河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000) 張玉虹　康燕華　孫喜斌

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KLF4在宮頸癌生長及轉(zhuǎn)移表達的研究*

河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000) 張玉虹康燕華孫喜斌

摘要目的：探討Kruppel樣因子(KLF4)在宮頸癌生長情況及對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移表達能力的影響。方法：收集宮頸癌手術患者癌和癌旁組織樣本，采用免疫印跡實驗(Western blot)、免疫組織化學、定量PCR法對宮頸癌組織、正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織樣本中KLF4表達進行檢查，并分析表達結果與病理特征的關系。結果：不同組織中KLF4陽性細胞率具有統(tǒng)計學差異，其中正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細胞率均為100%，宮頸癌組織中陽性細胞率為58.8%。與正常宮頸組織相比，宮頸癌以及宮頸原位癌組織強陽性細胞率明顯偏低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。宮頸癌組織中KLF4的mRNA以及蛋白的表達明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。KLF4隨著分化程度的下降，蛋白表達陽性率也隨之降低；而隨著臨床上分期的升高蛋白表達陽性率降低，但其間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：KLF4因子可能為一種抑癌因子，抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，有望成為宮頸癌未來診斷以及治療的潛在靶標。

主題詞宮頸腫瘤@Kruppel樣因子腫瘤轉(zhuǎn)移

宮頸癌為目前世界上女性惡性腫瘤之一，病死率在全球占68%～75%，位居女性惡性腫瘤病死率首位[1]。該類癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程極為復雜，涉及多種抑癌基因以及原癌基因的抑制與激活情況。Kruppel樣因子4(KLF4)為近期發(fā)現(xiàn)的一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，主要參與細胞分化、細胞凋亡以及具有調(diào)節(jié)細胞周期等功能[2]。目前臨床上對于KLF4與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的關系尚未明確。有學者認為KLF4參與腫瘤遷徙，造成細胞增生以及發(fā)育異常，影響腫瘤的預后；但也有報道限制KLF4在癌細胞中有抑制癌癥擴散的功能[3]。本研究檢測了不同宮頸癌組織中KLF4的表達，并對KLF4對宮頸癌的生長以及轉(zhuǎn)移的影響進行探討，報道如下。

資料與方法

1一般資料收集2013年 11月至2015年 11月我院宮頸癌組織、正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織樣本分別為34例、30例以及26例。所有組織均經(jīng)病理切片證實，其中34例宮頸癌組織均為鱗癌患者組織，患者年齡范圍為 29～66歲，平均年齡41.6±4.6歲。按照分化程度分類，39例宮頸癌患者中有9 例高分化、15 例中分化以及10 例低分化。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟的臨床分期標準，39例宮頸癌患者中21 例I 期，7 例II期，5 例III期，1 例IV期。

2方法

2.1儀器與試劑：儀器：37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海天呈科技有限公司)；酶標儀(BMG， LABTECH POLARstar Omega)；自動生化分析儀 LX-21(美國 BECKMAN 公司)；臺式高速度冷凍離心機(德國 ELRCRON 公司)；LightCycler?96 全自動熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche公司, 96 通量)。

試劑：SP 染色試劑盒(上?；鶢栴D生物科技有限公司)；兔抗人 KLF4 多克隆抗體(美國 DSL公司)。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑(南京化學試劑有限公司)；多聚賴氨酸(Sigma公司)。

2.2免疫組織化學:采用福爾馬林固定、石蠟包埋的方法將收集的癌及癌旁組織制備成石蠟切片，按照標準操作流程[4]，先將切片脫蠟水化。采用檸檬酸鈉(pH=6)溶液修復2min，雙氧水30ml/L常溫封閉10min，以破壞過氧化物酶的活性。采用PBS緩沖液洗滌三次后加入胚胎牛血清50mL/L封閉20min，隨后依次采用兔抗人KLF4多克隆抗體、羊抗兔IgG在 37℃條件下分別孵育2h及30min，每次孵育后采用PBS緩沖溶液沖洗3次。最后采用辣根過氧化酶標記生物素染色，二氨基聯(lián)苯胺液顯色，蘇木精復染后，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察各組織染色情況。根據(jù)最終細胞的染色強度以及顯色比例對KLF4進行半定量分析。按照陽性細胞率以及顯色程度值進行評價：陽性細胞數(shù)目>80%為4分，51%～80%為3分,11%～50%為2分；染色強為3分，染色中等為2分，染色弱為1分。當陽性細胞率低于10%時，無論染色強度高低均認為是陰性，用(-)表示；當評分值在3～5分時，為弱陽性，用(+)表示；當評分在6～7分時，為強陽性，用(++)表示。

2.3實時熒光定量PCR檢測KLF4的mRNA的表達:使用Trizol試劑(Invitrogen公司生產(chǎn))從宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中提取總RNA，隨后將提取的RNA在20μL反應體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler?96 全自動熒光定量PCR系統(tǒng)對各樣本進行分析，每個樣本重復測定3次，測定具體條件為：94℃條件下反應15min，60℃一集72℃各反應30s，最終經(jīng)歷40個循環(huán)。測定循環(huán)閾值由儀器的熒光預設點為限。

2.4Western blot檢測KLF4蛋白的表達情況:將收集的宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中的組織蛋白采用蛋白裂解液法進行提取，并通過Western blot法檢測其中的KLF4的表達情況。

