王詣婧

（福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，福建福州350118）

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脫氮硫桿菌的檢測方法及應(yīng)用研究進(jìn)展

王詣婧

（福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，福建福州350118）

摘要：脫氮硫桿菌作為自養(yǎng)反硝化菌的代表菌種，由于其不同于常規(guī)廢水脫氮的異養(yǎng)反硝化過程可節(jié)省碳源而得到關(guān)注。文章介紹脫氮硫桿菌的反硝化功能基因和主要的硫氧化功能基因，分析自養(yǎng)反硝化菌的群落分布特征，對目前脫氮硫桿菌的檢測方法和應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，討論目前研究中存在的問題及今后的研究趨勢，以期為進(jìn)一步研究自養(yǎng)反硝化菌群落結(jié)構(gòu)提供參考。

關(guān)鍵詞：脫氮硫桿菌；功能基因；自養(yǎng)反硝化菌；檢測

1904年，Beijerinck首先分離得到脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans），脫氮硫桿菌是以硝酸鹽為電子受體，以各種類型的含硫化合物為電子供體（nitrate-reducing，sulfide-oxidising bacteria，NR-SOB）進(jìn)行生長的自養(yǎng)型反硝化菌。研究參與這一過程的微生物對于廢水生物脫氮、去除高濃度S2-廢水及減少碳源投加降低反硝化的運行成本均有重要意義。

本文從脫氮硫桿菌這一典型的自養(yǎng)反硝化微生物入手，主要介紹了其氧化硫還原氮的功能基因及其在廢水處理中的研究進(jìn)程，并和其他NRSOB在環(huán)境樣品中的分布進(jìn)行了比較。以脫氮硫桿菌作為模型菌，收集基礎(chǔ)資料，為自養(yǎng)反硝化微生物進(jìn)行較為深入全面的研究打下基礎(chǔ)。

1　脫氮硫桿菌的基本生理特性及代謝特征

目前證實的硫桿菌屬有8種，分別為脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）、排硫硫桿菌（Thiobacillus thioparus）、那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus naples）、氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans）、新型硫桿菌（Thiobacillus novellas）、中間硫桿菌（Thiobacillus intermedius）、代謝不全硫桿菌（Thiobacillus perometabolis）。在硫桿菌屬中，只有脫氮硫桿菌具有在缺氧條件下反硝化的能力。脫氮硫桿菌屬于革蘭氏陰性變形菌的β亞綱，短桿狀，長0.5×（1.0～3.0）μm，具有單根極生鞭毛，專性自養(yǎng)，兼性厭氧?？稍?10～37℃，pH4.0～9.5的條件下生長，最適生長溫度為28～30℃，最適pH為6.5～7.0。

在硫循環(huán)體系中，好氧條件下，脫氮硫桿菌以氧為電子受體氧化硫化合物（如HS-→S0，S0→S2O32-/SO32-/SO42-，S2O32-→ SO42-，SO32-→SO42-），從中獲得能量［1］。缺氧條件下，脫氮硫桿菌以反硝化的方式同時參與硫、氮循環(huán)，表1列出了脫氮硫桿菌在缺氧條件下氧化各種形態(tài)的硫同時以硝酸鹽作為電子受體獲取能量的反應(yīng)。

表1　不同硫源的反硝化反應(yīng)Tab.1 Denitrification reaction of different surphuric sources

2　脫氮硫桿菌的功能基因

目前，脫氮硫桿菌基因測序工作已經(jīng)完成。脫氮硫桿菌具有完成反硝化全過程的4個關(guān)鍵的還原酶（圖1）:硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，Nar）、亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，Nir）、氧化氮還原酶（nitric oxidereductase，Nor）和氧化亞氮還原酶（nitrous oxide reductase，Nos），相應(yīng)編碼基因分別為 nar、nir、nor、nos。其中，膜結(jié)合硝酸鹽還原酶由nar基因簇 narKK2GHJI（Tbd1401-1406）編碼。自然界中存在兩種亞硝酸鹽還原酶，即由nirK編碼的Cu型亞硝酸鹽還原酶和由nirS編碼的細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶，通常這兩種基因不會同時存在于一個菌株內(nèi)，而nirS基因相對更廣泛地存在于反硝化細(xì)菌菌株中［2］，脫氮硫桿菌即屬于此范疇。編碼一氧化氮還原酶有2個基因簇，RT-qPCR的分析結(jié)果顯示norCB（Tbd0562-Tbd0561）的基因表達(dá)水平比norCB（Tbd0822-Tbd0823）高50倍之多，因此前者在還原NO過程中具有更重要的作用。低表達(dá)基因Tbd0822所合成的酶NorC比高表達(dá)基因Tbd0562所合成的酶的碳末端氨基酸殘基多了120個［3］，這可能是造成兩種基因雖具有相同功能基因簇卻有不同表達(dá)水平的原因。

