何　歡，陳新諾，曾　澤，任玉鵬，湯　承，張　斌，岳　華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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副豬嗜血桿菌OmpP2刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄及致炎機(jī)制初步分析

何歡，陳新諾，曾澤，任玉鵬，湯承，張斌*，岳華*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

摘要：為了研究副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)弱毒株11型H465株OmpP2刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)炎性因子mRNA的轉(zhuǎn)錄和對NF-κB和MAPKs信號通路的影響，提取并純化HPS血清11型H465株的OmpP2，分別用5、10 μg·mL-1OmpP2刺激PAMs 6、12 h后收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白質(zhì)。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用RT-PCR檢測炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA轉(zhuǎn)錄水平。利用Western blot方法檢測ERK1/2、JNK、P38、P65和IκBα蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：HPS H465株的OmpP2能夠顯著地誘導(dǎo)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)能夠引起JNK、P65蛋白表達(dá)水平顯著升高和 IκBα 蛋白表達(dá)水平顯著降低 (P<0.05)。上述結(jié)果證實(shí)了HPS 血清11型H465株的OmpP2能夠通過調(diào)節(jié)MAPKs信號通路中JNK蛋白以及NF-κB信號通路中P65蛋白和IκBα蛋白降解促進(jìn)炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；OmpP2；炎性因子；NF-κB和MAPK信號通路

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種共棲菌，在特定的條件下侵入機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的革拉澤病(Gl?sser’s disease)[1]。該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。根據(jù)熱穩(wěn)定抗原和瓊脂擴(kuò)散的方法，HPS至少可分為15個(gè)血清型，1、5、10、12、13和14型毒力最強(qiáng)，2、4和15型為中等毒力菌株，血清型3、6、7、8、9和11型為弱毒力菌株，還有一些不定型的菌株[2]。HPS的毒力因子和致病機(jī)制一直都是研究熱點(diǎn)，HPS OmpP2是含量最為豐富的外膜蛋白，屬于微孔蛋白，也是受關(guān)注度最高的外膜蛋白[3]。研究發(fā)現(xiàn)HPS OmpP2蛋白的序列具有豐富的遺傳多樣性，存在兩種結(jié)構(gòu)類型，即參考菌株中強(qiáng)毒力的血清型菌株中OmpP2基因存在兩處連續(xù)堿基缺失，而參考菌株無毒力菌株中OmpP2基因沒有出現(xiàn)這種缺失情況，暗示了這種缺失現(xiàn)象主要出現(xiàn)在強(qiáng)毒力血清型的菌株中[4]。通過基因缺失株的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)HPSOmpP2基因參與了HPS對宿主細(xì)胞的黏附入侵，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抵抗血清中補(bǔ)體系統(tǒng)殺菌作用等一系列的功能[5]。另外，HPS血清5型Nagasaki株OmpP2蛋白能夠誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)炎性細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6及IL-8轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)[6]，說明OmpP2能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的炎性免疫應(yīng)答。在本研究中，作者運(yùn)用Real-Time PCR和Western blot方法研究HPS血清11型H465株的OmpP2誘導(dǎo)PAMs炎性因子的表達(dá)及對MAPK和NF-κB信號通路的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及細(xì)胞系所用的HPS血清5型Nagasaki株和血清11型H465株由本實(shí)驗(yàn)室保存，PAMs(3D4/2)購自ATCC公司。

