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        登革病毒Ⅱ型引起原代HDMECs通透性變化機(jī)制的初步研究①

        2016-08-09 07:37:55戴雪婷孔維瑩
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2016年7期
        關(guān)鍵詞:通透性孵育內(nèi)皮細(xì)胞

        趙 軍 左 麗 戴雪婷 裴 華 袁 靜 孔維瑩

        (貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽(yáng)550004)

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        登革病毒Ⅱ型引起原代HDMECs通透性變化機(jī)制的初步研究①

        趙軍左麗戴雪婷裴華袁靜孔維瑩

        (貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽(yáng)550004)

        [摘要]目的:了解登革病毒Ⅱ型(Dengue virus Type 2,DENV-2)感染原代人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Primary Human dermal micro-vascular endothelial cells,pHDMECs)引起細(xì)胞通透性改變的機(jī)制。方法:用103 TCID50的DENV-2感染pHDMECs;于4、8、12、24、48 h Real time-PCR、免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DENV-2 NS1部分序列及蛋白;Transwell法檢測(cè)細(xì)胞通透性;Real time -PCR和雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IL-6和IL-8的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)24、48、72 h細(xì)胞凋亡。結(jié)果:DENV-2感染的pHDMECs 病毒NS1基因相對(duì)表達(dá)上調(diào),但未檢測(cè)到病毒NS1蛋白;DENV-2感染的pHDMECs通透性在24、48 h顯著升高;pHDMECs被感染72 h后凋亡也無(wú)明顯變化; IL-6和IL-8 mRNA分別在8、24 h相對(duì)表達(dá)上調(diào)[IL-6:(2.49±0.5)倍,P<0.05;IL-8:(6.82±1.69)倍,P<0.05];對(duì)照組和感染組分泌的IL-6于8 h分別為(869.6±50.7)、(1 248.8±86.9)pg/ml,P<0.05;IL-8于48 h分別為(967.6±156.6)、(1 331.0±86.3)pg/ml,P<0.05。結(jié)論:DENV-2能感染pHDMECs;pHDMECs被DENV-2感染后,細(xì)胞的通透性增加與凋亡無(wú)關(guān),與促炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8明顯上調(diào)關(guān)系密切。

        [關(guān)鍵詞]登革病毒;原代人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞;IL-6;IL-8;通透性

        登革病毒(Dengue virus,DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬,感染后引起癥狀較輕的登革熱(Dengue fever,DF)和嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS)[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球每年約有3.9億人受到DENV感染,出現(xiàn)癥狀的約9 600萬(wàn),其中50萬(wàn)人需要住院治療[2]。我國(guó)南方部分地區(qū)也不同程度地受到DENV的影響[3],目前對(duì)DENV感染仍然沒(méi)有有效的疫苗和治療方法[1,2]。

        DHF/DSS是導(dǎo)致患者死亡的主要原因,其主要癥狀包括微血管通透性增加、血漿滲漏、血小板減少、出血等癥狀??贵w依賴的增強(qiáng)作用(Antibody dependent enhancement,ADE)及交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的激活被認(rèn)為是DHF/DSS的重要致病機(jī)制[1,4]。二者共同作用引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,表現(xiàn)為DHF/DSS患者多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、INF-γ、IL-1β、CXCL-10及MCP-1等高表達(dá),導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cells,VECs)功能紊亂[1]。

        DHF/DSS的病人中高表達(dá)的細(xì)胞因子主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞[1]。研究表明,DENV感染VECs后分泌的多種細(xì)胞因子參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程。Nadine等[5]用DENV-4感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(primary human umbilical vein endothelial cells,pHUVECs),發(fā)現(xiàn)促炎性因子IL-6、IL-8、CXCL-9、10、11及RANTES有不同程度的上調(diào);Huang等[6]用DENV-2和DENV-3作用于HUVECs可直接上調(diào)IL-6和IL-8。臨床的研究表明IL-6和IL-8與DHF發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系[7]。IL-6是一種促炎性細(xì)胞因子,作用于VECs直接增加細(xì)胞的通透性,且與IL-6的濃度有相關(guān)性[8]。IL-8是與炎癥相關(guān)的趨化因子,DENV-2感染的HMEC-1分泌IL-8引起骨架重排使VECs的通透性增高[9]。至于DENV-2感染的pHDMECs通透性是否發(fā)生變化,以及與IL-6和IL-8之間的關(guān)系,目前還不清楚。

        細(xì)胞凋亡是VECs損傷和通透性增加的重要因素,DENV-2感染是否引起VECs凋亡仍存在爭(zhēng)議,Long等[10]研究表明,DENV-2感染pHUVECs后通過(guò)外源性凋亡受體Fas/FasL途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生;但是也有報(bào)道,DENV-2感染pHUVECs未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡[11]。DENV-2感染是否引起pHDMECs凋亡,目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

