邢莉，黃茜，潘英瑜，張賡輝，吳多榮，文小俊

（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 1.口腔醫(yī)學中心牙體牙髓病科，2.檢驗科，海南 ?？?570208）

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Nd：YAG激光對天然牙根管內大腸桿菌殺菌效果的體外實驗*

邢莉1，黃茜1，潘英瑜1，張賡輝1，吳多榮2，文小俊1

（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 1.口腔醫(yī)學中心牙體牙髓病科，2.檢驗科，海南 ?？?570208）

摘要：目的建立大腸桿菌離體天然牙根管感染模型，評價脈沖Nd：YAG激光對感染根管內大腸桿菌的殺菌效果。方法將感染3周的30顆離體前牙隨機分為5組，每組6顆牙齒。A組1.5W激光照射1次，作用30s；B組2.1W激光照射1次，作用30s；C組2.1W激光重復照射3次，每次30s，間隔15 s；D組2.5%次氯酸鈉NaOCl沖洗后2.1W激光重復照射3次，每次30s；對照組單純用2.5%NaOCl沖洗。每組標本在照射、沖洗前后根管內即刻取樣行細菌培養(yǎng)，48h后計數菌落數（CFU/ml），比較根管內大腸桿菌的殺滅效果。結果Nd：YAG激光和2.5%NaOCl照射、沖洗后根管內細菌量均顯著下降。各組根管內細菌減少量比較差異有統(tǒng)計學意義。A組與B組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），分別與C組、D組、對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；C組與D組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；D組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論Nd：YAG激光和2.5%NaOCl對根管內大腸桿菌具有殺菌作用，兩者聯(lián)合使用殺菌作用更強。

關鍵詞：Nd：YAG激光；大腸桿菌；次氯酸鈉；菌落計數

混合細菌感染是牙髓病和根尖周病的主要病因，從炎癥牙髓、感染根管到根尖周病變，根管內細菌種類增多，毒力也不斷增強。在根管內細菌主要以生物膜的形式存在，能抵抗宿主的免疫反應及藥物的作用，具有更強的致病性[1-3]。目前，主要通過機械預備清除和藥物沖洗、消毒控制根管內感染，而采用脈沖Nd：YAG激光進行根管內消毒殺菌的文獻報道及臨床應用較少。本實驗建立大腸桿菌根管感染模型，采用不同劑量和作用時間的脈沖Nd：YAG激光進行根管消毒，評價其殺菌效果，為臨床更好地控制根管內感染，提高根管治療成功率提供快速而有效的方法。

1　資料與方法

1.1主要材料和儀器

ATCC25922大腸桿菌標準菌株購自中國微生物菌種保藏中心，中國藍瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限公司，HSM-Ⅲ型脈沖Nd：YAG激光治療儀購自四川航天制導公司，HH.W21.600型恒溫水浴培養(yǎng)箱購自浙江余姚市東方電工儀器廠。

1.2離體牙準備

選擇因牙周病拔除的上頜中切牙34顆，單根管、根尖孔發(fā)育完全，未做過牙髓治療，牙根無裂痕。去除牙根周圍的牙結石，截除牙冠保留牙根，標準化長度為15mm，根管預備后復合樹脂封閉根尖孔。

將制備好的牙齒打包高溫高壓滅菌，隨機選取2標本取樣檢測無細菌生長后確定根管內已滅菌徹底。解凍復蘇大腸桿菌標準菌株，接種于中國藍瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h增菌。在生物安全柜內，用營養(yǎng)肉湯調取McFarland為2（6.0×108CFU/ml）的菌液，接種于無菌根管內，每根管注入菌液40μl。37℃恒溫水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日根管內更換新鮮菌液。感染20d時隨機抽取1標本菌液轉種于中國藍瓊脂培養(yǎng)基，37℃細菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后根據培養(yǎng)基上長出的菌落形態(tài)和革蘭染色特征，用細菌鑒定儀進行生化鑒定確定無雜菌污染，再將感染3周（21d）[4]的標本納入進一步實驗。隨機抽取2標本行掃描電鏡，觀察大腸桿菌感染根管的情況。

1.4實驗分組

經電鏡觀察、細菌學檢查、生化鑒定確定根管內已被純培養(yǎng)的大腸桿菌感染而無雜菌污染，按隨機數字表法將30顆上頜中切牙標本分為A、B、C、D及對照組，每組6個標本。

