喬　進(jìn)，竇志華，吳　鋒，孟國(guó)梁，陳　惠，鄭惠華

(1.南通市第三人民醫(yī)院 藥劑科，2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，江蘇 南通　226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通　226006)

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靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)的影響

喬進(jìn)1，竇志華1，吳鋒2，孟國(guó)梁2，陳惠3，鄭惠華3

(1.南通市第三人民醫(yī)院 藥劑科，2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，江蘇 南通226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通226006)

目的探討靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠心肌結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)的影響及其機(jī)制。方法高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ)30 mg·kg-1建立T2DM大鼠模型。模型動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、靈芝多糖組(靈芝多糖600 mg·kg-1)、二甲雙胍組(二甲雙胍600 mg·kg-1)及聯(lián)合用藥組(靈芝多糖300 mg·kg-1+二甲雙胍300 mg·kg-1)，另設(shè)正常對(duì)照組。給藥治療12周末測(cè)定大鼠空腹血糖，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(LVSP、LVEDP、dp/dtmax、-dp/dtmax)，VG染色法檢測(cè)大鼠左室心肌膠原容積積分(CVF)，免疫組化、蛋白印記法檢測(cè)心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表達(dá)。結(jié)果聯(lián)合用藥組大鼠空腹血糖明顯降低；聯(lián)合用藥能明顯改善糖尿病大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：降低LVEP，升高LVEDP、dp/dtmax、-dp/dtmax；聯(lián)合用藥組的CVF明顯降低；心肌組織MMP-2表達(dá)得到明顯抑制。結(jié)論靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍能明顯改善T2DM大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)糖尿病心肌病變有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

靈芝多糖；二甲雙胍；糖尿病大鼠；心肌結(jié)構(gòu)；血流動(dòng)力學(xué)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病心臟病變中特異性的心肌病變，最終能導(dǎo)致心臟功能減退、心功能衰竭[1]，是導(dǎo)致糖尿病患者晚期死亡的主要原因之一?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的蛋白活性改變?cè)谛募￠g質(zhì)纖維化過程中起著重要作用[2]。靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaccharide，GLPs)為多孔菌科真菌靈芝[Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst]中提取出來的以β(1→3)糖苷鍵為主鏈的雜多糖[3]。Xiao等[4]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的膠原蛋白合成，從而改善心肌纖維化。筆者先前研究證實(shí)靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍可通過抑制心肌氧化應(yīng)激，下調(diào)糖基化終末產(chǎn)物和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)來預(yù)防心肌纖維化[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠心肌結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)的影響，研究?jī)伤幝?lián)用對(duì)MMP-2蛋白的表達(dá)的抑制是否具有協(xié)同作用。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，使用前用0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液；靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司，純度74.03%，批號(hào)：100601)；二甲雙胍(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：67100507)；VG染色試劑(上?？婆d生物公司)；第二代免疫組化Elivision TM plus廣譜試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(海門碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鼠MMP-2多抗(武漢博士德生物工程有限公司)；辣根過氧化酶結(jié)合的羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；小鼠抗β-actin多克隆抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?；預(yù)染蛋白Marker(分子量6.5～175.0 ku，New England Biolabs)Super Singal化學(xué)發(fā)光試劑盒(PIERCE公司)；PVDF膜(Bio-Rad公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器One Touch血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材公司)；Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)(南京美易生物技術(shù)有限公司)；BH-NIC-B型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；IBAS2.5圖像分析系統(tǒng)(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室)；蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)；SH-100型凝膠圖像分析儀(上海復(fù)旦四星高科技技術(shù)公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理SD大鼠80只，♀♂各半，體質(zhì)量160～180 g，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012-0031。80只大鼠飼養(yǎng)在帶不銹鋼蓋底的塑料籠內(nèi)，每籠4只，自由飲水，室內(nèi)溫度為25℃，濕度為60%，飲水為普通自來水，飼料和水均可由大鼠自行隨意攝取。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON)和造模組。正常對(duì)照組10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組70只給予高脂飲食(基礎(chǔ)飼料70%、脂肪20%、蛋黃粉、5%奶粉5%)，喂養(yǎng)4周后禁食12 h，予STZ 30 mg·kg-1腹腔注射。1周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1即造模成功，繼續(xù)高脂飲食。取40只成模大鼠，隨機(jī)分為4組：糖尿病組(DM)；靈芝多糖組(GLPs)(靈芝多糖600 mg·kg-1)，二甲雙胍組(Met，二甲雙胍600 mg·kg-1),聯(lián)合用藥組(COM，靈芝多糖300 mg·kg-1+二甲雙胍300 mg·kg-1)。每日上午11 ∶00灌胃給藥1次，正常對(duì)照組和糖尿病組予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血糖測(cè)定給藥12周末，禁食12 h后，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。

