劉衛(wèi)國,丁俊祥, 鄒　杰, 林　喆，唐立松

1 新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 綠洲生態(tài)重點實驗室, 烏魯木齊　830046 2 中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所, 荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室, 烏魯木齊　830011 3 中國科學(xué)院大學(xué), 北京　100049 4 中國科學(xué)院阜康荒漠生態(tài)系統(tǒng)研究站, 阜康　831505

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NaCl對齒肋赤蘚葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

劉衛(wèi)國1,*,丁俊祥1,2,3,4, 鄒杰1, 林喆1，唐立松2,4

1 新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 綠洲生態(tài)重點實驗室, 烏魯木齊830046 2 中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所, 荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室, 烏魯木齊830011 3 中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049 4 中國科學(xué)院阜康荒漠生態(tài)系統(tǒng)研究站, 阜康831505

摘要:齒肋赤蘚(Syntrichia caninervis)是古爾班通古特沙漠苔蘚結(jié)皮層中的優(yōu)勢物種，對荒漠生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及功能多樣性具有十分重要的意義。利用透射電鏡技術(shù)對不同濃度NaCl脅迫下齒肋赤蘚葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)進行了觀察。結(jié)果表明：齒肋赤蘚葉肉細胞在未脅迫(0 mmol/L)處理下排列疏松，各種細胞結(jié)構(gòu)完整，葉綠體基質(zhì)排列均勻且葉綠體內(nèi)含少量淀粉粒和脂質(zhì)球。在輕度鹽NaCl脅迫(100 mmol/L)下，齒肋赤蘚葉肉細胞結(jié)構(gòu)依然保持完整，葉綠體基質(zhì)均勻，葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)僅有較小變化。在中度鹽NaCl脅迫(200、300 mmol/L)下，齒肋赤蘚葉肉細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，出現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)，且中央大液泡發(fā)生破裂；葉綠體由梭形變成橢球形或圓球狀，出現(xiàn)空泡化并伴隨有輕微的解體；葉綠體類囊體腫脹，脂質(zhì)球數(shù)量增加。在高度NaCl脅迫(400、500 mmol/L)下，齒肋赤蘚細胞的質(zhì)壁分離加劇，葉肉細胞出現(xiàn)大量泡狀結(jié)構(gòu)和膜片層，葉肉細胞死亡；葉綠體片層結(jié)構(gòu)消失，空泡化加重，脂質(zhì)球數(shù)量增加且體積變大，葉綠體內(nèi)外膜消失，葉綠體大部分解體，在葉肉細胞中幾乎看不到葉綠體的存在。上述結(jié)果表明，葉綠體膜結(jié)構(gòu)的損傷與鹽脅迫下葉肉細胞死亡有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：齒肋赤蘚；NaCl脅迫；葉肉細胞；超微結(jié)構(gòu)

生物結(jié)皮是由隱花植物如藍藻、荒漠藻、地衣、苔蘚類和土壤微生物與表層土壤顆粒膠結(jié)而形成的十分復(fù)雜的復(fù)合體，是干旱、半干旱地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。在維管束植物分布稀疏的干旱區(qū)，生物結(jié)皮是地表主要的生物覆蓋層，在土壤穩(wěn)定性、固氮、土壤肥力以及水分循環(huán)等方面起著重要作用[1]。在干旱區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中，鹽分同水分一樣對生物的生長、發(fā)育、分布以及生理生態(tài)過程等都具有重要的影響[2]。生物結(jié)皮對鹽分具有一定的忍耐特性。耐鹽性是一種綜合性狀表現(xiàn)，不同種類生物結(jié)皮由于耐鹽方式和機理的不同，其組織或細胞內(nèi)的生理生化變化也不同[2- 3]。

