張業(yè)昊，叢偉紅，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京　100091)

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西紅花苷對缺氧復(fù)氧損傷的SH-SY5Y細胞線粒體動力學(xué)的影響

張業(yè)昊，叢偉紅，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京100091)

目的探討西紅花苷對缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷的人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)線粒體的保護作用及可能的機制。方法SH-SY5Y細胞OGD損傷同時給予藥物，4 h后復(fù)氧2 h，測定線粒體膜電位、胞內(nèi)鈣離子濃度；免疫熒光、免疫印跡法檢測細胞線粒體Drp1、Opa1、Mfn1、Mfn2含量變化。結(jié)果SH-SY5Y細胞缺氧后線粒體膜電位明顯降低，胞內(nèi)鈣離子濃度升高；西紅花苷明顯提高OGD損傷引起的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位，降低胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制Drp1表達量，上調(diào)Opa1表達量。結(jié)論西紅花苷對OGD損傷的SH-SY5Y細胞具有明顯的保護作用，恢復(fù)其線粒體功能，起保護作用機制可能與抑制線粒體分裂融合異常有關(guān)。

西紅花苷；SH-SY5Y細胞；線粒體分裂融合；OGD；Drp1；Opa1

短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)是頸動脈或椎-基底動脈系統(tǒng)發(fā)生短暫性血液供應(yīng)不足，引起局灶性腦缺血導(dǎo)致突發(fā)的、短暫性、可逆性神經(jīng)功能障礙。近年大量研究表明，腦缺血/再灌注后引起線粒體功能障礙，包括氧自由基損傷、鈣超載、線粒體膜電位的改變、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)異常開放、線粒體結(jié)構(gòu)損傷等[1]。線粒體是一種處于高度動態(tài)變化的細胞器，頻繁的融合分裂形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，來維持其正常功能與形態(tài)，并參與細胞的能量代謝、自噬與凋亡等，這種動態(tài)的變化稱為線粒體分裂融合(mitochondrial fission and fusion)，也稱為線粒體動力學(xué)(mitochondrial dynamics)[2]。因而，探討腦缺血/再灌注后線粒體分裂融合的改變，即線粒體動力學(xué)異常，以及尋找干預(yù)手段，抑制線粒體分裂融合失衡，恢復(fù)其正常功能與形態(tài)，對腦缺血/再灌注后的治療具有重要意義。西紅花苷(crocin)是中藥西紅花的提取物之一，由西紅花酸(crocetin)與二分子龍膽二糖結(jié)合而成，包括西紅花苷I與西紅花苷II，又稱為西紅花素、藏紅花素，是一類水溶性的類胡蘿卜素，二者都屬于二萜類，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及抗腫瘤方面的研究非常廣泛。實驗表明，西紅花苷可以提高大鼠的空間認知能力[3]，明顯提高海馬區(qū)SOD、GPx、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧酶的活性[4]，并且西紅花苷能有效抑制GRK-2的轉(zhuǎn)運，降低ERK1/2的磷酸化[5]，以抑制腦梗、腦缺血等造成的大鼠腦部損傷。本研究以SH-SY5Y細胞OGD模型，模擬腦缺血神經(jīng)細胞損傷，觀察線粒體形態(tài)的改變及線粒體分裂融合的異常，并從抑制線粒體動力學(xué)異常的角度探討治療腦缺血/再灌注、改善記憶障礙的可能機制，對相關(guān)中藥治療腦缺血疾病具有借鑒意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院；DMEMF12培養(yǎng)基(31600-034)、胰酶(0458)、優(yōu)級胎牛血清購自Gibco公司；DMSO(D-5879)購自Sigma公司；MTT購自東仁化學(xué)科技有限公司；JC-1熒光探針購自Sigma公司；Fluo3熒光探針、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液(強)、PMSF均購自碧云天生物技術(shù)公司；Drp1抗體、COXIV抗體購自CST公司，Opa1抗體購自Santa Cruz公司；線粒體/胞質(zhì)制備試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司；彩色蛋白Marker、ECL發(fā)光液購自Thermo公司；西紅花苷(含西紅花苷I、西紅花苷II)購自北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，HPLC≥98%；MCO175 CO2培養(yǎng)箱(Sanyo)；Sh1倒置顯微鏡(Olympus)；SYNERGYTM4酶標儀(BioTek)；IEC低溫冷凍離心機(美國Thermo公司)；奧豪斯AR2130型電子天平(美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、OGD模型和給藥SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于DMEMF12培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素)，置于37℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。棄去培養(yǎng)液，每孔或皿加入預(yù)先以95% N2～5% CO2混合氣飽和15 min的無糖DMEM 200 μL或2 mL。將96孔板或35 mm培養(yǎng)皿敞蓋，放入缺氧盒內(nèi)，通入95% N2～5% CO2混合氣，流速1 L·min-1。測氧儀實時監(jiān)測出口氧氣濃度，當氧氣濃度為1%時，停止通氣，夾閉進氣管和出氣管，將缺氧盒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，此過程為缺氧。夾閉進氣管和出氣管，并將缺氧盒置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)4 h進行缺氧。復(fù)氧：打開缺氧盒，取出培養(yǎng)皿，吸出缺氧液，每孔或每皿加入200 μL或2 mL含糖DMEM，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h。西紅花苷均采用DMSO溶解，于缺氧同時給藥。