1.5感染模型的細菌培養(yǎng)計數

第1次取樣：無菌紙尖吸干各組標本根管內的培養(yǎng)液，注入無菌生理鹽水。40號無菌紙尖插入根管中停留1 min，吸取根管內液，立即放入裝有1 ml無菌生理鹽水的試管中，混勻，10倍系列稀釋，分別取1×10-4、1×10-5稀釋度標本50μl接種于中國藍瓊脂培養(yǎng)基，37℃細菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數菌落數（CFU/ml）。

1.6Nd：YAG激光照射、次氯酸鈉NaOCl沖洗感染模型后的細菌計數

第2次取樣：A、B組用Nd：YAG激光照射1次，時間30s，劑量分別為1.5和2.1W；C組2.1 W激光重復照射3次，每次30s，間隔15s。激光照射時選擇直徑為0.3 mm光纖頭插入感染根管距根尖孔2 mm處，以上下垂直方向、接觸式沿根管壁四周均勻照射。D組先用5 ml 2.5%NaOCl沖洗，在2 min內完成，再用2.1W激光重復照射3次，每次30s。對照組只用5ml 2.5%NaOCl沖洗，在2 min內完成。無菌紙尖吸干根管，即刻往各組標本根管內注入無菌生理鹽水，用紙尖吸取根管內液，放入裝有1 ml生理鹽水的試管中，混勻，10倍系列稀釋，取稀釋標本50μl分別接種于中國藍瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后計數菌落數。

1.7細菌復蘇實驗

要搞好測水量水工作，首先要選定測流站、點。布置測流站、點的原則是：渠段斷面規(guī)則穩(wěn)定，不受壅水影響，寬度、深度、比降大致相同；測段渠底和岸坡無草木；附近無影響水流的建筑物，無退水和分水渠、無支流匯入；便于觀測和修理測水設備。測水的方法主要有三角堰、梯形堰、巴歇爾量水槽、無喉量水槽、水工建筑物量水、流速儀、浮標、利用標準渠段測流、現我們使用的是自動化測水與遙測測流法。

第2次取樣完成后在所有標本根管內注入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)72h，無菌紙尖吸取根管內液，置于中國藍瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)是否有細菌生長。

1.8掃描電鏡標本觀察

將2標本置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中4℃固定保存4h。高速金剛砂車針沿標本牙根長軸制備2條縱形深溝，劈開牙根暴露根管內牙本質壁。乙醇梯度脫水，二氧化碳CO2臨界點干燥，離子濺射儀噴金，掃描電鏡觀察根管內大腸桿菌感染情況。

1.9統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，將細菌計數結果（CFU/ml）加1后做對數轉換，即lg（CFU/ml+ 1），方差分析和多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1掃描電鏡觀察

感染3周后，根管腔內可觀察到互相結合的大腸桿菌細菌微集落，細菌間出現絲狀纖維連接，形成成熟、穩(wěn)定的生物膜（見附圖A、B），細菌入侵牙本質小管深處（見附圖C、圖D）。

附圖　3周后大腸桿菌感染根管情況

2.2菌落計數

經重復測量設計的方差分析可知，照射或沖洗前后各組根管內細菌減少量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.716，P=0.000）。照射或沖洗前后各組根管內細菌減少量兩兩比較，A組與B組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.680），A組與C組、D組、對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；C組與D組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），C組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.519）；D組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011）。照射、沖洗前后即刻菌落計數及菌落計數差值見附表。

2.3細菌復蘇實驗

經72 h復蘇后，所有標本都顯示根管內無雜菌污染，檢測見有大腸桿菌再生長。

附表　5組根管照射或沖洗前后根管內細菌量的變化（n=6，x±s）

3　討論

掃描電鏡觀察感染3周的標本可見單一的大腸桿菌菌種在離體牙根管內形成生物膜，并不同程度入侵牙本質小管深處。生物膜狀態(tài)存在的細菌較游離懸浮狀態(tài)更不易被機械和化學預備清除，在根管內長期存在導致持續(xù)感染[5]。而牙本質小管的直徑為1～4μm，直徑大多<1μm的細菌可輕易入侵并隱匿其中，躲避各種清除，在條件允許時再次進入根管腔引起感染，故有效地清除根管內細菌是提高根管治療成功率和降低再感染幾率的重要手段。