苔蘚植物具有很強的耐旱能力，因此以往的研究多集中于探討其耐旱特性和機理，如苔蘚植物在抗旱過程中的形態(tài)變異[4- 5]、生理生化機制[6- 7]、繁殖方式[8- 9]等。在荒漠地表，高蒸發(fā)量和有限的降水是造成苔蘚生物結(jié)皮遭受鹽脅迫的重要原因，研究區(qū)地表土壤的高鹽度是影響該苔蘚生存的重要環(huán)境因子之一。同水分脅迫一樣，鹽脅迫也是干旱區(qū)植物經(jīng)常遭受的脅迫形式。有關(guān)植物細胞超微結(jié)構(gòu)響應(yīng)和適應(yīng)鹽脅迫的研究已有很多，如韋存虛、徐威等[10,11]研究了NaCl脅迫對白三葉葉片超微結(jié)構(gòu)的影響，Shu等[12]觀察了鹽脅迫對黃瓜的超微結(jié)構(gòu)的影響，Elkahoui等[13]分析了長春花細胞在生理和超微結(jié)構(gòu)方面對鹽脅迫的響應(yīng)，Queirós、Gao等[14- 15]研究了NaCl對馬鈴薯的超微結(jié)構(gòu)及生理特性的影響。然而，目前從細胞超微結(jié)構(gòu)探討鹽分脅迫對苔蘚生物結(jié)皮影響的研究仍不多見。

細胞超微結(jié)構(gòu)(細胞器)是植物一系列生理活動異常的細胞學(xué)基礎(chǔ)。有研究表明，經(jīng)一段時間鹽處理后，植物葉肉細胞內(nèi)出現(xiàn)空腔、淀粉粒，類囊體與葉綠體膜扭曲[11]，葉綠體變形或外膜逐漸斷裂解體、核膜模糊，線粒體損傷，內(nèi)外膜界限不清[13-20]，表皮和皮層細胞中液泡數(shù)量增加等一系列不同程度的歧變[11,20]。那么，在不同濃度鹽脅迫下苔蘚生物結(jié)皮葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)將會發(fā)生什么樣的變化？為此，本研究選取蘚類結(jié)皮層中的優(yōu)勢物種——齒肋赤蘚(Syntrichiacaninervis)為實驗材料。通過電鏡照射成像，從亞細胞水平觀察齒肋赤蘚在不同NaCl濃度(0、100、200、300、400、500 mmol/L)處理下細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，以期探究齒肋赤蘚生物結(jié)皮葉肉細胞可能的鹽分積累位點，從而為苔蘚生物結(jié)皮在鹽分脅迫下出現(xiàn)的生理變化和耐鹽性提供初步的實驗依據(jù), 也為今后對該苔蘚生物結(jié)皮進行更多的應(yīng)用研究和開發(fā)提供一些基礎(chǔ)性的資料。

1材料與方法

1.1供試材料

2014年 5月于古爾班通古特沙漠南緣腹地，選取未受任何干擾、生長良好且長勢一致的齒肋赤蘚生物結(jié)皮作為實驗對象。采用水濕法取回后立即進行消毒處理，然后置于培養(yǎng)箱(溫度為(20±0.5) ℃)培養(yǎng)1周。從中挑選高約0.6—0.8 cm的齒肋赤蘚生物結(jié)皮，使之以單株形式存在。每25株整合為1個樣本置于培養(yǎng)皿，根據(jù)當(dāng)?shù)佚X肋赤蘚生物結(jié)皮生長特性，選用濃度為0、100、200、300、400、500 mmol/L NaCl溶液進行處理，每組處理5次重復(fù)。每次定時處理前，先將樣本移入已消毒的新培養(yǎng)皿中，然后進行鹽溶液處理。同時，仔細觀察樣本的長勢及變化情況，待培養(yǎng)至第7天時，在每個鹽分處理下選取3—5株長勢一致樣本用于電鏡樣品的制備。

