷具有一定價值。但由于檢測病例數(shù)量有限，未能涉及本地區(qū)HLA-B27基因動態(tài)表達量與AS患者疾病活動指數(shù)的相關(guān)性，后續(xù)將進一步開展這方面的工作，為本地區(qū)AS的防治提供必要的探索。

參考文獻

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作者簡介：王華，女，主管檢驗技師，主要從事臨床免疫學(xué)及微生物學(xué)檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.021

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1954-03

(收稿日期：2016-01-19修回日期：2016-03-22)

Study on correlation between ankylosing spondylitis and HLA - B27 subgenotype

WANGHua,ZHENShuanping,DANGLijun,ZHANGShuqi

(DepartmentofClinicalLaboratory,BaojiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Baoji,Shaanxi721001，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the correlation between different HLA-B27 subgenotype and ankylosing spondylitis(AS).MethodsThe whole venous blood was collected from the outpatients and inpatients of the orthopedics,acupuncture and rheumatism departments and HLA-B27 was qualitatively detected by using the gene analysis method.Among them,380 cases of AS were HLA-B27 positive,and 50 cases of HLA-B27 positive were selected as the healthy control group.Then the HLA-B27 subgenotypes were detected by using the sequence specific primers PCR(PCR-SSP) technology.ResultsAmong 380 cases of AS,217 cases (57.1%) of HLA-AS B2704 subgenotype,143 cases (37.6%) of HLA-B2705 subgenotype,11 cases (2.9%) of HLA-B2707 subgenotype and 9 cases (2.4%) of HLA-B2711 subgenotype were detected out;among 50 cases of HLA-B27 positive in the healthy control group,23 cases (46.0%) of HLA-B2706 subgenotype,21 cases (42.0%) of HLA-B2709 subgenotype,4 cases (8.0%) of HLA B2704 subgenotype and 2 cases (4.0%) of HLA-B2705 subgenotype were detected out,the differences between the two groups were statistically significant (P=0.002).ConclusionThe subgenotypes of HLA-B27 among the AS patients in Baoji area are dominated by the genotype B2704 and B2705,which is strongly correlated with the occurrence of AS among Han population in Baoji area;B2706 and B2709 are the protective subgenotypes in this area.

Key words:ankylosing spondylitis；HLA-B27；PCR-SSP；subtype