1.4.2大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定將PE-50聚乙烯導(dǎo)管(內(nèi)徑0.5 mm，外徑1 mm)插入大鼠左心室腔，用與壓力傳感器相連的Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：左室收縮壓(LVSP)，左室舒張壓(LVEDP)，室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)，室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。每只大鼠取5段(10 s)的測(cè)定值，利用Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)計(jì)算各參數(shù)平均值。

1.4.3心肌膠原含量測(cè)定心肌組織常規(guī)切片脫蠟，蘇木精染色5 min，水洗。VG染色2 min，水洗。95%酒精分色，脫水后封片，觀察。染片結(jié)果用IBAS2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，其為膠原面積與心肌總面積的比值，其中膠原面積剔除血管周圍膠原面積，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野，取均值。

1.4.4免疫組化法檢測(cè)心肌組織MMP-2表達(dá)取部分心肌組織，常規(guī)固定，石蠟包埋。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中MMP-2的含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。各抗體按1 ∶50的方法稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，將切片置于高倍鏡下(×200)，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽性信號(hào)。采用JEDA801D型形態(tài)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定陽性信號(hào)所占面積及平均灰度，二者乘積(即積分光密度值)越大表明組織中該抗原含量越高。

1.4.5免疫印跡法檢測(cè)心肌MMP-2蛋白的表達(dá)取心肌組織100 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V；300 mA轉(zhuǎn)膜150 min；含有5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h，加入MMP-2和β-actin抗體4℃過夜。滴加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)1 h，掃膜并使用Image J進(jìn)行灰度分析。

2　結(jié)果

2.1大鼠空腹血糖糖尿病組空腹血糖水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.01)。用藥組空腹血糖水平均低于糖尿病組(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組下降幅度最大，并明顯低于單獨(dú)用藥組(P<0.05)。見Tab 1。

GroupBloodglucose/mmol·L-1CON3.51±0.25##DM19.13±0.81**GLPs11.16±0.33**##Met13.77±0.57**##COM7.35±0.64*##△

*P<0.05，**P<0.01vsCON；##P<0.01vsDM；△P<0.05vsMet or GLPs

2.2大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化第12周末，測(cè)定各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組的LVEDP上升(P<0.01)，LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax均下降(P<0.01)；與糖尿病組相比，給藥組均有明顯改善(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組效果明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥組(P<0.01)。見Tab 2。

2.3心肌組織病理學(xué)變化電鏡下觀察，正常對(duì)照組大鼠心肌肌節(jié)完整，肌絲、線粒體排列比較整齊。糖尿病組有不同程度的心肌變性、壞死，肌原纖維之間的糖原有減少；肌質(zhì)網(wǎng)腫脹并擴(kuò)張；線粒體大小不一，有腫脹和萎縮現(xiàn)象產(chǎn)生；微血管基底膜略增厚。各治療組心肌病變較糖尿病組明顯減輕，間質(zhì)膠原沉積較糖尿病組減少，微血管基底膜增厚減輕。見Fig 1。各組大鼠CVF的比較見Tab 3。

2.4免疫組化法檢測(cè)心肌組織MMP-2表達(dá)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IH)結(jié)果如圖2所示：大鼠心肌組織MMP-2免疫組化見細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽性信號(hào)。Fig 2可見，N組大鼠左室心肌組織MMP-2低表達(dá)，陽性顆粒散在，染色較淺；DM組高表達(dá)，棕黃色信號(hào)強(qiáng)，融合成片，而各治療組表達(dá)均明顯降低，其中聯(lián)合用藥組降低更為明顯。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用JEDA801D型形態(tài)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定陽性信號(hào)所占面積及平均灰度，二者乘積(即積分光密度值)越大表明組織中該抗原含量越高。結(jié)果見Tab 4。與N組相比，MMP-2的表達(dá)在DM組中明顯升高(P<0.01)；與DM組相比，3個(gè)治療組MMP-2的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的兩種蛋白表達(dá)最低(P<0.01)。

Tab 2　Hemodynamic changes of rats in each ±s，n=10)

**P<0.01vsCON；##P<0.01vsDM；△△P<0.01vsMet or GLPs

Fig 1　VG staining of myocardial tissue in rats(×100)

