崔迎紅，孫姝雯，鄒　輝，任凱群，鄭　郁，全梅芳，宋振威，李　朵，曹建國

(湖南師范大學醫(yī)學院藥學系，湖南 長沙　410013)

?

8-溴-7-甲氧基白楊素抑制肝癌相關(guān)星狀細胞誘導內(nèi)皮細胞管結(jié)構(gòu)形成

崔迎紅，孫姝雯，鄒輝，任凱群，鄭郁，全梅芳，宋振威，李朵，曹建國

(湖南師范大學醫(yī)學院藥學系，湖南 長沙410013)

研究表明，80%的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是由于肝纖維化和炎癥引起的[1]。肝星狀細胞可被肝損傷等激活為肌成纖維細胞樣表型，活化的肝星狀細胞可參與腫瘤微環(huán)境的形成[2]；腫瘤血管生成與腫瘤微環(huán)境的形成有密切關(guān)系[3]。先前的研究證明，8-溴-7-甲氧基白楊素(8-bromo-7-methoxychrysin, BrMC)具有靶向抑制肝癌干細胞作用[4-5]。本文旨在研究BrMC是否可以抑制肝癌相關(guān)星狀細胞誘導內(nèi)皮細胞管結(jié)構(gòu)形成，并探討其作用機制是否涉及抑制信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)激活。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑 BrMC 根據(jù)文獻[6]合成，用二甲基亞砜(DMSO)稀釋，母液濃度為10 mmol·L-1；鼠抗人α-肌動蛋白(α-SMA) -Cy3單克隆抗體購于美國Sigma-Aldrich 公司；兔抗人成纖維細胞激活蛋白-α(FAP-α)、p-STAT3和STAT3多克隆抗體均購于美國Abcam公司。

1.2細胞與成球培養(yǎng)人肝星狀細胞系(LX-2)購于上海博谷生物技術(shù)有限公司，人肝癌SMMC-7721細胞系和人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細胞系購于中國上?？茖W院細胞庫。3種細胞系均用含胎牛血清和青、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。參照文獻[5]的方法進行成球培養(yǎng)，取第3代球形成細胞用于后續(xù)實驗。

1.3條件培養(yǎng)基的獲取取第3代干樣細胞，用BrMC(0.0、5.0、10.0、20.0 μmol·L-1)處理24 h，參照文獻[7]方法，獲得SMMC-7721肝癌干樣細胞條件培養(yǎng)基(LCSLC-CM)。取LX-2細胞，用LCSLC-CM處理24 h后，采用同樣的方法獲得肝癌相關(guān)星狀細胞條件培養(yǎng)基(LCAHSC-CM)。

1.4免疫熒光和免疫印跡實驗取LX-2及肝癌相關(guān)星狀細胞，按文獻[8]方法進行免疫熒光實驗，檢測α-SMA和FAP-α表達；提取各組細胞總蛋白，按文獻[5]方法，采用抗α-SMA、FAP-α、p-STAT3和STAT3抗體進行免疫印跡分析，以β-actin為內(nèi)參進行灰度分析。

1.5內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗采用LCAHSC-CM進行內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗。操作步驟參照文獻[9]方法進行。管結(jié)構(gòu)形成效率按照以下公式計算：管結(jié)構(gòu)形成率/%=各相應處理組管結(jié)構(gòu)均數(shù)/完全培養(yǎng)基處理組管結(jié)構(gòu)均數(shù)×100%。

2　結(jié)果

2.1肝癌相關(guān)星狀細胞的鑒定體外單層貼壁生長的肝星狀細胞呈星形或梭型，表達α-SMA，弱表達FAP-α蛋白；LCSLC-CM處理的肝星狀細胞(肝癌相關(guān)星狀細胞)偽足增加，表達α-SMA，但FAP-α蛋白表達明顯增加。免疫印跡也得到了相似的結(jié)果(P<0.05)。

2.2BrMC抑制LCAHSC-CM誘導的人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細胞管結(jié)構(gòu)形成LCAHSC-CM 孵育人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細胞，其內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)明顯多于肝星狀細胞條件培養(yǎng)基對照組。BrMC處理后，LCAHSC-CM對血管形成的促進作用明顯減弱，并且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3BrMC抑制肝癌相關(guān)星狀細胞STAT3蛋白磷酸化結(jié)果顯示，與未處理的體外單側(cè)貼壁生長肝星狀細胞相比，LCSLC-CM處理的肝星狀細胞STAT3磷酸化蛋白高表達，BrMC處理降低STAT3磷酸化水平，呈劑量依賴性。結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3　討論

肝星狀細胞在肝損傷中被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞。活化的肝星狀細胞及其周圍纖維化微環(huán)境可產(chǎn)生促進HCC進程作用[2]。另外大量研究證明肝癌干細胞是HCC復發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)[7]，LCSLC-CM處理的肝星狀細胞高表達FAP-α和α-SMA，說明SMMC-7721源性肝癌干樣細胞可以激活肝星狀細胞，使之呈肝癌相關(guān)成纖維細胞表型。

