潘國(guó)聘，張小毅，李東亮，趙紅崗，劉瑞麗

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南 新鄉(xiāng)　453003)

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硫化氫對(duì)腎血管性高血壓大鼠動(dòng)脈舒張功能的調(diào)節(jié)作用

潘國(guó)聘1，張小毅1，李東亮2，趙紅崗2，劉瑞麗1

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南 新鄉(xiāng)453003)

目的探討硫化氫(H2S)對(duì)腎血管性高血壓模型大鼠血壓及頸總動(dòng)脈血管舒張功能的影響。方法采用“兩腎一夾(2K1C)”法建立腎血管性高血壓模型。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、雙腎一夾(2K1C)模型組、2K1C+NaHS(H2S供體)組及PPG(H2S代謝酶抑制劑)組。術(shù)前及術(shù)后每周測(cè)量1次大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。測(cè)定頸總動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)(血管外周、壁厚、壁厚與外周徑的比值)，觀察頸總動(dòng)脈的ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張作用；免疫組化檢測(cè)頸總動(dòng)脈一氧化氮合成酶(eNOS)、內(nèi)皮素-1(ET-1)的表達(dá)。結(jié)果PPG組及2K1C組大鼠尾動(dòng)脈血壓與sham組比較明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，2K1C+NaHS組血壓明顯降低，大鼠頸總動(dòng)脈壁厚外徑比減小，頸總動(dòng)脈對(duì)ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張效應(yīng)增強(qiáng)，頸總動(dòng)脈一氧化氮合成酶(eNOS)含量升高、ET-1含量降低。結(jié)論給予外源性的硫化氫供體可降低血壓，緩解腎血管性高血壓的形成，其作用可能與改善頸總動(dòng)脈血管功能有關(guān)。

硫化氫；腎血管性高血壓；兩腎一夾；內(nèi)皮依賴(lài)性；eNOS；ET-1

腎血管性高血壓(renovascular hypertension, RVH)是一種常見(jiàn)的繼發(fā)性高血壓，其發(fā)生的機(jī)制尚未完全明了。H2S是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后被發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[1-2]，在各系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理學(xué)及病理生理學(xué)作用[3]。研究表明，內(nèi)源性H2S在維持正常血壓和保持血管舒張功能方面非常重要，其內(nèi)源生成減少也參與高血壓等多種疾病的病理生理過(guò)程[4]。那么，外源性給予H2S能否降低腎血管性高血壓大鼠的動(dòng)脈血壓，以及H2S對(duì)腎血管性高血壓大鼠血管舒張功能的調(diào)節(jié)作用如何呢？本研究以2K1C法建立腎血管性高血壓大鼠模型，觀察H2S對(duì)腎性高血壓大鼠血壓及血管功能的調(diào)節(jié)作用并探討可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康4～5月齡清潔級(jí)♂ Wistar大鼠，體質(zhì)量為200～300 g，常規(guī)大鼠飼料及凈化自來(lái)水飼養(yǎng)。待大鼠適應(yīng)環(huán)境, 血壓穩(wěn)定后, 開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與藥品硫氫化鈉(NaHS)、乙酰膽堿(ACh)，購(gòu)自sigma公司； eNOS、ET-1抗體，由Abcam公司提供；山羊抗兔多克隆抗體(二抗)由Proteintech公司提供；NaHS及PPG溶液于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備與分組根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，制備兩腎一夾(2K1C)腎血管性高血壓模型?！?Wistar大鼠在術(shù)前禁食。用30 g·L-1的水合氯醛(1 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉，固定于鼠板，無(wú)菌操作，在左側(cè)腎臟區(qū)域做切口，腹膜外進(jìn)入，打開(kāi)腹腔，暴露左側(cè)腎臟。分離左側(cè)腎動(dòng)脈，把直徑為0.20 mm的針灸針與血管長(zhǎng)軸并置，并用手術(shù)絲線(xiàn)(4號(hào))結(jié)扎，然后拔出針灸針造成左側(cè)腎動(dòng)脈狹窄，右腎未觸及，假手術(shù)組方法相同但不結(jié)扎左腎動(dòng)脈。模型判斷標(biāo)準(zhǔn)：造模后血壓比造模前高2.66 kPa(大于正常血壓3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)以上，且收縮壓高于18.62kPa視為模型成功，達(dá)到腎血管性高血壓的標(biāo)準(zhǔn)，血壓未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)的模型大鼠棄之不用。造模成功大鼠隨機(jī)分為2KIC組(n=7只)，2KIC+NaHS組(n=8只)，PPG組(n=7只)。另設(shè)假手術(shù)組6只。2KIC+NaHS組從術(shù)后第二日每日腹腔注射N(xiāo)aHS(56 μmol·kg-1)[6]，PPG組每日腹腔注射0.25 mL PPG(37.5 mg·kg-1)，假手術(shù)組、2KIC組每日腹腔注射0.25 mL無(wú)菌注射用水作為對(duì)照，連續(xù)用藥4周。