通過機械預備可以去除根管內的壞死牙髓組織、大部分細菌和根管內壁的感染物，但對侵入牙本質小管深處、側支根管、根管峽部和交通支等細微結構內的細菌及其產生的毒素，器械難以達到及清除[6]。同時，為達到控制感染的目的，過度的機械切割將降低根管牙本質壁的強度，提高牙根折裂的幾率[7]。藥物沖洗只對接觸、滲透到的區(qū)域有殺菌效應，其表面張力限制在根管系統(tǒng)狹窄部位擴散和清理，抗菌效果與藥物濃度、藥物使用量相關[8]。目前，應用較多的根管消毒藥物氫氧化鈣制劑具有良好的殺菌性，但氫氧化鈣消毒作用有賴于與牙本質的直接接觸，能與根管壁緊密貼合是其發(fā)揮功效的首要條件[9]。而根管系統(tǒng)解剖結構復雜，藥物無法充盈整個根管系統(tǒng)從而影響其充分的殺菌效能。

脈沖Nd：YAG激光是波長為1064nm的近紅外激光，穿透力強，定位準確，與生物體作用可產生多種效應，其產生的光熱效應、光化效應等能迅速殺滅細菌，滅活其代謝產物，改變或破壞微生物大分子原有結構致其死亡[10]。其可彎曲的光纖輸出末端，能夠插入根管至根尖孔區(qū)，操作方便，在根管治療尤其是根管消毒中具有優(yōu)勢[11]，近年來受到關注。

本實驗采用脈沖Nd：YAG激光照射或NaOCl沖洗大腸桿菌根管感染模型，菌落計數結果顯示各組根管內細菌量明顯減少。A組與B組的菌落計數差值比較，差異無統(tǒng)計學意義，而C組采用2.1 W激光重復照射3次后，菌落計數差值明顯增大，與A組、B組比較差異有統(tǒng)計學意義，表明激光重復照射比單次照射可取得更好的殺菌效果。提示臨床使用激光進行根管消毒時，為達到更好的殺菌效應而又避免激光光熱效應對牙根周圍組織的熱損傷，可在照射劑量安全值范圍內，采用一定間隔期的重復照射，減少每次照射的持續(xù)時間。

C組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，但兩種方法結合使用即D組殺菌效果明顯優(yōu)于單純激光照射或消毒沖洗，為5組中效果最好?？紤]與NaOCl對浸潤到的根管腔內的細菌具有較強的殺菌能力，而激光能去除根管內碎屑和玷污層[12]，具有一定的消毒深度，對牙本質小管深處及根管交通支等細微結構內的細菌殺菌力更強有關[13-14]，兩者聯(lián)合使用可互為補償，相互增效，從而達到更好的抗菌效果。對臨床難治性牙髓感染性疾病，采取NaOCl沖洗結合激光照射能產生協(xié)同抗菌效應，是提高臨床療效的較佳消毒方式。

在激光照射或NaOCl沖洗后所有標本根管內加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)72h，取樣檢測均有細菌生長。提示無論是激光還是NaOCl均不能完全殺滅根管內細菌，使根管處于滅菌狀態(tài)。激光殺菌作為傳統(tǒng)根管消毒方式的補充，利用其優(yōu)勢，與機械預備、藥物沖洗消毒等方法聯(lián)合使用，破壞根管內細菌生物膜結構，控制主根管、牙本質小管、管間交通支等部位的細菌，使根管系統(tǒng)內細菌數量降至最小，達到盡可能徹底清創(chuàng)的效果，從而保證感染根管治療的遠期療效，降低再感染的幾率。

參考文獻：

[1]雷蕾,韋曦,劉紅艷.感染根管致病菌及其控制方法的研究進展[J].中華口腔醫(yī)學研究雜志:電子版,2011,5(6):647-651.

[2]鄭穎,樊立潔,谷志遠.根管生物膜的研究進展[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2010,26(2):252-254.

[3]JHAJHARIA K,PAROLIA A,SHETTY K V,et al.Biofilm in endodontics:a review[J].J Int Soc Prev Community Dent,2015, 5(1):1-12.

[4]MOHAMMED A S,ENRICO D,CHRISTOPHER V H,et al.Enhanced removal of enterococcus faecalis biofilms in the root canal usingsodium hypochloriteplusphoton-inducedphotoacoustic streaming:an in vitro study[J].Photomed Laser Surg,2014,32(5): 260-266.