1.1.2主要試劑及配制胰蛋白胨大豆瓊脂 (Trypticase soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯 (Trypticase soy broth，TSB) 購自青島海博生物技術(shù)公司；RMPI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM、TaqDNA聚合酶、Trizol等購自寶生物工程(大連)有限公司。1.1.3主要儀器恒溫培養(yǎng)箱和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司；高速離心機(jī)購自Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)購自TANO公司；熒光定量PCR儀(7300 Real Time PCR System)購自Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1OmpP2的提取純化及鑒定參照B.Zhang等[5]提取OmpP2的方法，將-80 ℃凍存的HPS 血清5型Nagasaki株和血清11型H465株在TSA(含新生牛血清和NAD)平板上復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。然后挑取單菌落在TSB(含新生牛血清和NAD)肉湯中于37 ℃、180 r·min-1振蕩培8～12 h，收集菌體，用PBS洗三次并用TE buffer重懸，加入1.3 g溶菌酶、1 mol·L-1MgCl2、DNase及RNase處理后離心收集菌體，再用TX buffer(TE+2% TritionX-100)洗滌后加入胰蛋白酶，37 ℃振蕩1～2 h，離心收集沉淀溶于含有0.25% SLS的HEPES buffer中，于-80 ℃保存。將提取的OmpP2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析。同時(shí)，提純的蛋白質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)鑒定。1.2.2 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)的培養(yǎng)及處理在12孔板上用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)PAMs。用5和10 μg·mL-1H465株的OmpP2刺激PAMs，用Nagasaki株的OmpP2作為陽性對照，用含有0.25% SLS的HEPES buffer作為陰性對照，每種處理細(xì)胞的方法設(shè)置3個(gè)平行，在6和12 h后收集細(xì)胞。

1.2.3RNA的抽提及cDNA的合成加入Trizol收集PAMs，提取細(xì)胞總RNA，溶于10 μL DEPC處理水，取1 μL利用Prime ScriptTMRT 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并置于-20 ℃待用。

1.2.4Real-Time PCR以RPL4作為內(nèi)參基因[7]，運(yùn)用Real-Time PCR對OmpP2刺激PAMs后細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α編碼基因的相對轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行測定。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，SYBR premix ExTaqTM10 μL，引物F/R均為0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s；57 ℃ 31 s；共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)設(shè)定加入ddH2O作為陰性對照。引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1　炎性因子及管家基因引物序列

1.2.5Western blot按照RIPA裂解液說明書提取蛋白質(zhì)，并用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定提取的蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并在5%脫脂乳中室溫封閉2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加入1∶1 000稀釋的一抗(NF-κB P65、IκBα、ERK1/2、P38、JNK和β-actin購自美國Cell Signaling公司)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購自美國Abbkine公司)37 ℃孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，每種信號蛋白質(zhì)的檢測設(shè)置3個(gè)平行。利用 FusionCapt 軟件(Vilber Lourmat，德國)成像系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)條帶并計(jì)算其灰度值。

1.2.6數(shù)據(jù)分析參照K.Livak等[8]的介紹，不同組別中各炎性因子含量通過2-ΔΔCT法進(jìn)行比較，所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1純化OmpP2蛋白的SDS-PAGE分析

將提取的OmpP2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析。結(jié)果顯示Nagasaki株和H465株的純化OmpP2電泳后條帶大小與A.Ruiz等[9]所報(bào)道的電泳條帶大小一致，見圖1，目的條帶在36.6～38.5 ku范圍內(nèi)。最后用MALDI-TOF-TOF進(jìn)行鑒定，表明提純的蛋白質(zhì)就是OmpP2。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.H465株的OmpP2；2.Nagasaki株的OmpP2M.Protein molecular weight marker；1.HPS H465 strain OmpP2；2.HPS Nagasaki strain OmpP2圖1　純化OmpP2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE analysis of purified OmpP2

2.2OmpP2刺激PAMs 細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析

用5、10 μg·mL-1不同劑量的HPS Nagasaki株和H465株的OmpP2刺激PAMs，用RT-PCR檢測6和12 h后炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。與Nagasaki株相比，H465株的OmpP2也能夠誘導(dǎo)炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(圖2)。

與對照組相比，*.差異顯著( P<0.05 )，**.差異極顯著(P<0.001)When compared with the control group，* represent significant difference (P<0.05)，** represent extremely significant difference (P < 0.001)圖2　OmpP2刺激PAMs 后IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β和TNF-α 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.2　The mRNA transcription level change of IL-6，IL-8，IL-1α，IL-1β and TNF-α after OmpP2 stimulated PAMs