        本次研究擬采用pHDMECs為內(nèi)皮細(xì)胞模型,錨定細(xì)胞凋亡的發(fā)生和細(xì)胞因子的分泌,初步探討DENV-2作用于pHDMECs通透性變化的機(jī)制,從而為DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1細(xì)胞株DENV-2國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(NGC株) 本教研室增殖并保存于液氮。pHDMECs購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司;白紋伊蚊細(xì)胞(C6/36)購(gòu)于中科院昆明細(xì)胞庫(kù);BHK細(xì)胞為本教研室傳代保存。

        1.1.2主要試劑及儀器ECM培養(yǎng)基及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加物(ECGS)(美國(guó)Sciencell公司);FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit with 7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(Biolegend公司);SsoFast EvaGreen Supermix及Real-time detection System(Bio-Rad公司);Human IL-6 和IL-8 Platinum ELISA試劑盒(eBioscience公司);引物序列(見(jiàn)表1,上海捷瑞生物工程有限公司);熒光倒置顯微鏡(Nikon公司 TS100F);流式細(xì)胞儀(BD公司);多功能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H4型)。

        1.2實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1DENV-2的增殖、滴定與鑒定用C6/36細(xì)胞增殖病毒,TCID50法檢測(cè)并用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度,RT-PCR特異地?cái)U(kuò)增DENV-2 NS1部分序列(413 bp)及HindⅢ限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物以鑒定病毒。

        1.2.2pHDMECs的培養(yǎng)與鑒定細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng),棄上清,PBS液洗滌,0.25%胰蛋白(含EDTA)消化后,加全培養(yǎng)基(10%FBS-ECM含ECGS)終止消化,離心,棄上清加全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,分瓶,37℃、5%CO2培養(yǎng);細(xì)胞傳至3~4代,收集細(xì)胞樣本,分別用免疫組化法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pHDMECs的Ⅷ因子相關(guān)蛋白和CD31。

        1.2.3Real-time PCR檢測(cè)DENV-2 NS1部分序列的表達(dá)以103TCID50/ml的DENV-2感染pHDMECs(融合度約90%),于4、8、12、24及48 h收集細(xì)胞提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測(cè)內(nèi)參基因β-Actin和目的基因NS1部分序列擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct),用2-△△Ct法計(jì)算NS1部分序列在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)。

        1.2.4免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DENV-2對(duì)pHDMECs的感染選取生長(zhǎng)融合度為90%的pHDMECs,制成細(xì)胞懸液,2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板,37℃、5%CO2孵育24 h后,接種103TCID50/孔的DENV-2液孵育2 h,棄液洗滌,加2% FBS-ECM培養(yǎng)基(含ECGS)維持培養(yǎng),分別于24、48和72 h收集細(xì)胞樣本。免疫熒光法:細(xì)胞樣本經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定,0.1%Triton-X-100破膜,2%FBS封閉后,加抗NS1單克隆抗體,4℃孵育過(guò)夜;次日,加二抗(FITC-兔抗小鼠)孵育1~2 h,DAPI工作液染核后,熒光倒置顯微鏡拍照記錄結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù):細(xì)胞樣本依次孵育抗NS1單克隆抗體和FITC標(biāo)記二抗(兔抗小鼠),流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。

        1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pHDMECs凋亡DENV-2感染pHDMECs,在24、48和72 h收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,分別用 FITC-Annexin Ⅴ和7-AAD染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

        1.2.6DENV-2感染的pHDMECs通透性檢測(cè)將200 μl/孔細(xì)胞液含有(4×105個(gè)細(xì)胞)接種于纖粘蛋白包被的Transwell小室,下室加600 μl全培養(yǎng)基,放37℃、5%CO2孵育;24 h后待細(xì)胞鋪滿單層,接100 μl/孔DENV-2(103TCID50/ml),空白組和陽(yáng)性組分別加無(wú)血清ECM培養(yǎng)基和LPS(0.2 mg/ml),37℃、5%CO2孵育2 h,棄液加2%FBS-ECM(含ECGS)維持培養(yǎng);于4、8、12、24和48 h 加50 μl/孔 FITC-dextran(0.2 mg/ml),37℃孵育30min,收集下室培養(yǎng)液,用BioTek Synergy H4型多功能酶標(biāo)分析儀檢測(cè)熒光值(488 nm,525 nm)。

        1.2.7Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)于4、8、12、24及48 h收集DENV-2感染的pHDMECs細(xì)胞樣本,提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測(cè)內(nèi)參基因β-Actin和目的基因IL-6,IL-8的Ct值,用2-△△Ct法計(jì)算上述目的基因在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)。