1.2.2細胞活力的測定將細胞濃度為6×105個每毫升接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于實驗，藥物劑量設(shè)置西紅花苷：31.25、62.5、125、250、500 mg·L-1，均采用DMSO溶解。培養(yǎng)好的細胞，正常組加入無血清DMEM，其余組加入相應(yīng)濃度DMSO或藥物。藥物作用24 h后，每孔加入MTT溶液100 μL,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸去MTT液，每孔加入DMSO 100 μL；將96孔板置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解后，酶標儀570 nm波長處檢測OD值，同時確定藥物最佳給藥劑量。1.2.3流式對SH-SY5Y細胞線粒體膜電位(△Ψm)的測定將SH-SY5Y細胞以6×105個每毫升的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，于缺氧初給藥。各組細胞復(fù)氧2 h后，胰酶消化細胞約7～8 min，收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；陽性對照管中，先以含有50 μmol·L-1CCCPPBS重懸細胞，37℃，孵育5 min；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；PBS洗滌1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；各組細胞均以含2 μmol·L-1JC-1的PBS重懸，調(diào)整細胞濃度為106個每毫升；37℃，5% CO2，孵育30 min；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；37℃預(yù)熱的PBS清洗細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入500 μL PBS輕輕混勻細胞，轉(zhuǎn)移至測定管中；流式細胞儀檢測：設(shè)置激發(fā)光488 nm，綠色熒光發(fā)射光為529 nm，紅色熒光發(fā)射光為590 nm。

1.2.4流式對SH-SY5Y細胞胞內(nèi)鈣離子濃度的測定將SH-SY5Y細胞以6×105個每毫升的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，于缺氧初給藥。胰酶消化細胞約7～8 min，收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；各處理組細胞加入5 μmol·L-1的Fluo-3AM應(yīng)用液200 μL重懸細胞，于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育45 min；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；37℃預(yù)熱的PBS清洗細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入500 μL PBS輕輕混勻細胞，轉(zhuǎn)移至測定管中；流式細胞儀檢測：設(shè)置激發(fā)光488 nm，檢測熒光強度，結(jié)果用相對值表示，鈣離子相對熒光強度=FI測量值/FI溶劑對照。

1.2.5免疫熒光對SH-SY5Y細胞胞內(nèi)Drp1、Opa1蛋白表達的測定6孔板里鋪上蓋玻片，將細胞分在此六孔板上，待細胞密度達到50%～80%時即可做后續(xù)實驗，細胞做OGD處理；PBS清洗，加入2 mL甲醇室溫孵育30 min；封閉30 min，孵育目的蛋白，制好的片子4℃保存，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。1.2.6Western blot檢測蛋白水平將SH-SY5Y細胞以每皿5×106的密度接種于9 cm培養(yǎng)皿中，收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，按普利萊線粒體/胞質(zhì)制備試劑盒說明書提取線粒體，裂解線粒體后，BCA法測定蛋白含量并定質(zhì)量濃度至0.5 g·L-1，進行蛋白表達檢測。蛋白含量測定后，進行聚丙烯胺凝膠電泳(SD-SPAGE)，采用相關(guān)抗體進行Western blot檢測，增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemi-luminescence，ECL)。

2　結(jié)果

2.1西紅花苷對正常培養(yǎng)SH-SY5Y細胞活力的影響與正常組相比較，2% DMSO對正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞活力沒有影響。與2% DMSO對照組相比，西紅花苷在31.25～62.5 mg·L-1范圍對正常培養(yǎng)的SY-SY5Y細胞活力不產(chǎn)生影響，同時選定最佳濃度25及50 mg·L-1。見Tab 1。

GroupConcentration/mg·L-1Cellviability/OD570Sham-0.827±0.0192%DMSO-0.816±0.02631.250.815±0.02862.50.775±0.012Crocin1250.617±0.012**2500.461±0.047**5000.266±0.062**