H465株OmpP2刺激細(xì)胞6 h后，5和10 μg·mL-1的OmpP2試驗(yàn)組均可引起IL-1α炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，且較 Nagasaki株分別高0.3倍和0.5倍；5 和10 μg·mL-1試驗(yàn)組均可引起IL-1β炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，且10 μg·mL-1的試驗(yàn)組較 Nagasaki株高1.2倍；10 μg·mL-1試驗(yàn)組結(jié)果表明IL-6炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P<0.001)，較Nagasaki株變化高1倍；5 和10 μg·mL-1試驗(yàn)組均可引起IL-8炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，分別較 Nagasaki株高0.3倍和0.6倍；10 μg·mL-1試驗(yàn)組可引起TNF-α炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，且較 Nagasaki株高0.5倍；H465株的OmpP2刺激細(xì)胞12 h后，10 μg·mL-1試驗(yàn)組可引起IL-1α炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，較Nagasaki株高0.5倍；兩濃度的OmpP2均能引起對炎性因子IL-1β炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但作用不顯著；10 μg·mL-1試驗(yàn)組可引起IL-6、IL-8炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)，較Nagasaki株分別低1倍和0.4倍；兩濃度的OmpP2均能引起對TNF-α炎性細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但作用不顯著。

2.3OmpP2對NF-κB和MAPK信號通路的影響分析

用5、10 μg·mL-1不同劑量的HPS H465株純化OmpP2刺激PAMs，對照組加入0.25% SLS的HEPES buffer刺激PAMs。通過Western blot方法檢測HPS H465株OmpP2對NF-κB信號通路中IκBα和P65以及MAPK通路中ERK1/2、P38、JNK蛋白的表達(dá)量，結(jié)果見圖3。與對照組相比較，H465株OmpP2刺激細(xì)胞6 h后，ERK1/2、JNK和P38的蛋白質(zhì)表達(dá)量均呈升高趨勢；IκBα蛋白的表達(dá)量有所下降，P65蛋白表達(dá)量均隨著劑量的增高呈現(xiàn)升高趨勢，且顯著差異(P<0.05或P<0.001)。H465株OmpP2刺激細(xì)胞12 h后ERK1/2和P38蛋白表達(dá)量均呈升高趨勢；JNK蛋白表達(dá)量均隨著劑量的增高呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05)；IκBα蛋白的表達(dá)量有所下降，在10 μg·mL-1試驗(yàn)組有顯著下降的作用(P<0.05)；P65蛋白表達(dá)量均隨著劑量的增高呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05或P<0.001)。

與對照組相比，*.差異顯著(P<0.05 )，**.差異極顯著(P<0.001)When compared with the control group，* represent significant difference (P<0.05)，** represent extremely significant difference (P<0.001)圖3　HPS H456的OmpP2在刺激PAMs 激活NF-κB和MAPKs信號通路中的作用Fig.3　The effects of OmpP2 on the nuclear factor-κB (NF-κB) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) signaling pathway in HPS H456-OmpP2 stimulated PAMs

3討論

研究發(fā)現(xiàn)HPS在急性感染過程中，常常引起敗血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血等休克炎性癥狀[10-12]。這表明HPS能夠突破豬氣管上皮細(xì)胞的屏障作用進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過產(chǎn)生一些免疫激活介質(zhì)激活宿主的炎性反應(yīng)應(yīng)答。國外多項(xiàng)研究表明多種革蘭陰性細(xì)菌(包括大腸桿菌、流感嗜血桿菌、傷寒沙門菌及腦膜炎奈瑟球菌)的膜孔蛋白均能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性免疫應(yīng)答[13-15]。前期研究發(fā)現(xiàn)HPS的強(qiáng)毒株血清型5型(Nagasaki株)外膜蛋白P2(OmpP2)能夠刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)炎性因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[6]。作者利用純化的血清11型H465株OmpP2刺激PAMs研究其多種炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，證實(shí)了血清11型H465株OmpP2同血清5型一致都能使IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β和TNF-α五種炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但兩種血清型所引起的轉(zhuǎn)錄水平的差異無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此推測HPS弱毒株血清型OmpP2能夠調(diào)節(jié)IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β及TNF-α等炎性因子的表達(dá)。