1.2樣品制備與觀察

將齒肋赤蘚生物結(jié)皮植株下半部切除，保留頂部1—2 mm2立刻投入4%戊二醛溶液中固定，隨后用磷酸緩沖液(pH為7.2的PBS)洗滌，再以1%的鋨酸固定1.5h，分別用濃度梯度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇逐級脫水。隨后，用比值為1∶1和4∶1的丙酮和酒精依次浸泡半個小時，純丙酮浸泡過渡，并用比值為1∶1的環(huán)氧樹脂和丙酮浸泡1h，比值為4∶1的環(huán)氧樹脂與丙酮浸泡3h，純環(huán)氧樹脂浸泡12h后用Epon- 812滲透包埋。在恒溫恒濕箱中按等梯度溫度加溫至60 ℃，然后放置12個h。借助LKB型超薄切片機切片，切片經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，隨后采用EM- 1200EX透射電子顯微鏡觀察照相。

2實驗結(jié)果

2.1齒肋赤蘚超微結(jié)構(gòu)變化

2.1.1齒肋赤蘚葉肉細胞壁變化

齒肋赤蘚生物結(jié)皮的葉肉細胞壁在小于100 mmol/L NaCl脅迫下結(jié)構(gòu)完整飽滿，相鄰細胞壁間界限分明，細胞壁與原生質(zhì)清晰可見。在100 mmol/L NaCl脅迫下，細胞壁出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖1-A)。在200 mmol/L NaCl脅迫下，細胞壁結(jié)構(gòu)完整，表面現(xiàn)凹凸不平現(xiàn)象；由于細胞外Na+含量增多，細胞失水，而出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，但細胞壁間界限仍較分明，細胞壁與原生質(zhì)體間界限依舊清晰可見。細胞壁完整，細胞膜清晰可見，箭頭所指方向為發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象(圖1-B)；出現(xiàn)明顯質(zhì)壁分離現(xiàn)象，如箭頭所指方向(圖2-S)。在300 mmol/L NaCl脅迫下，細胞壁結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)側(cè)出現(xiàn)輕微模糊現(xiàn)象，質(zhì)壁分離現(xiàn)象已加劇，細胞壁間界限出現(xiàn)模糊，細胞壁與原生質(zhì)體的界限同樣清晰可見(圖1-C, 圖2-T)。在400 mmol/LNaCl脅迫下，細胞壁結(jié)構(gòu)仍完整，內(nèi)側(cè)模糊現(xiàn)象稍有加重，質(zhì)壁分離現(xiàn)象進一步加劇，相鄰細胞壁間界限模糊不分明，但細胞壁與原生質(zhì)體間界限仍清晰可辨(圖1-D, 圖2-W)。當(dāng)濃度為500 mmol/L NaCl脅迫時，細胞壁結(jié)構(gòu)仍完整，在與0—100 mmol/L NaCl濃度時相比，細胞壁輪廓已不飽滿，內(nèi)側(cè)模糊，細胞壁間的界限不清晰。這都表征，齒肋赤蘚生物結(jié)皮在高濃度鹽脅迫下出現(xiàn)嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細胞質(zhì)遭到嚴重損害，細胞壁與原生質(zhì)體間的界限部分模糊不清(圖1-E,圖2-Y)。