1.3.2血壓測(cè)定術(shù)前及術(shù)后每周，采用尾容積法測(cè)清醒時(shí)大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)。測(cè)量前大鼠預(yù)熱10～15 min，將鼠尾套入尾套，待動(dòng)物安靜后充氣測(cè)收縮壓，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3血管形態(tài)學(xué)觀察頸總動(dòng)脈用體積分?jǐn)?shù)為0.1的甲醛固定、沖水、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、染色、封固。電腦圖形分析儀檢測(cè)頸總動(dòng)脈外周徑、壁厚、壁厚外周徑比。

1.3.4頸總動(dòng)脈舒縮反應(yīng)的測(cè)定采用RM-6240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。取約3～4 mm的頸總動(dòng)脈置于盛有K-H液的 37℃恒溫浴槽中，將其一端掛于鋼絲上，另一端與張力換能器相連，持續(xù)記錄血管環(huán)張力變化。先用收縮劑去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE 1 μmol·L-1)預(yù)收縮后，再累積加入ACh溶液，持續(xù)記錄血管的張力變化。

2　結(jié)果

2.1血壓的變化腎動(dòng)脈狹窄術(shù)后1周，2K1C組大鼠血壓即有明顯升高，且明顯高于sham組[(21.29±0.51) kPavs(14.63±0.55) kPa,P<0.05]；2K1C+NaHS組血壓升高，但與2K1C組相比，沒(méi)有明顯差異；PPG組血壓比sham組略高，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第2周開(kāi)始，2K1C+NaHS組血壓開(kāi)始逐漸降低，術(shù)后3周與2KIC組比較差異具有顯著性(P<0.05)；PPG組血壓逐漸升高，術(shù)后4周與sham組比較差異具有顯著性(P<0.05)。

Tab 1　Changes of rat tail artery blood pressure in different ±s,kPa)

#P<0.05 2K1C groupvssham group;*P<0.05 2K1C+NaHS groupvs2K1C group;△P<0.05 PPG groupvssham group

2.2血管形態(tài)學(xué)改變?cè)陲@微鏡下觀察結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠比較，2KIC組及PPG組大鼠的血管外周徑、壁厚及壁厚與血管外周徑的比值均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2K1C+NaHS組血管形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善(Tab 2)。

#P<0.05 2K1C groupvssham group;*P<0.05 2K1C+NaHS groupvs2K1C group;△P<0.05 PPG groupvssham group

Tab 2　Comparison of morphometric parameters

*P<0.05 2K1C,PPGvssham；△P<0.05 2K1C+NaHSvs2K1C

2.3血管舒縮反應(yīng)在各組均觀察到ACh(10-8～10-4mol·L-1)劑量依賴(lài)性地血管舒張反應(yīng)。外源性給予H2S(2K1C+NaHS組)能明顯增加模型大鼠內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)，與2KIC組比較，差異有顯著性(P<0.05)(Fig 2)。

2.4血管中eNOS；ET-1的表達(dá)見(jiàn)Fig 3，4。由圖可見(jiàn)，2K1C和PPG組ET-1蛋白表達(dá)高于sham組(P<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)降低；與2K1C組比較，2K1C+NaHS組ET-1表達(dá)明顯降低(P<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)有所升高，差異有顯著性。

3　討論

在術(shù)后的第1周，2K1C組大鼠收縮壓即明顯升高，達(dá)到高血壓模型診斷標(biāo)準(zhǔn)，表明模型制備成功。對(duì)腎血管性高血壓大鼠外源性補(bǔ)充H2S(2K1C+NaHS組)，升高的血壓逐漸降低，提示H2S 不僅可以防止高血壓的進(jìn)一步發(fā)展，還可以降低已經(jīng)升高的腎血管性高血壓大鼠的血壓；以往的研究表明，內(nèi)源性H2S參與基礎(chǔ)血壓的維持和高血壓的發(fā)展[7]。PPG(DL-propargylglycine)為硫化氫代謝酶抑制劑，抑制內(nèi)源性H2S的合成。我們給大鼠腹腔注射PPG，結(jié)果血壓在術(shù)后1周略有升高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與給藥時(shí)間較短，對(duì)內(nèi)源性H2S的抑制作用較弱有關(guān)。隨著PPG的持續(xù)給藥，體內(nèi)H2S的生成逐步被抑制，血壓也逐步升高并發(fā)展成高血壓。這些都說(shuō)明，體內(nèi)H2S體系參與腎血管性高血壓的形成和發(fā)展。

