趙小磊　翟晉豫　劉玲玲　梁永波　牛銀銀　李三華　齊　華

(河南省食品藥品審評查驗(yàn)中心,鄭州450001)

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孕激素受體A型原核表達(dá)及單克隆抗體制備

趙小磊翟晉豫①②劉玲玲①梁永波①牛銀銀①李三華①齊華①

(河南省食品藥品審評查驗(yàn)中心,鄭州450001)

[摘要]目的：制備孕激素受體A型單克隆抗體，為后期應(yīng)用到免疫組化實(shí)驗(yàn)提供支持。方法：選擇無縫克隆的方法將目的基因與載體連接到一起，通過誘導(dǎo)表達(dá)收集蛋白，經(jīng)過免疫后細(xì)胞融合獲得單克隆抗體。將該單克隆抗體經(jīng)免疫組化驗(yàn)證。結(jié)果：將融合后篩選的陽性細(xì)胞制備獲得的單克隆抗體7C7經(jīng)免疫組化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)陽性，在直腸癌組織、平滑肌組織中呈現(xiàn)陰性，符合目的抗體的要求。結(jié)論：該方法獲得的孕激素受體A型單克隆抗體較常規(guī)方法周期短，獲得的抗體在不同組織間結(jié)果符合預(yù)判，對后期研究區(qū)別PR-A、PR-B，臨床推廣具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]孕激素受體；原核表達(dá)；單克隆抗體

孕激素受體(Progesterone receptor，PR)作為乳腺癌檢測中經(jīng)常使用到的一項(xiàng)指標(biāo)，對治療乳腺癌患者起著重要的指導(dǎo)作用。而在有關(guān)治療乳腺癌當(dāng)中所使用到的內(nèi)分泌治療方法，常常出現(xiàn)有些PR為陽性，但內(nèi)分泌療法依然不佳的怪相。針對于此，經(jīng)Horwitz等[1]研究者的研究發(fā)現(xiàn)，PR主要由兩種不同的亞型，即PR-A與PR-B組成。在多位學(xué)者大量的研究基礎(chǔ)上[2，3]，揭示出它們的分泌情況往往與乳腺癌的發(fā)生、疾病轉(zhuǎn)移等有著密切的關(guān)聯(lián)。目前在醫(yī)院病理科免疫組化方面應(yīng)用該不同亞型單克隆抗體已相當(dāng)普及，但是優(yōu)秀的抗體多為國外leica、Dako等公司產(chǎn)品，如何準(zhǔn)確、快速制備獲得一株優(yōu)異的PR-A單克隆抗體從經(jīng)濟(jì)、社會層面顯得尤為重要。本研究的重點(diǎn)在于選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，快速、準(zhǔn)確的獲得PR-A型單克隆抗體，為后續(xù)的研究提供物質(zhì)支持。

1材料與方法

1.1主要原材料PR cDNA基因購于Origene公司；pET-28a質(zhì)粒載體、DH5α、BL-21菌株均由河南中醫(yī)學(xué)院惠贈；無縫克隆試劑盒購于上海近岸生物；PCR引物交由上海生工生物合成；NdeI與XhoI內(nèi)切酶購于TaKaRa公司；His純化柱、Protein G純化柱為GE公司產(chǎn)品；快免佐劑為北京博奧龍產(chǎn)品；雌性8周齡BALB/c小鼠購于河南省動物實(shí)驗(yàn)中心；SP2/0細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；PR-A、PR-B免疫組化單克隆抗體為leica公司克隆號分別為：16和SAN27；其他各類化學(xué)試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1目的條帶PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)PR-A上下游引物，由購買的PR全長基因，截選492～1 443 bp之間的DNA片段，設(shè)計(jì)上下游引物分別為：5′-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGC-CATATG-ATGAGCCGGTCC-GG-3′和5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTG-CTCGAG-CTTGCAGGGCGGCGGC-3′。PCR擴(kuò)增目的條帶，選用的擴(kuò)增聚合酶為KOD酶，擴(kuò)增程序：94℃ 7 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，55℃退火30 s，68℃延伸60 s，循環(huán)次數(shù)為30次。PCR結(jié)束后經(jīng)1%核酸凝膠電泳鑒定并切膠回收備用。

1.2.2質(zhì)粒雙酶切及無縫克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒將pET-28a依照TaKaRa產(chǎn)品說明書的要求，在Buffer K緩沖液條件下，經(jīng)NdeⅠ與XhoⅠ內(nèi)切酶在37 ℃下酶切2 h。后經(jīng)核酸凝膠電泳回收酶切后質(zhì)粒備用。將PCR擴(kuò)增獲得的目的片段與pET-28a雙酶切載體片段按照無縫克隆試劑盒說明書的要求，按照一定比例混合后，加入Buffer與重組酶，在37 ℃下孵育20 min轉(zhuǎn)入DH5α菌中，后涂含抗生素平板。