MAPK和NF-κB是參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要信號通路[16-17]，可被炎癥因子、腫瘤因子等多種胞外刺激活化，進(jìn)一步合成并釋放炎性因子，再通過體循環(huán)或旁分泌作用于整個(gè)機(jī)體組織細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)[18-20]。激活的PAMs通過一系列的內(nèi)源性感染途徑以及自身分泌蛋白的刺激釋放內(nèi)源性炎性因子TNF-α以及炎性細(xì)胞會產(chǎn)生IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β等炎性因子，繼而使細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)激發(fā)肺部急性炎癥[6]。作者利用Western blot方法研究HPS 11型H465株OmpP2對MAPK和NF-κB信號通路的影響，研究結(jié)果表明JNK和P65蛋白表達(dá)量都有顯著升高(P<0.05或P<0.001)，推測HPS 血清11型H465株的OmpP2能夠調(diào)節(jié)MAPKs信號通路中JNK蛋白以及NF-κB信號通路中P65蛋白和IκBα蛋白的降解促進(jìn)炎性因子的表達(dá)。因此，OmpP2可能是研發(fā)HPS疫苗的一個(gè)重要的潛在切入點(diǎn)，開發(fā)出針對相應(yīng)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑或是激活劑，為多種疾病的發(fā)病機(jī)制研究和藥物疫苗的開發(fā)提供了重要的理論支持，同時(shí)也為深入了解OmpP2影響HPS誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生的分子機(jī)制提供參考，對于HPS基礎(chǔ)生物學(xué)和致病機(jī)制的研究具有重要意義。

4結(jié)論

HPS弱毒株血清11型H465株的OmpP2與強(qiáng)毒株血清型5(Nagasaki株)相比，同樣能夠調(diào)節(jié)IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β及TNF-α等炎性因子的表達(dá)；在致病機(jī)制方面研究發(fā)現(xiàn)H465株的OmpP2能夠通過調(diào)節(jié)MAPKs信號通路中JNK蛋白以及NF-κB信號通路中P65蛋白和IκBα蛋白的降解來促進(jìn)炎性因子表達(dá)。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.016

收稿日期：2015-12-25

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31302119)；四川省教育廳創(chuàng)新項(xiàng)目(14ZB046)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303034-1)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(CX2015SZ074)

作者簡介：何歡(1991-)，女，蒙古族，遼寧康平人，碩士生，主要從事動物病原分子生物學(xué)研究，E-mail:1252469322@qq.com *通信作者：張斌，E-mail:binovy@sina.com；岳華，E-mail:yhua900@163.com

中圖分類號：S852.613

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1428-07

The Initial Research of OmpP2 inHaemophilusparasuisInduces Pro-inflammatory Cytokine mRNA Transcription and Inflammatory Mechanism in Porcine Alveolar Macrophages

HE Huan，CHEN Xin-nuo，ZENG Ze，REN Yu-peng，TANG Cheng，ZHANG Bin*，YUE Hua*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Abstract:The aim of this study was to explore the role of out membrane protein P2 (OmpP2) in Haemophilus parasuis serovar 11 reference H465 strain to induce pro-inflammatory cytokine mRNA transcription，and NF-κB and MAPKs signaling pathways in porcine alveolar macrophages (PAMs).The OmpP2 was extracted from the H.parasuis H465 and stimulated in PAMs with 5 and 10 μg·mL-1for 6 and 12 hours.The total RNA and cells protein were extracted and the RNA was reversed into cDNA.The mRNA transcription levels of IL-1α，IL-β，IL-6，IL-8 and TNF-α were detected by Real-time PCR，and the protein of NF-κB P65，IκBα，ERK，JNK and P38 were detected by Western blot.The result showed that the mRNA transcription of IL-1α，IL-β，IL-6，IL-8 and TNF-α in PAMs induced by the OmpP2 from H.parasuis were significantly up-regulated (P<0.05)，and the protein of JNK，P65 in PAMs induced by the OmpP2 from H.parasuisis significantly increased and the protein of IκBα was significantly declined(P<0.05).The above results exhibit that the OmpP2 could effectively activate the JNK and P65 proteins and increase the degradation of IκBα in NF-κB and MAPKs signaling pathways to promote the pro-inflammatory cytokines expression.

Key words:Haemophilus parasuis；OmpP2；pro-inflammatory cytokines；MAPKs/ NF-κB signaling pathways