圖1　脫氮硫桿菌脫氮脫硫相關(guān)功能酶作用機制簡圖Fig.1 Themechanism schematic of the desulfuration and　denitrification　funcitional enzymes　of Thiobacillus denitrificans

一般認(rèn)為，在好氧條件下，氧氣會抑制反硝化還原酶的活性，相對于其他3個反硝化還原酶（Nar，Nir，Nor），Nos對氧氣最為敏感［4］，因此將N2O還原成N2常成為反硝化全過程的限制步驟。在缺氧狀態(tài)下，反硝化還原酶功能基因都呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)。Harry R.Beller等人［5］利用反轉(zhuǎn)錄定量PCR（polymerase chain reaction）證實了脫氮硫桿菌反硝化基因表達(dá)水平的相對上調(diào)強度順序為nar＞nir＞nor＞nos。有趣的是，脫氮硫桿菌的nos基因在反硝化狀態(tài)下上調(diào)水平極不明顯，尤其是nosZ基因在好氧和厭氧狀態(tài)下均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，這與在其他反硝化菌株中觀察到的現(xiàn)象不一致［6-7］。

脫氮硫桿菌中與硫化物氧化有關(guān)的基因多達(dá)50多種，主要有sox基因，dsr基因和依賴AMP將硫化物氧化成硫酸鹽的相關(guān)基因（如APS還原酶、ATP硫酸化酶等）。

自然界中硫氧化細(xì)菌采用2種途徑氧化硫化物:一種是在多酶復(fù)合物參與下，將還原態(tài)硫完全催化氧化成硫酸鹽（Sox途徑）；另一種是在氧化過程中，亞硫酸鹽或單質(zhì)硫作為中間產(chǎn)物，形成顆粒態(tài)的硫單質(zhì)。若硫氧化菌sox基因簇含有sox-CD，則只能利用Sox途徑，不形成單質(zhì)硫［8］，如與脫氮硫桿菌同樣具有脫氮氧化硫功能的脫氮硫微螺菌（Thiomicrospira denitrifican s）［9］即屬于此類硫氧化菌。對于脫氮硫桿菌而言，其基因簇soxXYZAB不含soxCD，因此可以同時利用兩條途徑進(jìn)行硫化物氧化（圖1）。soxB是參與催化硫氧化途徑一系列酶的重要組成，它是氧化硫代硫酸鹽的多酶復(fù)合物，在反應(yīng)中心包含一個非朊基的錳簇和一個二價錳的活性位點，催化與半胱氨酸結(jié)合的硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)化成硫酸鹽并從結(jié)合的蛋白上釋放出來。

3　脫氮硫桿菌的檢測

早期脫氮硫桿菌的檢測方法采用最大可能菌數(shù)計數(shù)法，劉玲花等人［10］測量硫/石灰石濾柱濾料上脫氮硫桿菌的活菌數(shù)為108～109個/mL，異養(yǎng)反硝化菌為脫氮硫桿菌的1/10。但在自然界中可培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的1%，因此該方法具有較大的誤差和局限性。

對16S rRNA基因進(jìn)行特異擴增后對核苷酸序列進(jìn)行測定，并與已知菌種16S rRNA進(jìn)行比較，以此進(jìn)行的微生物鑒定是目前比較準(zhǔn)確的方法之一。趙陽國等人［11］在脫氮硫桿菌16S rRNA基因V3可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)一條27bp的特異序列設(shè)計反向引物Thi-d，以16S rRNA基因通用引物BSR8/20為正向引物進(jìn)行PCR擴增和引物特異性評價，證實該引物的高度專一性。Zhang M等人［12］針對脫氮硫桿菌16s rDNA設(shè)計了有高度特異性的引物T-De-F（AAACGGTACGCGCTAACA）和T-De-R（TTGCTTAATAATCCGCCTG）。Nuria Fernandez等人［13］基于 16s rDNA設(shè)計了寡核苷酸探針TBD1419（ACTTCTGCCAGATTCCAC）用于檢測脫氮硫桿菌，TBD121（CTCGGTACGTTCCGACGC）用于檢測脫氮硫桿菌和排硫桿菌，TMD131（TCCCAGTCTTTGAGGTAC）用于檢測Thiomicrospira denitrificans。