1.2.3重組質(zhì)粒的鑒定與表達(dá)純化將1.2.2中挑取菌克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，同時(shí)將出現(xiàn)目的條帶的單克隆菌送測序，判斷有無突變。將抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL-21菌感受態(tài)細(xì)胞中，在IPTG誘導(dǎo)后利用PBS緩沖液超聲破碎，鑒定目的蛋白有無表達(dá)，蛋白為可溶性還是包涵體形式。后經(jīng)過His柱純化，獲得目的蛋白。

1.2.4目的蛋白免疫與效價(jià)檢測獲得的目的蛋白，經(jīng)快免佐劑免疫后，按照50 μg/只劑量注射入小鼠腿部肌肉，經(jīng)過兩次免疫后檢測小鼠抗體效價(jià)水平，評價(jià)此免疫效果，融合前選擇最佳的一只小鼠尾部靜脈沖擊加強(qiáng)免疫目的蛋白大約50 μg。

1.2.5細(xì)胞融合及抗體篩選與純化首先觀察并收集SP2/0細(xì)胞株，經(jīng)1 200 r/min離心10 min。取小鼠脾臟經(jīng)研磨器研磨，濾網(wǎng)過濾后離心，除去未完全解離部分。分別計(jì)數(shù)SP2/0與脾細(xì)胞的數(shù)目，將兩者按照1∶5的比例進(jìn)行混合，1 200 r/min離心10 min。在PEG1500誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下進(jìn)行融合。融合后按照10萬細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板，在HAT溶液的選擇性篩選作用下，培養(yǎng)細(xì)胞生長至孔底約30 %以上。包被目的蛋白(1.2.3中所獲得)200 ng/孔至ELISA微孔板中，4℃過夜。通過ELISA間接法檢測融合后的細(xì)胞株，將陽性細(xì)胞株克隆化，驗(yàn)證后培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)目按照50萬～200萬/只，注射經(jīng)石蠟油致敏的小鼠腹腔進(jìn)行培值，待10～15 d左右采集腹水，經(jīng)過Protein G柱進(jìn)行純化，獲得單克隆抗體。

1.2.6單克隆抗體初步鑒定將可能為PR-A的目標(biāo)性單克隆抗體分別與選取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院已確定的乳腺癌、子宮肌瘤癌、甲狀腺癌、平滑肌瘤組織，每個(gè)組織連續(xù)切6張片子，其中3張片子利用leica PR-A抗體(克隆號16)鑒定，同時(shí)對照使用自制7C7抗體作為對照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。經(jīng)過leica的BondⅢ型自動免疫組化儀進(jìn)行機(jī)器自動免疫組化驗(yàn)證，獲取的結(jié)果進(jìn)行分析，評價(jià)上述制備獲得的單克隆抗體。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增目的條帶及重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果圖1中PCR目的條帶位置正確，并且由圖2可以發(fā)現(xiàn)，從DH5α中提取獲得的質(zhì)粒，經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，在1 000 bp以上位置處出現(xiàn)一條明顯的目的條帶，說明構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確。

圖1　PCR目的條帶核酸電泳結(jié)果Fig.1　Electrophoresis results of PCR(PR)nucleic acid

圖2　PR雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2　Results of PR double digestionNote: 1.Double digested plasmid vector of pET-28a；2.Double digestion of target band.

2.2測序結(jié)果經(jīng)送至上海生工生物測序基因的反饋結(jié)果所示，構(gòu)建至pET-28a上的PR基因序列492～1 443 bp序列為發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，同時(shí)由測序位點(diǎn)至引物兩端pET-28a序列包含His標(biāo)簽序列段也正確，可以進(jìn)行后期蛋白誘導(dǎo)驗(yàn)證及表達(dá)收集工作。

2.3重組蛋白的表達(dá)與鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL-21菌株中，在IPTG的誘導(dǎo)后，經(jīng)過His標(biāo)簽柱純化，純化結(jié)果如圖3所示。目的蛋白的大小與理論蛋白大小位置處(35 kD)基本相同。

2.4單克隆抗體純化結(jié)果在經(jīng)過細(xì)胞融合獲得的陽性細(xì)胞株7C7，注入小鼠腹腔后制備腹水，將腹水經(jīng)過Protein G柱純化后SDS-PAGE電泳鑒定如圖4所示，結(jié)果顯示：純化后的條目的條帶位置分別在大約50 kD與25 kD左右，分子量與小鼠單克隆抗體的分子量相同，目的條帶正確。

2.5單克隆抗體IHC鑒定將純化獲得的單克隆抗體7C7分別與從鄭大一附院獲得的乳腺癌組織(PR-A強(qiáng)陽性、RP-B強(qiáng)陽性)、直腸癌組織、平滑肌瘤組織、子宮肌瘤組織分別進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。選取部分結(jié)果圖如圖5所示，從表1、圖5可知，抗體7C7與RP-B組織識別為陰性，與其余呈陰性，與子宮肌瘤呈陽性，說明本抗體基本可以達(dá)到診斷使用抗體，后續(xù)需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3　重組蛋白純化后鑒定Fig.3　Recombinant protein was identified after purification

圖4　抗體7C7 經(jīng)Protein G純化SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果圖Fig.4　Antibody 7C7 purified by Protein G and electrophoresis results by SDS-PAGE

圖5　7C7抗體各組織免疫組化結(jié)果Fig.5　Antibody 7C7 IHC results of organizationsNote: A.PR-A-positive breast cancer；B.PR-B positive；C.Smooth muscle tumors；D.Colorectal cancer；E.Uterine fibroid tissue.