2.1.2齒肋赤蘚葉肉細胞葉綠體變化

在0—100 mmol/L NaCl處理下，齒肋赤蘚葉肉細胞的葉綠體呈梭型，結(jié)構(gòu)規(guī)則完整，輪廓清晰，具雙層被膜，分布在細胞邊緣；類囊體腔小且扁平，基粒間有基質(zhì)片層相連，基粒片層與基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)完整、層次清晰、排列緊密、排列方向與葉綠體長軸基本平行，基質(zhì)均勻，發(fā)育良好，并在葉綠體中發(fā)現(xiàn)淀粉粒，細胞質(zhì)和葉綠體中發(fā)現(xiàn)少量的圓形顆粒物(圖3-F, G)。當(dāng)脅迫濃度為200 mmol/L NaCl時，葉綠體雙層膜開始有輕微的損壞，葉綠體中的基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)模糊、松散、排列紊亂；同時，基粒片層和基質(zhì)片層減少，且表現(xiàn)一定的扭曲，基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)也開始模糊，開始出現(xiàn)類囊體空泡化，葉綠體內(nèi)已有較多的圓形顆粒物(圖3-H)。濃度增加到300 mmol/L NaCl時，部分葉綠體雙層膜有被破壞現(xiàn)象，且基粒片層和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)模糊不清，只見一些松散的基粒片層結(jié)構(gòu)，葉綠體開始膨脹，內(nèi)部出現(xiàn)空洞，空泡化程度達到20%—30%，葉綠體向細胞質(zhì)中間分布，其內(nèi)部積累較多的圓形顆粒 (圖3-I, J)。當(dāng)濃度達到400 mmol/L NaCl時，葉綠體被膜破壞嚴重，并出現(xiàn)斷裂和解體，片層有一定扭曲，基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)開始模糊，排列紊亂，葉綠體膨脹嚴重，空泡化程度高達40%—60%，積累了大量的圓形顆粒(圖3-K, L)。在500 mmol/L NaCl脅迫下，葉綠體膜完全破裂，葉綠體內(nèi)含物質(zhì)外溢，類囊體、基粒和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)完全消失，大量的圓形顆粒出現(xiàn)(圖3-M)。

圖3　不同鹽濃度下苔蘚葉肉細胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3　The ultrastructural changes of chloroplast in Moss biologic crust under different concentrations of NaCl

2.1.3齒肋赤蘚葉肉細胞核的變化

在0—100 mmol/L NaCl處理下，齒肋赤蘚葉肉細胞核為圓形，核膜清晰可見，核仁位于細胞核中央(圖2-N, Q)。伴隨濃度增加為200 mmol/L NaCl時，細胞核膜開始蜷曲變形、凹凸不平、呈橢圓形、核仁已遭到破壞，并向細胞外側(cè)移動，出現(xiàn)染色質(zhì)外溢、核質(zhì)減少等現(xiàn)象(圖2-R)。在300 mmol/L NaCl脅迫下，細胞核膜邊緣模糊，核仁移至細胞核邊緣，核仁模糊甚至消失，核質(zhì)嚴重外溢(圖2-T)，且細胞質(zhì)中有圓形顆粒沉淀(圖2-U)；當(dāng)濃度增加到 400 mmol/LNaCl時，出現(xiàn)嚴重質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2-W)；此時，部分細胞膜出現(xiàn)解體，如箭頭所指(圖2-X)；在 500 mmol/LNaCl濃度時，齒肋赤蘚葉肉細胞核已經(jīng)萎縮、破裂解體(圖2-Y)?？傮w，隨著NaCl濃度的增加，細胞核由清晰可見的橢圓形逐漸變化為核膜邊緣模糊，核仁移至細胞核邊緣，核仁模糊甚至消失，核質(zhì)嚴重外溢，最終細胞核破裂解體。