腫瘤血管生成對HCC發(fā)展進程起重要作用。Qu等[11]證明肝癌細胞和肝星狀細胞相互作用可以誘導肝癌血管生成。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LCAHSC-CM可以促進HUVEC-12細胞內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成，并且這一作用可被新型白楊素衍生物BrMC劑量依賴性抑制。同時，我們發(fā)現(xiàn)BrMC也可以降低肝癌相關(guān)星狀細胞STAT3磷酸化水平。

總之，我們的研究結(jié)果證明，肝癌干樣細胞可以活化肝星狀細胞，激活的肝星狀細胞可以促進腫瘤血管生成；并且這一作用可被BrMC通過抑制STAT3激活而減弱。因此，本研究的數(shù)據(jù)為BrMC通過抑制肝癌干樣細胞與肝星狀細胞之間的交互作用，抑制HCC血管生成作用提供了實驗證據(jù)。

(致謝:本研究在湖南師范大學醫(yī)學院實驗中心完成。感謝導師曹建國教授的悉心指導！感謝孫姝雯師姐以及鄒輝老師等人的幫助！)

[1]Wang B B, Cheng J Y, Gao H H, et al. Hepatic stellate cells in inflammation-fibrosis-carcinoma axis[J].AnatRec,2010,293(9): 1492-6.

[2]Yin C, Evason K J, Asahina K, et al. Hepatic stellate cells in liver development, regeneration, and cancer[J].JClinInvest, 2013, 123(5): 1902-10.

[3]Mittal K, Ebos J, Rini B. Angiogenesis and the tumor microenvironment: vascular endothelial growth factor and beyond[J].SeminOncol, 2014, 41(2): 235-51.

[4]曹曉正, 楊小紅, 曹建國, 等. 8-溴-7-甲氧基白楊素逆轉(zhuǎn)人宮頸癌SiHa細胞系球形成細胞上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化[J]. 中國藥理學通報, 2014,30(5): 668-71.

[4]Cao X Z, Yang X H, Cao J G, et al. 8-bromo-7-methoxychrysin reverses EMT of the sphere-forming cells derived from cervical cancer SiHa cell line[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(5): 668-71.

[5]Ren K Q, Cao X Z, Liu Z H, et al. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling[J].IntJOncol, 2013, 43(5): 1719-29.

[6]Zheng X, Meng W D, Xu Y Y, et al. Synthesis and anticancer effect of chrysin derivatives[J].BioorgMedChemLett, 2003, 13(5): 881-4.

[7]Jia C C, Wang T T, Liu W, et al. Cancer-associated fibroblasts from hepatocellular carcinoma promote malignant cell proliferation by HGF secretion[J].PloSOne, 2013, 8(5): e63243.

[8]Benzoubir N, Mussini C, Lejamtel C, et al. Gamma-smooth muscle actin expression is associated with epithelial-mesenchymal transition and stem-like properties in hepatocellular carcinoma[J].PloSOne, 2015, 10(6):e130559.

[9]曹建國. 血管基膜衍生多功能肽治療腫瘤主要藥效學及信號蛋白磷酸化比較研究[D]. 成都：中南大學, 2006.

[9]Cao J G. Investigation of prineipal phamraeodynmaies of malingnat tumor therapeutic action and comparison of phopshorylation of singaling proteins by vaseular basement membrance derived multifunctional peptide[D]. Chengdu: Central South University, 2006.

[10]Sukowati C H, Rosso N, Croce L S, et al. Hepatic cancer stem cells and drug resistance: Relevance in targeted therapies for hepatocellular carcinoma[J].WorldJHepatol, 2010, 2(3): 114-26.

[11]Qu H, Yang X. Metformin inhibits angiogenesis induced by interaction of hepatocellular carcinoma with hepatic stellate cells[J].CellBiochemBiophys, 2015, 71(2): 931-6.

8-bromo-7-methoxychrysin inhibits tube formation of endothelial cells induced by liver cancer-associated stellate cells

CUI Ying-hong, SUN Shu-wen, ZOU Hui, REN Kai-qun, ZHENG Yu, QUAN Mei-fang, SONG Zhen-wei, LI Duo, CAO Jian-guo

(DeptPharmaceuticalScience,MedicalCollege,HunanNormalUniversity,Changsha410013,China)

SMMC-7721干樣細胞；肝癌星狀細胞；BrMC；STAT3；內(nèi)皮細胞；管結(jié)構(gòu)形成

SMMC-7721 stem-like cells; liver cancer-associated stellate cells; BrMC; STAT3; endothelial cells; tube formation

2016-01-26,

2016-04-17

國家自然科學基金面上項目(No 81172375)；國家自然科學青年基金項目(No 30760248)

崔迎紅(1992-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail:599085292@qq.com;曹建國(1956-)，男，博士，博士生導師，教授，研究方向：腫瘤藥理學，通訊作者，Tel: 0731-88912434; E-mail: caojianguo2005@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.029

A文章編號：1001-1978(2016)07-1035-02

R322.47；R329.24；R735.7；R916.4

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.058.html