Fig 2　Immunohistochemistry of myocardium of left ventricle of rats(×200)A～E：MMP-2 A：CON；B：DM；C：GLPs；D：Met；E：COM

GroupCVF/%CON2.21±0.45##DM16.75±1.23**GLPs13.63±1.14**Met12.23±0.86**COM4.25±0.31##△△

**P<0.01vsCON；##P<0.01vsDM；△△P<0.01vsMet or GLPs

2.5免疫印跡法檢測(cè)心肌MMP-2蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果見Fig 3，β-actin(42 ku)作為內(nèi)參，在各組中有較均一的表達(dá)；MMP-2在各組中的蛋白條帶深淺不一。

用四星圖像處理系統(tǒng)測(cè)出各組MMP-2蛋白表達(dá)量與β-actin的表達(dá)量，并計(jì)算出其比值。DM組MMP-2蛋白的表達(dá)明顯高于N組(P<0.01)，與DM組相比，3個(gè)治療組的兩種蛋白表達(dá)均下調(diào)，聯(lián)合用藥組下調(diào)最為明顯(Tab 5)。

Tab 4　Expression of MMP-2 in myocardium of diabetic ±s，n=10)

*P<0.05，**P<0.01vsCON，##P<0.01vsDM

Tab 5　Western blot of MMP-2 in myocardium of diabetic ±s，n=10)

**P<0.01vsCON；#P<0.05，##P<0.01vsDM

Fig 3　Western blot of MMP-2 in myocardium of diabetic rats

1:CON；2: DM；3: GLPs；4: Met；5: COM

3　討論

本研究通過高脂飲食配合注射小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖與二甲雙胍干預(yù)，結(jié)果提示，糖尿病組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血糖維持高水平，聯(lián)合用藥組血糖明顯低于模型組(P<0.01)，并明顯低于單獨(dú)用藥組(P<0.05)。

DCM是糖尿病的重要慢性并發(fā)癥之一，其主要病理改變有細(xì)胞外基質(zhì)堆積、心肌纖維化、心肌肥厚及心肌重構(gòu)[6]。其中，心肌間質(zhì)纖維化是DCM心肌重構(gòu)的主要標(biāo)志，其通過降低心臟順應(yīng)性，導(dǎo)致心臟收縮及舒張功能障礙[7]。糖尿病心肌重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是糖尿病心臟病變導(dǎo)致心力衰竭的重要原因，具體機(jī)制仍不很清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展與MMPs有關(guān)[8]。

在衰竭心臟中，正常膠原組織被升高的MMPs降解后，被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維性間質(zhì)取代，從而導(dǎo)致室壁變薄，左室擴(kuò)張。因此，抑制MMPs的活性，減少正常心肌膠原的破壞可預(yù)防逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。MMPs是一大類鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，在結(jié)構(gòu)上具有同源性，并能有效降解心肌細(xì)胞外基質(zhì)，MMPs家族中MMP-2在心肌組織中表達(dá)水平較高，是心肌內(nèi)抗纖維化的重要成分之一[9]。MMP-2是明膠酶，可降解明膠、纖維黏連蛋白、層連蛋白及IV、V型膠原，還能啟動(dòng)纖維性膠原裂解過程。有報(bào)道MMP-2改變?cè)缬谧笫抑貥?gòu)，其活性改變可能觸發(fā)左室重構(gòu)。糖尿病大鼠心肌病變出現(xiàn)后早期MMP-2的活性和蛋白含量均增加，并可持續(xù)高表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2表達(dá)水平的降低參與了糖尿病大鼠心肌重構(gòu)的進(jìn)程[10]。大鼠給藥治療12周后，對(duì)每組大鼠心肌MMP-2表達(dá)進(jìn)行Immunohistochemistry與Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM組的MMP-2表達(dá)明顯升高，與DM組相比，3個(gè)治療組MMP-2的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組的兩種蛋白表達(dá)最低(P<0.01)。