3討論與結(jié)論

在低鹽處理(小于100 mmol/L NaCl)下，齒肋赤蘚葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)基本不受影響，這表明齒肋赤蘚具有一定的耐鹽性，能夠在一定程度鹽漬化土壤環(huán)境中生長。在中(200—300 mmol/L NaCl)、高(400—500 mmol/L NaCl)濃度的鹽脅迫下，齒肋赤蘚葉肉細胞均受到不同程度的脅迫傷害，尤以葉綠體和細胞核的表現(xiàn)最為突出。葉肉細胞中的葉綠體是感受鹽脅迫最敏感細胞器。本研究中，在輕度鹽分脅迫下，齒肋赤蘚葉綠體能夠維持其結(jié)構(gòu)和膜的完整性；而隨著鹽分濃度增加，葉綠體開始出現(xiàn)不同程度的破壞，如葉綠體發(fā)生形變、膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂和解體、類囊體與基粒和基質(zhì)片層發(fā)生變形等。這些結(jié)構(gòu)的變化是細胞衰老、病變或嚴重脅迫情況下表現(xiàn)的普遍現(xiàn)象[21- 24]。此外，隨著NaCl濃度的增加，齒肋赤蘚葉綠體內(nèi)出現(xiàn)大量的脂質(zhì)球。脂質(zhì)球的增加利于提高細胞質(zhì)濃度、降低滲透勢，確保水分和無機鹽類營養(yǎng)的吸收，故脂質(zhì)球的增多現(xiàn)象是齒肋赤蘚耐鹽性增強的標(biāo)志之一，這在其它植物耐鹽特性的研究中也得到了證實[25- 28]。據(jù)此本研究推測，齒肋赤蘚生物結(jié)皮通過在細胞體內(nèi)積累大量脂質(zhì)球等能量物質(zhì)來抵制脅迫傷害，而在環(huán)境適宜的條件下，齒肋赤蘚又能將這些能量物質(zhì)重新加以利用。這也許是苔蘚、藻類和地衣生物結(jié)皮應(yīng)對環(huán)境脅迫的重要保護機制之一。另外，當(dāng)葉綠體內(nèi)、外膜被破壞，其功能將完全尚失，而在內(nèi)、外膜保持完整時，鹽脅迫解除后，葉綠體仍能恢復(fù)其光合作用。葉綠體的完整與否決定了光合作用的進行，因此，保持其結(jié)構(gòu)的完整性在植物生長中是必要的[16-18, 29]。本實驗中，齒肋赤蘚葉綠體膜在低于200 mmol/L NaCl濃度下有輕微的損壞，在更高濃度NaCl處理下葉綠體內(nèi)、外膜才出現(xiàn)降解消失，這體現(xiàn)了齒肋赤蘚在結(jié)構(gòu)和功能特性方面對鹽漬生境的適應(yīng)。

本研究中，齒肋赤蘚葉肉細胞在高濃度NaCl處理(300—500 mmol/L)下出現(xiàn)嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖1-E，圖2-Y)。在大于300 mmol/L NaCl處理下，細胞質(zhì)遭到嚴重損害，細胞壁與原生質(zhì)體的界限部分模糊不清；細胞核由清晰可見的橢圓形逐漸變化為核膜邊緣模糊，并逐漸萎縮、破裂解體；核仁移至細胞核邊緣，逐漸模糊甚至消失，核質(zhì)嚴重外溢，出現(xiàn)細胞核破裂解體現(xiàn)象。這些變化將造成細胞膜系統(tǒng)不可逆的損傷，致使細胞正常的物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞無法順利完成，導(dǎo)致細胞新陳代謝過程中斷，使齒肋赤蘚葉肉細胞生命活動趨于停止。因此，本研究認為可以通過觀測鹽脅迫條件下植物細胞的超微結(jié)構(gòu)來篩選本土耐鹽性苔蘚類生物結(jié)皮。