脫氮硫桿菌sox基因簇與其他硫氧化菌的相似性范圍在28%～55%之間。在sox基因簇中，soxB是唯一可以用來比較α、β和γ變形菌綱之間親緣關(guān)系的目的片段［14］。有文獻(xiàn)報道就利用引物對soxB693FK39∶soxB1164B［15］和soxB693F∶soxB1446［16］檢測到脫氮硫桿菌，并繪制出基于硫氧化功能基因構(gòu)建的進(jìn)化樹。

4　脫氮硫桿菌在廢水處理中的應(yīng)用

廢水脫氮的常規(guī)方法是生物硝化處理后再進(jìn)行異養(yǎng)反硝化，在處理過程中常因缺少電子供體而額外投加適量有機物如甲醇維持異養(yǎng)反硝化，而脫氮硫桿菌作為嚴(yán)格自養(yǎng)兼性菌可利用硫化物作為電子供體獲取能量，同時還原硝酸鹽為氮氣實現(xiàn)反硝化。

脫氮硫桿菌存在于土壤、泥土、淡水和海洋沉積物、市政污水、工廠污水處理池和消化池中。從厭氧污泥中篩選出的脫氮硫桿菌具有良好的生長繁殖和反硝化能力。底泥富集的菌株相比湖水、土壤也有較好的反硝化效果［17］。值得一提的是，理化因素如pH、溫度、硝酸鹽濃度、攪拌速度等會影響菌體生長和反硝化效果［18-19］。

目前關(guān)于硫磺/石灰石自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)的研究比較多。Tian C Z等人［20］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫磺和石灰石的體積比為3∶1時，脫氮硫桿菌自養(yǎng)反硝化反應(yīng)體系達(dá)到最佳狀態(tài)。硫化物濃度和S2-/ NO3-是影響脫氮除硫效率的關(guān)鍵因素，控制硫化物濃度小于300mg/L以及S2-/NO3-比值在5/3～5/2范圍內(nèi)，可以達(dá)到較好的脫硫和反硝化效果［21-22］。劉玲花等人利用 SLAD系統(tǒng)去除地下水中硝酸鹽，出水NO3--N含量為0.03 mg/L，去除率達(dá)到98%［10］。Koening利用自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)處理NO3--N濃度高達(dá)400mg/L的垃圾滲濾液，當(dāng)水力停留時間為 5.17 h時氮去除率接近100%［23］。脫氮硫桿菌由于自身基因，可以根據(jù)調(diào)控硫化物與硝酸鹽的比例來決定最終生成硫單質(zhì)或者硫酸鹽。

需要注意的是，接種脫氮硫桿菌的上流式厭氧污泥床（up-flow anaerobic sludge bed，UASB）反應(yīng)器長期運行中發(fā)現(xiàn)顆粒污泥有解體的趨勢［13，24］，因此需進(jìn)一步優(yōu)化運行條件防止污泥上浮，否則將限制脫氮硫桿菌作為工程菌投入實際運行。