**P<0.01vs2% DMSO

2.2西紅花苷提高OGD損傷SH-SY5Y細胞△Ψm與正常組相比較，缺氧4 h/復(fù)氧2 h后，JC-1紅綠熒光比值明顯降低，表明SH-SY5Y細胞△Ψm明顯降低(P<0.01vsSham)；與模型組比較，西紅花苷50 mg·L-1可明顯阻止△Ψm降低(P<0.05或P<0.01vsOGD)，見Fig 1。

Fig 1　Effect of crocin on △Ψm

*P<0.05,**P<0.01vsOGD

2.3西紅花苷降低OGD損傷SH-SY5Y細胞胞內(nèi)鈣離子濃度Ca2+熒光強度明顯升高，與模型組相比，西紅花苷預(yù)處理后細胞內(nèi)Ca2+熒光強度降低，且差異有顯著性(P<0.05，P<0.01vsOGD)，見Fig 2。

2.4西紅花苷升高Opa 1表達，降低Drp 1表達通過熒光顯微鏡可觀察到，正常組SH-SY5Y細胞內(nèi)Drp1表達量低，而Opa1熒光強度較高，而缺氧4 h/復(fù)氧2 h后，模型組細胞Drp1熒光強度較正常組升高，而Opa1熒光強度降低；與模型組比較，西紅花苷50 mg·L-1能明顯降低Drp1熒光強度(紅色)，增強Opa1熒光強度(綠色)，如Fig 3所示。2.5西紅花苷對SH-SY5Y細胞線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白表達的影響為進一步探西紅花苷對OGD損傷SH-SY5Y細胞的線粒體保護作用機制，本實驗通過免疫印跡的方法，觀察SH-SY5Y細胞內(nèi)蛋白Drp1、Opa1表達。結(jié)果顯示，與正常組相比較，OGD損傷導(dǎo)致SH-SY5Y細胞Drp1蛋白表達明顯增加，同時，Opa1蛋白表達量明顯降低；與模型組比較，西紅花苷50 mg·L-1能明顯降低Drp1表達量，增高Opa1表達量(P<0.01,P<0.05vsOGD)，見Fig 4、5。

Fig 2　Effect of crocin on intracellular calcium concentrations

*P<0.05vsOGD.

Fig 3　Effect of crocin on expressions of Opa1 and Drp1 induced by OGD

Fig 4　Effect of crocin on expressions of Opa1 in

A: Protein levels of Opa1; B: The protein levels quantified by band gray-value ratio to COXIV.*P<0.05,**P<0.01vsOGD

3　討論

線粒體融合分裂的動態(tài)平衡是神經(jīng)元末梢長距離運輸和能量平均分布的基本保證[6]，對于神經(jīng)元而言，線粒體的動力學(xué)過程具有非常重要的生物學(xué)意義。神經(jīng)元的各項生物活動均需要消耗能量，而這些能量的供給幾乎全部源于線粒體。當線粒體的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)障礙時，尤其當線粒體氧化磷酸化過程發(fā)生障礙時，神經(jīng)元不能像其他類型的細胞一樣，啟動糖酵解過程進行能量代償，導(dǎo)致細胞內(nèi)pH值下降而引起細胞酸中毒，線粒體膜電位下降。隨著缺血時間的延長，線粒體自身結(jié)構(gòu)與功能會受到嚴重損害，進而使細胞走向死亡之路。若能抑制線粒體動力學(xué)異常，進一步恢復(fù)線粒體形態(tài)，維持其正常功能，可能在腦缺血損傷早期起到保護神經(jīng)元的作用。

Fig 5　Effect of crocin on expressions of Drp1 in

A: Protein levels of Drp1; B: The protein levels quantified by band gray-value ratio to COXIV.**P<0.01vsOGD.