葉肉細胞器對鹽脅迫的敏感性和耐受性存在明顯差異。本研究中，葉綠體對鹽分脅迫最為敏感，其次是液泡和細胞核，細胞壁和內(nèi)膜系統(tǒng)則對鹽脅迫表現(xiàn)不敏感，對鹽脅迫的耐受能力相對較強。較厚的細胞壁作為屏障，可限制Na和Cl進入原生質(zhì)體中，從而保護細胞免遭金屬離子的毒性[30- 33]。在低濃度NaCl(小于200 mmol/L)處理下，齒勒赤蘚的葉肉細胞結(jié)構(gòu)仍保持完整性。這表明特定的細胞結(jié)構(gòu)支持是保證齒肋赤蘚生物結(jié)皮穩(wěn)定生長在高溫、干旱、強輻射和鹽堿性生境中的前提。另外，齒肋赤蘚生物結(jié)皮能夠適應(yīng)小于200 mmol/L NaCl的鹽分環(huán)境，而當(dāng)NaCl濃度超過200 mmol/L時，齒肋赤蘚葉肉細胞的細胞核和葉綠體表現(xiàn)出明顯的毒害特征；同時，葉肉細胞的膜系統(tǒng)也會受到一定程度的傷害，當(dāng)NaCl高于400 mmol/L時，葉肉細胞會因無法恢復(fù)活性而降解消失，使齒肋赤蘚葉肉細胞失活，最終可能導(dǎo)致苔蘚生物結(jié)皮死亡。在今后研究中，應(yīng)以細胞超微觀結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)，深入探究其它類生物結(jié)皮可適應(yīng)的臨界鹽度及相應(yīng)的生理生化調(diào)節(jié)機制。

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基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(31260112)

收稿日期:2014- 10- 12; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 10- 10

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: wgliuxj@126.com

DOI:10.5846/stxb201410122011

Ultrastructural responses ofSyntrichiacaninervisto a gradient of NaCl stress

LIU Weiguo1,*, DING Junxiang1,2,3,4, ZOU Jie1, LIN Zhe1, TANG Lisong2,4

1KeyLaboratoryofOasisEcology,CollegeofResourcesandEnvironmentScience,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China2StateKeyLaboratoryofDesertandOasisEcology,XinjiangInstituteofEcologyandGeography,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China4FukangStationofDesertEcology,ChineseAcademyofSciences,Fukang831505,China

Abstract：Salinity is a major abiotic stress in arid and semiarid areas that has major effects on plant growth, thereby significantly reducing productivity. Biological soil crusts stabilize soil surfaces and aid in the establishment of vascular plants. These crusts have evolved salt resistance mechanisms and unique structures for survival under salinity stress and thus are an integral part of the soil system in arid regions worldwide. However, the effects of salinity on the ultrastructure of biological crusts have not been well investigated. Syntrichia caninervis Mitt is the dominant species in moss crusts of the Gurbantunggut Desert of northwestern China. In this study, S. caninervis was cultured in a concentration gradient of NaCl solution (0, 100, 200, 300, 400, 500 mmol/L) for 7 days. Using transmission electron microscopy, we observed changes in S. caninervis leaf cellular ultrastructure in response to salt stress. Comparisons of changes in cell wells, chloroplasts, and nuclei under the NaCl concentrations showed that under normal conditions (0 mmol/L NaCl), mesophyll cells were arranged loosely, organelles were morphologically integrated, and starch grains and electron-dense globules (plastoglobuli) were present in chloroplasts. No changes in ultrastructure were observed under mild NaCl stress (0—100 mmol/L); the cell structure was intact, and there were no changes in the structure of stroma or mitochondria. Under moderate NaCl stress (200—300 mmol/L), large changes in S. caninervis mesophyll cell structure were found, including swelling of the chloroplast thylakoid membranes, disorganization of grana, and plasmolysis. In addition, there was a marked increase in the number of plastoglobuli, the large central vacuole was ruptured, and chloroplasts showed disintegration. Overall, the ultrastructures of cell nuclei and vacuoles were slightly degraded. Under severe NaCl stress (400—500 mmol/L), the chloroplast membranes and lamellar structures were disorganized and contained a mass of plastoglobuli, and mesophyll cells were degraded and contained many vesicular multicycle-like membrane structures. Cells of the crust moss appeared to have serious plasmolysis as evidenced by the complete collapse of chloroplasts. These results indicate that injury to the membrane structure of various organelles, especially chloroplasts, is associated with the eventual death of mesophyll cells. Therefore, a better understanding of salinity-induced structural variability in Syntrichia caninervis should facilitate the identification of salt-tolerance mechanisms.

Key Words:Syntrichia caninervis; NaCL stress; mesophyll cells; ultrastructure

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