Fig 2　Endothelium-dependent relaxation of carotid artery induced by Ach in different groups

Fig 3　The protein expression of eNOS in different groups

Fig 4　The protein expression of ET-1 in different groups

有研究證實(shí)，H2S可以通過(guò)舒張血管平滑肌、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖而調(diào)節(jié)血管重構(gòu)發(fā)揮抗高血壓的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎血管性高血壓大鼠由于血管平滑肌細(xì)胞增殖使血管壁變厚，壁厚與外周徑的比值增大；外源性給予H2S后，血管壁厚及壁厚與外周徑的比值均減小，說(shuō)明H2S可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，抑制血管的重構(gòu)。血管的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)結(jié)果也顯示發(fā)生腎血管性高血壓時(shí)血管舒張能力減弱，而H2S可改善ACh介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)，改善血管的舒縮功能，抑制血壓的升高。有研究表明，內(nèi)源性的H2S可以獨(dú)立或與NO協(xié)同舒張血管平滑肌[9]，H2S改善其內(nèi)皮依賴(lài)的舒血管效應(yīng)可能還與其調(diào)節(jié)內(nèi)皮釋放NO有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了NO/cGMP信號(hào)途徑的關(guān)鍵酶eNOS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組eNOS表達(dá)減少，進(jìn)一步證明了NO減少在高血壓的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，而H2S可以明顯增加模型大鼠eNOS的表達(dá)，獨(dú)立或與NO協(xié)同舒張血管，降低血壓。內(nèi)皮素(endothelin,ET)是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)[10]，參與高血壓狀態(tài)的發(fā)生與維持。本研究檢測(cè)了主要表達(dá)的ET-1的含量，發(fā)現(xiàn)在模型中ET-1表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而外源性給與H2S可以明顯增加降低大鼠ET-1的表達(dá)。

NO和ET的生成量及二者之間平衡的失調(diào)是動(dòng)脈內(nèi)皮受損的明顯特征，血管內(nèi)皮受損又導(dǎo)致其功能紊亂，而血管內(nèi)皮功能紊亂最重要、最早期的表現(xiàn)就是血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的減弱或喪失，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。而H2S可以明顯增加eNOS的表達(dá)，減少ET-1表達(dá)，恢復(fù)維持血管結(jié)構(gòu)和功能的這種平衡，這可能是其改善血管的舒縮功能，抑制血壓升高的機(jī)制之一。

(致謝:感謝新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室李東亮教授和趙紅崗老師給予本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和支持! )

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Effects of hydrogen sulfide on arterial vasodilatation function of renal hypertensive rats

PAN Guo-pin1，ZHANG Xiao-yi1，LI Dong-liang2，ZHAO Hong-gang2，LIU Rui-li1

(1.CollegeofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity;2.DeptofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,XinxiangHenan453003,China)

AimTo investigate the modulation effects of NaHS on arterial vasodilatation functions of renal hypertensive rats.MethodsTwo- kidney, one- c lip ( 2K1C ) renovascular hypertension was induced.Rats were randomly divided into four group：sham group，two-kidney one-clip model(2K1C) group,2KIC+NaSH(H2S donor) group,PPG group. The systolic blood pressure(SBP) was measured before the operation and each week after the operation. The carotid artery was collected for morphometric parameters(outer radius,wall thickness,the radio of wall thickness to outer radius) and the tension of the carotid artery was observed with the isolated artery ring technique. Immunohistochemistry was used to determine the protein expression of eNOS,ET-1 protein in carotid artery.ResultsThe blood pressure of 2K1C group and PPG group was higher than that of sham group(P<0.05).Compared with 2K1C group,the blood pressure and the rat arteria carotis communis of the radio of wall thickness to outer radius of 2K1C+NaHS group decreased significantly，while the relaxation of carotid artery to ACh in NaHS group increased.According to the immunohistochemistry results,eNOS expression was upregulated while ET-1 was downregulated in 2K1C+NaHS group as compared with 2K1C group.ConclusionsChronical administration of NaHS can decrease blood pressure in renovasocular hypertensive rats. The antihypertensive effect of H2S maybe associated with improvement of the arterial functions.

hydrogen sulfide; renovascular hypertension; 2K1C; endothelial dependent; eNOS；ET-1

2016-02-10,

2016-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81271376)

潘國(guó)聘(1981-)，女，碩士，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail：wsxiaopin@aliyun.com；劉瑞麗(1975-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：lrl @xxmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.014

A

1001-1978(2016)07-0956-04

R-332；R322.121；R331.32；R544.140.22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-20 11:49網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.028.html