線粒體的動態(tài)變化過程受多個線粒體融合分裂相關(guān)蛋白精確控制，其中，線粒體外膜的融合依賴兩種線粒體融合蛋白，即mitofusin 1(Mfn 1)和mitofusin 2(Mfn 2)。其主要功能是促進線粒體外膜的融合[7]。Mfn 1、Mfn 2的缺陷會導(dǎo)致線粒體融合障礙、出現(xiàn)大量碎片狀線粒體。線粒體內(nèi)膜的融合由視神經(jīng)萎縮蛋白1(opticatrophy 1，OPA1)介導(dǎo)，除了參與線粒體融合的控制以外，OPA1對于線粒體嵴結(jié)構(gòu)的維持非常重要，OPA1的缺失可導(dǎo)致因線粒體嵴重構(gòu)，導(dǎo)致細胞色素C釋放[8]。線粒體分裂由Drp1(dynamin-like protein1)和Fis1(fission1)調(diào)控，其中Drp1存在于胞質(zhì)中，由Fis1招募至線粒體外膜，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)逐漸收縮致使線粒體分裂。實驗證實，過表達Drp1分子可以加速線粒體的分裂，從而產(chǎn)生大量片段化的線粒體。線粒體分裂和融合都具有重要的生理作用,對維持健康的線粒體都非常關(guān)鍵。線粒體融合可使線粒體DNA維持正常結(jié)構(gòu)防止突變,阻止細胞發(fā)生凋亡[9]。線粒體融合蛋白Opa1可對抗各種典型和非典型的凋亡刺激所誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)[10-11]。線粒體分裂后,膜電位相對高的子線粒體發(fā)生融合,而膜電位相對低的子線粒體發(fā)生自噬,因此，線粒體融合似乎通過內(nèi)容物的混合可使蛋白相互補充,代謝物均勻分配,突變DNA得以修復(fù),保持細胞內(nèi)線粒體的完整性和同質(zhì)性[12]。而線粒體過度分裂即碎裂可能促進細胞凋亡[13]。本研究證實，SH-SY5Y細胞OGD后線粒體Drp1表達上升，Opa1表達下降，這二者的失衡標志著細胞內(nèi)線粒體正常形態(tài)破壞，線粒體分裂融合失衡，因此，線粒體動力學(xué)異?？赡茉谌毖阅X血管病的發(fā)病機制中具有重要作用。

已有的研究報道發(fā)現(xiàn)，西紅花苷可降低腦缺血/再灌后腦梗死面積，對神經(jīng)元具有保護作用[14]，并能明顯降低缺血皮層MDA(丙二醛)含量，提高GPx(谷胱甘肽過氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)活性[15]。從本研究看出，西紅花苷可有效改善OGD損傷細胞后的能量代謝，恢復(fù)線粒體膜電位，降低胞內(nèi)鈣離子濃度；進一步實驗觀察到，西紅花苷可以有效下調(diào)Drp1表達，上調(diào)Opa1表達。以上實驗證實了西紅花苷能改善OGD損傷SH-SY5Y細胞的能量代謝異常，而其改善能量代謝的途徑是改善線粒體動力學(xué)異常，恢復(fù)線粒體正常的融合分裂。越來越多的研究證明，線粒體動力學(xué)異常參與諸多疾病的發(fā)展過程，因此，進一步探索腦缺血后線粒體分裂融合的變化及設(shè)立時間點尋找其變化規(guī)律，尋找相關(guān)藥物作用靶點，對于防治缺血性腦血管病、促進腦缺血后神經(jīng)發(fā)生及記憶的恢復(fù)具有一定意義。

(致謝：本實驗在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所由劉建勛老師、叢偉紅老師、李澎老師指導(dǎo)下完成，感謝各位老師的幫助。)

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Effect of crocin on mitochondrial dynamics in SH-SY5Y cells against injury induced by oxygen-glucose deprivation

ZHANG Ye-hao, CONG Wei-hong, LIU Jian-xun

(InstituteofBasicMedicalSciencesofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，BeijingKeyLaboratoryofPharmacologyofChineseMateria,Beijing100091,China)

AimTo investigate the protective effects of crocin on SH-SY5Y cells damaged by oxygen-glucose de privation(OGD)，and explore its functional mechanisms.MethodsThe cells were treated with drugs for 4 h of OGD. Subsequently, mitochondrial membrane potential(MMP) and the concentration of intracellular Ca2+were measured by flow cytometer. The levels of Drp1，Opa1 were evaluated by Western blot.ResultCrocin inhibited OGD-induced neuronal injury through attenuating apoptotic cell death. The inhibitor also preserved mitochondrial function, as evidenced by MMP. Moreover, crocin significantly suppressed mitochondrial Ca2+up take and increased the level of protein Opa1 and decreased the level of protein Drp1.ConclusionThe results demonstrate that crocin shows good neuroprotective effects on SH-SY5Y cells after oxygen glucose deprivation.The underlying mechanisms may be associated with inhibition of mitochondrial dys function.

crocin；SH-SY5Y cell；mitochondrial fission and fusion；oxygen-glucose deprivation；Drp1；Opa1

2016-02-10,

2016-04-24

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(No 2015CB554405)

張業(yè)昊(1989-)，女，博士生，研究方向：腦血管藥理，E-mail: zyp22@163.com;劉建勛(1955-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥藥理,E-mail:liujx0324@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.020

A

1001-1978(2016)07-0986-06

R284.1；R329.24；R730.264；R845.22

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.040.html