心臟中的膠原成分對(duì)于維持心臟的形態(tài)、保證心肌細(xì)胞的規(guī)律性排列及心臟的有效收縮、舒張起主要作用，這種膠原形成的網(wǎng)絡(luò)是心臟的支架性結(jié)構(gòu)[11-12]。心肌纖維化導(dǎo)致的心室重構(gòu)可定義為膠原濃度明顯升高或膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于正常。DCM大鼠中，CVF明顯增加，反映心肌已纖維化。各給藥組中CVF明顯降低，而聯(lián)合用藥組CVF較單獨(dú)用藥組明顯降低，提示聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖與二甲雙胍的效果要優(yōu)于單獨(dú)使用。DCM導(dǎo)致的心室重構(gòu)后，心肌細(xì)胞壞死，原有的膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞。心肌的收縮和舒張功能受損，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組的LVEDP明顯上升(P<0.01)，LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax均明顯下降(P<0.01)，提示糖尿病大鼠心臟的收縮功能和舒張功能都出現(xiàn)了異常。使用藥物治療后能改善糖尿病大鼠心臟的血流動(dòng)力學(xué)，尤其是聯(lián)合使用靈芝多糖與二甲雙胍能明顯降低LVEDP，升高LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax，改善大鼠心肌舒縮功能，對(duì)心室重構(gòu)發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖和二甲雙胍在改善2型糖尿病大鼠模型心肌重構(gòu)方面明顯優(yōu)于單用，可能與調(diào)節(jié)心肌膠原容積分?jǐn)?shù)，改善心肌血流動(dòng)力學(xué)及下調(diào)心肌MMP-2的表達(dá)有關(guān)。在總的治療藥物劑量不變的情況下，聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物可減少單藥劑量，本研究中聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖與二甲雙胍，減少了兩藥的劑量，同時(shí)也降低了兩種藥物劑量過大對(duì)降血糖可能帶來的副作用。本研究結(jié)果提示，聯(lián)合使用靈芝多糖和二甲雙胍可能會(huì)成為今后臨床治療糖尿病心血管疾病的一個(gè)新的方向。有關(guān)MMP家族其他酶類，以及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)與MMP的平衡對(duì)心肌重構(gòu)的影響是本課題后續(xù)的進(jìn)一步研究，同時(shí)也進(jìn)一步研究?jī)煞N藥物在臨床上的適宜劑量及可能產(chǎn)生的副作用。

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Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin on myocardial structure and hemodynamics in type 2 diabetic rats

QIAO Jin1，DOU Zhi-hua1，WU Feng2，MENG Guo-liang2，CHEN Hui3，ZHEN Hui-hua3

(1.DeptofPharmacy，theThirdPeople’sHospitalofNantong, 2.DeptofPharmacology，MedicalCollege，NantongUniversity，NantongJiangsu226001，China；3.JiangsuAnhuiBiologicalTechnologyCo.Ltd，NantongJiangsu226006，China)

AimTo discuss the effects and mechanism of Ganoderma lucidum polysaccharides and metformin on myocardial structure and hemodynamics in type 2 diabetic rats.MethodsHigh fat diet combined with intraperitoneal injection of low dose streptozotocin 30 mg·kg-1was applied to establish rat model of type 2 diabetes mellitus. The diabetic rats were randomly into normal control group,diabetes group, ganoderma lucidum polysaccharides group(600 mg·kg-1), metformin group(600 mg·kg-1), combination group(ganoderma lucidum polysaccharides 300 mg·kg-1+metformin 300 mg·kg-1). After 12 weeks′ treatment,the levels of fasting serum glucose were determined and the hemodynamic parameters(LVSP,LVEDP,dp/dtmax,-dp/dtmax)were determined. Collagen volume fraction(CVF)was detected by Van Gieson. Immunohistochemical method and Western blot were used to detect myocardial tissue MMP-2 protein expression.ResultsThe fasting blood glucose was significantly decreased in the combined treatment group. Combined medication could significantly improve hemodynamic parameters in diabetic rats: reduced LVEP and raised LVEDP, dp/dtmax and -dp/dtmax. CVF was significantly decreased in combination group. The expression of MMP-2 in myocardial tissue was significantly inhibited.ConclusionsThe combination of Ganoderma lucidum polysaccharide and metformin can significantly improve the hemodynamic parameters in type 2 diabetic rats, and have a preventive effect on diabetic cardiomyopathy. The mechanism may be related to the down regulation of the expression of MMP-2.

Ganoderma lucidum polyccharide; metformin; diabetes mellitus rats; myocardial structure; hemodynamics; matrix metalloproteinase-2

2016-01-22,

2016-04-12

科技部十一五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No 2006DAI06A20-02)；江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目

喬進(jìn)(1985-)，男，碩士，主管藥師，研究方向：心血管藥理及臨床藥理研究，E-mail：felix_jo@163.com；竇志華(1966-)，男，博士，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新中藥，通訊作者，E-mail：zhihuadou@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.024

A

1001-1978(2016)07-1012-05

R-332；R284.1；R322.11；R331.3；R587.1；R977.15；R977.3

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.048.html