5　脫氮硫桿菌反應(yīng)器自養(yǎng)反硝化菌群落結(jié)構(gòu)分析

觀察人為控制的自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器中群落發(fā)展變化也是近年來的研究方向之一。常玉梅等人［25］在對北京污水廠活性污泥強化自養(yǎng)反硝化菌的研究中，以硫磺作為電子供體進(jìn)行馴化培養(yǎng)，觀察污泥中的群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)污泥的增率為0.177 g/（L·d），污泥中細(xì)菌類群主要為β-變形菌綱、δ-變形菌綱、γ-變形菌綱和未分類細(xì)菌，其中β-變形菌綱類細(xì)菌占主導(dǎo)地位。在成熟的反硝化污泥中，Thiobacillus denitrificans所占比例達(dá)48.65%。Nuria Fernandez等人［13］將產(chǎn)甲烷顆粒污泥接種到UASB中觀察化能自養(yǎng)反硝化污泥群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。在成熟的反硝化反應(yīng)器中確認(rèn)α、β、γ-變形菌是優(yōu)勢菌種。脫氮硫桿菌從接種初期占全部染色細(xì)胞的1%增長到35%，從初期沒有分離到克隆子增長到占總克隆子數(shù)的15%，而Thiomicrospira denitrificans在污泥中僅有很小一部分，占染色細(xì)胞的4%。上述研究結(jié)果表明，在利于自養(yǎng)反硝化菌生長的條件下，在系統(tǒng)穩(wěn)定后，脫氮硫桿菌均能成為優(yōu)勢菌種，但同時其數(shù)量僅占細(xì)菌總數(shù)40%左右，這說明脫氮硫桿菌作為工程菌的效率還有提高的空間。

在以硫源為電子供體的自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器中，Thiobacillus denitrificans和Thiomicrospira denitrificans是最常見的NR-SOB，此外NR-SOB還包括 Arcobacter sp.，Thiohalophilus thiocyanoxidans，Sulfuricurvumkujiense，Thiosphaerapantotropha，Sulfurimonas paralvinellae和Thiomicrospirasp. CVO等。Thiomicrospira sp.CVO既能以CO2為碳源、硫化物為電子供體進(jìn)行自養(yǎng)生長，也能以有機碳為碳源和電子供體進(jìn)行異養(yǎng)生長。Thiomicrospira denitrificans和Thiomicrospira sp. CVO同屬于ε變形菌綱，不同之處在于Thiomicrospira denitrificans通過sox途徑將硫化物氧化成硫酸鹽，沒有硫單質(zhì)的生成，而 Thiomicrospira sp. CVO將硫化物氧化成單質(zhì)硫和硫酸鹽取決于硫化物和硝酸鹽的比率［26］。Sulfuricurvum kujiense在厭氧條件下反硝化的反應(yīng)方程是，該菌不能生長在海洋中。Thiohalophilus thiocyanoxidans是從內(nèi)陸鹽湖中分離出來的第一株嗜鹽的自養(yǎng)反硝化菌，但當(dāng)硝酸鹽含量高于4～5mmol/L時其生長也會被抑制。在海洋沉積物樣品中檢測到Thiomicrospira denitrificans 和Thiohalophilus thiocyanoxidans為主要的自養(yǎng)反硝化菌群，沒有檢測到脫氮硫桿菌［27］。雖然脫氮硫桿 菌 固 定CO2的 能 力 是Thiomicrospira denitrificans的兩倍，但在特定環(huán)境中，仍有未知的因素，如底物的親和性、高鹽度的耐受性，影響兩者的競爭生長。也有文獻(xiàn)指出［28］，脫氮硫桿菌對高鹽度環(huán)境的適應(yīng)性不強，如當(dāng)SO42-濃度超過250mmol/L時，由于總離子強度的升高，其生長將受到抑制。在UASB反應(yīng)器中，雖然脫氮硫桿菌與Thiomicrospira denitrificans競爭相同的底物和電子受體，但是前者數(shù)量超出后者許多［24］。可能的原因在于Thiomicrospira denitrificans是海洋細(xì)菌，在反應(yīng)器鹽度較低的環(huán)境中，由于其碳同化效率僅為脫氮硫桿菌的一半而處于競爭中的弱勢。因此，在一般自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器中，脫氮硫桿菌為優(yōu)勢菌種，幾乎不存在Thiomicrospira denitrificans，而在海洋沉積物等高鹽濃度的環(huán)境中，有Thiomicrospira denitrificans而不能檢測到脫氮硫桿菌。