表1各類組織中l(wèi)eica PR-A與7C7比較結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Tab.1Results of statistical that leica PR-A comparison with 7C7 in all kinds of organizations

BreasttissuePR-ABreasttissuePR-BBreasttissuePR(-)ColorectalcancertissueLeiomyomaUterinefibroidtissue1+++----+++Leica2+++----+++3+++----+++4+++----+++7C75+++----+++6+++----+++

3討論

有研究結(jié)果結(jié)合目前臨床的統(tǒng)計(jì)值指出[4]：在浸潤性乳腺癌的患者病例當(dāng)中，約有一半PR-A、PR-B失去共表達(dá)的特點(diǎn)，結(jié)果中約有80%以上為PR-A過表達(dá)。在正常乳腺組織當(dāng)中PR-A與PR-B為共表達(dá)，在不典型增生、DCIS和多數(shù)浸潤性乳腺癌中的PR-A、PR-B均為非共表達(dá)。那么，可以揭示出PR-A、PR-B對指導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生及其類型有著重要意義。同時(shí)，因?yàn)镻R-A的表達(dá)與ER呈正相關(guān)而PR-B則沒有,在浸潤性導(dǎo)管癌中PR亞型的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級相關(guān)，但是與淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小、患者預(yù)后無關(guān)[5]。因此，制備PR-A單克隆抗體在免疫組化實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值就有著突出重要的意義。

目前受限于免疫組化當(dāng)中組織樣本預(yù)先處理的影響，在免疫組化石蠟組織中，需要對已經(jīng)變性的抗原進(jìn)行修復(fù)，在制備單克隆抗體的過程當(dāng)中對于抗原的選擇考慮可以通過原核來進(jìn)行解決，其蛋白的有關(guān)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能會源自一些保守的蛋白序列位置，基于此考慮，選擇492～1 443 bp堿基處的序列得到的蛋白進(jìn)行免疫，并制備獲得單克隆抗體。在抗原制備方面，選擇無縫克隆的重組方式，可更快、更高效的獲得重組質(zhì)粒。并且結(jié)合快免佐劑的特點(diǎn)，整個(gè)抗體制備周期可以大大縮減?？梢越档陀少徸試饪贵w產(chǎn)生的較高成本，為有能力完成上述實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室提供借鑒意義。通過結(jié)果驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)制備出的PR-A克隆號7C7單克隆抗體不與PR-B存在交叉，且在乳腺癌、子宮肌瘤組織中呈現(xiàn)陽性，在甲狀腺癌組織、平滑肌組織中呈現(xiàn)陰性，符合免疫組化當(dāng)中評價(jià)抗體的原則，受限于獲得樣本的數(shù)量有限，后期針對該抗體的親和力、與其他組織的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步完善。

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[收稿2015-11-30修回2016-04-25]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.018

通訊作者：②E-mail：biozjy@126.com。

作者簡介：趙小磊(1965年-)，女，高級工程師，主要從事醫(yī)療器械技術(shù)評審、醫(yī)療器械注冊核查、醫(yī)療器械GMP檢查、藥品GSP認(rèn)證、藥品注冊核查的工作，E-mail:18638775977@126.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：齊華(1963年-)，男，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究工作，E-mail:qihua63@163.com。

中圖分類號R392.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1013-04

Expression of progesterone receptor a protein in prokaryotic and preparation of monoclonal antibodies to PR-A

ZHAO Xiao-Lei,ZHAI Jin-Yu,LIU Ling-Ling,LIANG Yong-Bo,NIU Yin-Yin,LI San-Hua,QI Hua.

Henan Food and Drug Evaluation Identification Center,Zhengzhou 450001,China

[Abstract]Objective:To prepare for mAb of progesterone receptor.It would provide support for the immunohistochemistry behind.Methods: Target gene connected together with a carrier by seamless cloning method.The target protein that expression by inducing was collected.And with cell fusion method ,the monoclonal antibodies were preparation.Then the mAb were detected by IHC.Results: The mAb(clone 7C7)was detected and it found positive for the breast,uterine fibroid tissue,showed negative in colorectal cancer tissue,smooth muscle tissue,the goal of the claim were achieve.Conclusion: Finally,we found the method that prepare for mAb was far beyond our imagination.The result of IHC on different samples about mAb(7C7)obtained compliance with anticipation.Study on the difference between the PR-A and PR-B had significance.

[Key words]Progesterone receptor;Prokaryotic expression;Monoclonal antibody

①河南賽諾特生物技術(shù)有限公司，鄭州市病理診斷工程技術(shù)研究中心，鄭州450001。