[5]樊明文.牙體牙髓病學[M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:264.

[6]黃定明,周學東.感染根管的治療難點和對策[J].華西口腔醫(yī)學雜志,2011,29(3):225-228.

[7]SANGOI B M,MORAES R D A,ROSA R A D,et al.Vertical root fractures and dentin defects:effects of root canal preparation, filling,and mechanical cycling[J].J Endod,2012,38(8):1135-1139.

[8]張榮德,董瑞紅,段彥盛,等.根管沖洗液對糞腸球菌作用的研究進展[J].國際口腔醫(yī)學雜志,2012,39(4):516-518.

[9]鐘素蘭,尹仕海.對氫氧化鈣根管消毒作用的再認識[J].國際口腔醫(yī)學雜志,2009,36(3):307-309.

[10]黎遠皋,王霄,謝克賢,等.Nd:YAG激光輔助根管內消毒的滅菌效果評價[J].北京大學學報（醫(yī)學版）,2014,46(5):821-823.

[11]NARASIMHA R K,RAMA S.Bacterial efficacy of Ca(OH)2against E.faecalis compared with three dental lasers on root canal dentin-an invitro study[J].J Clin Diagn Res,2014,8(11):135-137.

[12]PRASHANT P M,NAGESHWAR R.Cleaning and shaping the root canal with an Nd:YAG laser beam:a comparative study[J]. J Conserv Dent,2010,13(2):84-88.

[13]BERGMANS L,MOISIADIS P,TEUGHELS W,et al.Bactericidal effect of Nd:YAG laser irradiation on some endodontic pathogens ex vivo[J].Int Endod J,2006,39:547-557.

[14]MOHAMMAD A,NASSIMEH S.Disinfection of contaminated canals by different laser wavelengths,while performing root canal therapy[J].J Lasers Med Sci,2013,4(1):8-16.

（申海菊編輯）

中圖分類號：R 781.05

文獻標識碼：B

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.018

文章編號：1005-8982（2016）13-0092-04

收稿日期：2015-10-26

*基金項目：海口市重點科技計劃項目（No：2009-049-4）

In vitro experiment of antibacterial effect of Nd:YAG laser onEscherichia coliwithin tooth root canals*

Li Xing1，Xi Huang1，Ying-yu Pan1，Gen-hui Zhang1，Duo-rong Wu2，Xiao-jun Wen1
（1.Endodontic Department of Stomatology Center，2.Department of Laboratory Medicine，the Affiliated Haikou Hospital，Xiangya Medical School，Central South University，Haikou，Hainan 570208，China）

Abstract:Objective To evaluate the antibacterial effectiveness of Nd:YAG laser forEscherichia coli in infectious tooth root canalsin vitro.Methods Thirty anterior teeth inoculated withEscherichia coli for 3 weeks were randomly divided into 5 groups with 6 teeth in each group.In the experiment group A 1.5 W laser dose was applied to root canals for 30 s.In the group B 2.1 W laser dose was applied for 30 s.In the group C 2.1 W laser dose applied for 3 times，30 s for each irradiation time with an interval of 15 s.In the group D after the teeth were washed by 2.5%sodium hypochlorite，2.1 W laser was applied for 3 times，30 s each time.In the control group E the teeth were only washed by 2.5%sodium hypochlorite.Microbiological samples were collected from root canals for bacterial culture immediately before and after irradiation or irrigation，and the colony-forming units（CFU）were counted after 48 h to compare the effect of killingEscherichia coli in root canals.Results The bacteria in root canals significantly decreased after irradiation and/or irrigation，the differences were significant in each group.Pairwise comparison of the reduction of bacteria in root canals of each group was used.There was no statistical difference between the groups A and B（P＞0.05），but both group A and group B had significant differences from the groups C，D and E respectively（P＜0.05）. The group C had significant difference from the group D（P＜0.05），but had no significant difference from the control group（P＞0.05）.The group D had significant difference from the control group（P＜0.05）.Conclusions Both Nd:YAG laser and 2.5%sodium hypochlorite have antibacterial effects onEscherichia coliwithin root canals，and their combination is more effective.

Keywords:Nd:YAG laser；Escherichia coli；sodium hypochlorite；colony counting