3統(tǒng)計學方法應用 SPSS19. 0 統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1免疫組織化學檢測KLF4在宮頸癌中的表達情況由于檢測的KLF4存在于細胞核內(nèi)，因此本次研究中所顯示的檢測結果中組織細胞的細胞核為棕黃色，且分布模式多為彌漫性分布，少見點狀或灶狀分布。在正常宮頸組織以及原位癌組織中可見陰性細胞，且染色強度由下到上呈現(xiàn)增強趨勢。對比不同組織中KLF4陽性細胞率發(fā)現(xiàn)，正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細胞率均為100%，宮頸癌組織中陽性細胞率為58.8%，與正常宮頸組相比，陽性率顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0 .05)。與正常宮頸組織相比，宮頸原位癌組織中呈現(xiàn)強陽性的數(shù)目明顯偏低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0 .05)。具體結果見表1。

表1　免疫組織化學檢測KLF4在宮頸癌中的表達情況

注：與正常組織相比，*P<0 .05

2KLF4的mRNA及蛋白在宮頸癌以及宮頸原位癌組織中的表達采用實時熒光定量PCR對宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中KLF4的mRNA表達情況進行檢測，結果顯示宮頸癌組織中KLF4的mRNA表達明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用Western blot檢測宮頸癌組織以及宮頸原位癌組織中KLF4蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中KLF4蛋白的表達明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3宮頸癌組織中 K LF4 蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)的關系KLF4 在不同臨床病理分級組織中表達不同，隨著分化程度的下降，蛋白表達陽性率也隨之降低；此外，該蛋白表達陽性率隨著臨床上分期的升高而降低，但其間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體結果見表2。

表2　宮頸癌組織中KLF4 蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

討論

KLF4基因據(jù)報道定位于染色體9q31上，是一種近期新發(fā)現(xiàn)的KLF家族轉(zhuǎn)錄因子，主要由470個氨基酸構成的蛋白質(zhì)編碼形成。KLF4主要分布于人體皮膚、胃腸道、血管內(nèi)皮細胞等處，參與多種細胞生命活動，包括細胞分化、細胞周期、細胞凋亡等。目前KLF4與癌癥的關系尚未有明確解釋。有報道顯示， KLF4 通過下調(diào)細胞增生分化過程中基因表達、參與調(diào)節(jié)細胞周期以及細胞凋亡而發(fā)揮著抑制癌細胞擴散與增長的作用[5]。

本研究采用免疫組織化學法、定量PCR法以及Western blot法對不同宮頸組織中KLF4的表達進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中陽性細胞率為58.8%，明顯低于正常宮頸組織以及宮頸原位癌組織中陽性細胞率(100%)，且差異具有統(tǒng)計學意義。而KLF4在宮頸癌組織中的mRNA以及蛋白的表達也明顯低于宮頸原位癌組織，且差異具有統(tǒng)計學意義。說明KLF4基因表達的下調(diào)可能伴隨著腫瘤的生長。有報道顯示，將MCF-1OA細胞中的KLF4基因進行敲除后，乳腺永生化細胞株的上皮細胞形態(tài)有所改變，且細胞的遷移能力有所增加[6]；而過表達KLF4因子后，MDA-MB-231細胞中與細胞遷移以及細胞侵襲功能有關的E-cadherin因子表達上調(diào)，細胞的遷移以及侵襲能力顯著下降。還有報道顯示， KLF4 的表達能夠抑制細胞生長以及細胞 DNA的合成，證實了KLF4 可能為一種抑癌基因[7]。

研究中還發(fā)現(xiàn)KLF4 在不同臨床病理分級組織中表達不同，隨著分化程度的下降，蛋白表達陽性率也隨之降低；此外，該蛋白表達陽性率隨著臨床上分期的升高而降低，但其間差異不具有統(tǒng)計學意義。說明KLF4可能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移，當KLF4水平較低時，宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移能力較強，臨床上分期升高；經(jīng)過文獻查閱，認為原因可能是KLF4 參與細胞增殖，影響并阻斷細胞周期 G1/S 期。有報道顯示， KLF4 在 P53 通路中具有活化 P21 的作用，進而能夠保持細胞周期停止在G1/S 期而發(fā)揮抑制細胞增殖的作用[8]。此外，有研究證實，KLF4可以通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達，發(fā)揮抑制腫瘤遷移以及侵襲的作用。由于MMPs蛋白參與新生血管形成的某些金屬離子以及腫瘤的轉(zhuǎn)移、生長以及侵襲等過程，通過降解血管基底膜以及其他細胞外基質(zhì)(ECM)，進而降解腫瘤細胞中血管基底膜以及突破細胞外基質(zhì)中的蛋白，抑制腫瘤細胞的生長與遷移。高興強等[9]發(fā)現(xiàn)，采用高表達的KLF4胰腺癌細胞注射給予小鼠后，癌細胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制，進一步說明KLF4具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，KLF4與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切，其在人體內(nèi)的表達缺失或許是宮頸癌早期癌變的預兆，有望成為宮頸癌未來診斷以及治療的潛在靶標。通過上調(diào)KLF4在宮頸癌組織中的表達可能可以抑制腫瘤細胞的增殖以及遷移，進而降低腫瘤擴散程度，有望為疾病的治療提供新思路。

參考文獻

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(收稿：2016-04-09)

【中圖分類號】R737.33

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.004

*河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20160376)