6　存在的問題

基于16S rRNA繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以比較親緣相近的菌種［29］，但不能鑒定環(huán)境中具有某一特定生理特性的一類微生物，因此利用16S rRNA測序的方法研究自養(yǎng)反硝化菌存在困難。反硝化菌不能按傳統(tǒng)的分類學(xué)方法被劃分為某些特定種群，即脫氮顯型不能從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行推斷。如Thiobacillus denitrificans和Thiobacillus thioparus同屬于硫桿菌屬，Thiobacillus thioparus的16S rRNA 與Thiobacillus denitrificans有高達(dá) 98%的相似度［30］，二者都能利用無機硫化合物進(jìn)行化能自養(yǎng)生長，但 Thiobacillus thioparus沒有反硝化功能。與相對保守的16S rRNA相比，功能基因的序列變化豐富，可以利用功能基因鑒定生態(tài)功能相同但親緣較遠(yuǎn)的微生物種群，如反硝化菌［31］。目前，根據(jù)4種反硝化功能基因設(shè)計引物調(diào)查種群多樣性的工作已展開。以nirS基因為例，Gesche Braker等人［32］根據(jù)nirS基因6個相對保守的區(qū)域設(shè)計的引物對nirS1F-nirS6R已成功應(yīng)用于多種環(huán)境樣品［33］。Throb?ck等人［34］評價了多對nirS基因引物后指出應(yīng)用cd3aF∶R3cd能鑒定出更多種類的反硝化菌。然而，在各種環(huán)境樣品反硝化菌種群多樣性的分析中均沒有看到利用功能基因檢測到脫氮硫桿菌的報道，可能的原因是脫氮硫桿菌的反硝化功能基因同其他反硝化菌的相似性低，一般功能基因的通用引物難以有效地識別脫氮硫桿菌的目的片段。同樣地，鑒定自養(yǎng)反硝化菌群群落結(jié)構(gòu)的瓶頸也在于尋找該類菌種的通用引物。黎乾等人［35］以功能基因nirS為分子標(biāo)記考察了4次回灌過程中反應(yīng)器內(nèi)反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，4次回灌反應(yīng)器內(nèi)的反硝化微生物大部分與β-變形菌綱細(xì)菌相似，少數(shù)屬于非培養(yǎng)微生物（uncultured bacteria），其中，脫氮硫桿菌和甲基苯反硝化降解菌（Azoarcustolulyticus）是反硝化過程的主要功能微生物。通過標(biāo)記功能基因反映NR-SOB的多樣性和數(shù)量，這對于實際廢水處理的工程應(yīng)用具有重要意義。這類功能菌基因保守區(qū)域相似性比較有待進(jìn)一步研究，以期開發(fā)出能識別脫氮氧化硫這一特殊微生物類群的引物或探針。

7　結(jié)語

從部分反應(yīng)器運行數(shù)據(jù)看來，脫氮硫桿菌雖然為優(yōu)勢菌種，但這種桿菌占全部活菌數(shù)的比重還有較大的提高空間。對工程應(yīng)用而言，通過分離出活性更高、脫氮穩(wěn)定性更好的高效工程菌株，優(yōu)化反應(yīng)器參數(shù)條件等手段提高反硝化率是下一步工作的重點。對于自養(yǎng)反硝化菌分子生態(tài)學(xué)分析而言，基于16S rRNA技術(shù)定性定量分析自養(yǎng)反硝化菌群落結(jié)構(gòu)和分布特征的工作已經(jīng)展開。功能基因數(shù)據(jù)庫的建設(shè)是反硝化群落分子生態(tài)學(xué)研究最基礎(chǔ)的需要，今后的研究可以利用脫氮硫桿菌作為模型菌，進(jìn)一步研究基于NR-SOB功能基因的自養(yǎng)型反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)演替，對豐富自養(yǎng)型反硝化菌群落生態(tài)認(rèn)識有積極的意義，同時也為該功能菌的工程化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：肖錫湘）

中圖分類號：X703

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-4348（2016）03-0249-06

doi：10.3969/j.issn.1672-4348.2016.03.009

收稿日期:2016-05-30

作者簡介:王詣婧（1987-），女，福建福州人，助教，碩士，研究方向:廢水處理。

Progress of detection m ethods and applications of Thiobacillus denitrificans

Wang Yijing
（College of Eco-Environmentand Urban Construction，F(xiàn)uzhou 350118，China）

Abstract:Thibacillusdenitrificans，a representative autotrophic denitrifying bacteria which is different from heterotrophic denitrifiers，has drawn increasing attention.The denitrifying functional genes and key genes putatively associated with sulfur-compound oxidation in T.denitrificans were described.The character of the colony distribution（community structure）of NR-SOBwas analysed. The detectionmeasures and the application state of T.denitrificans in wastewater field were reviewed. Issues to be resolved in the present research were discussed along with the prospects（trend）of the future study.

Keywords:Thiobacillus denitrificans；functional gene；autotrophic denitrifiers；detection