        1.2.8雙抗夾心ELISA法檢測(cè)pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8的濃度DENV-2感染4、8、12、24及48 h pHDMECs的培養(yǎng)上清依次加入待使用的孔中,同時(shí)加2% FBS-ECM(空白對(duì)照)和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品,均為復(fù)孔,每孔50 μl;然后加50 μl/孔 Biotin-conjugate液;室溫孵育2 h;棄去孔中液體,用洗滌緩沖液洗滌,甩干,加入100 μl/孔 Streptavidin-HPR室溫孵育1 h;用洗滌緩液洗滌;每孔加100 μl TMB顯色劑,室溫避光孵育10 min;各孔中迅速的加入100 μl 終止液,BioTek Synergy H4型多功能酶標(biāo)分析儀檢測(cè)吸光度(450 nm)。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS22.0軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,DENV-2感染組和對(duì)照組之間的差異用方差分析檢驗(yàn)。

        2結(jié)果

        2.1pHDEMCs的培養(yǎng)與鑒定用10% FBS-ECM 全培養(yǎng)基(含ECGS)培養(yǎng)的pHDMECs在3 d左右均勻鋪滿單層,形態(tài)、大小一致,呈鵝卵石或者梭形(圖1);免疫組化法檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)蛋白,pHDMECs被染成棕褐色,而陰性對(duì)照BHK細(xì)胞染色前后無(wú)顏色變化(圖2);另外流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD31,同型對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組分別呈兩個(gè)獨(dú)立單峰,后者陽(yáng)性率達(dá)99.7%(圖3)。

        2.2DENV-2的滴定與鑒定Reed-Muench法計(jì)算病毒的滴度為7×106TCID50/ml;DENV-2 NS1部分序列大小為413 bp,NEBcutter V2.0軟件對(duì)NS1部分序列進(jìn)行分析,此序列存在一個(gè)HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),酶切產(chǎn)物分別為228 bp和185 bp;RT-PCR擴(kuò)增后,病毒感染組于413 bp處出現(xiàn)清晰明亮的條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切可見(jiàn)明顯的228 bp與185 bp條帶(圖4),證明此病毒為DENV-2。

        圖1 pHDMECs培養(yǎng)至第3天(×100)Fig.1 pHDMECs culture at 3rd day(×100)

        圖2 免疫組化法鑒定pHDMECs(×100) Fig.2 pHDMECs identified by immunohistochemistry(×100)Note: A.BHK cells as negative control;B.pHDMECs.

        圖3 pHDMECs CD31分子的表達(dá)Fig.3 Expression of CD31 on pHDMECs

        2.3DENV-2感染的pHDMECs NS1部分序列相對(duì)表達(dá)DENV-2感染的pHDMECs 4、8、12、24及48 h NS1部分序列基因熔解曲線峰位置相同,單形單一,說(shuō)明未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(圖5);以4 h NS1部分序列基因的相對(duì)表達(dá)(2-△△Ct值)作為基準(zhǔn),其他時(shí)間點(diǎn)NS1部分序列基因相對(duì)表達(dá)顯著升高,48 h達(dá)到最大值(圖6),說(shuō)明DENV-2能夠感染pHDME Cs, NS1部分序列基因的拷貝數(shù)隨著時(shí)間逐漸增加。

        2.4免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DENV-2對(duì)pHDMECs的感染DENV-2感染BHK細(xì)胞和pHDMECs 72 h,免疫熒光法檢測(cè)NS1部分序列蛋白的結(jié)果如圖7所示;圖8為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果,對(duì)照組與感染組平均熒光強(qiáng)度分別為(311±11)和(429±14)(P>0.05),而DENV-2感染的BHK細(xì)胞分別為(195±5.5)和(830±33.7)(P<0.05),兩組之間具有明顯的差別。結(jié)果表明pHDMECs被DENV-2感染72 h后無(wú)NS1部分序列蛋白的表達(dá)。

        圖4 DENV-2的NS1部分序列擴(kuò)增產(chǎn)物及HindⅢ酶切片段Fig.4 Identificating partial nucleotide sequences of DENV-2 and PCR production cutting by HindⅢNote: 1.Mark Ⅰ;2.Control;3.PCR production of DENV-2;4.PCR production cutting by HindⅢ.

        圖5 DENV-2 NS1部分序列基因的熔解曲線Fig.5 Melt curve of DENV-2 NS1

        2.5DENV-2感染的pHDMECs通透性檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)FITC-dextran熒光值來(lái)反應(yīng)通透性的變化,如圖9所示,24 h Control及DENV-2組的熒光值分別為(62.6±17.6)和(95.8±11.8),P<0.05;48 h分別為(36.2±8.8)和(68.5±9.2),P<0.05,提示在此時(shí)間點(diǎn)pHDMECs的通透性增加。

        2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)DENV-2對(duì)pHDMECs凋亡pHDMECs被DENV-2感染24、48和72 h均未發(fā)生明顯凋亡。如圖10所示,pHDMECs被DENV-2感染72 h早期凋亡和壞死的比例分別為32.6%和3.13%,對(duì)照組為32.4%和2.36%,提示DENV-2感染pHDMECs不能引起細(xì)胞凋亡。

        2.7Real time-PCR檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子β-Actin、IL-6和IL-8三種基因的熔解曲線峰為均一的單峰(如圖11);IL-6和IL-8在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)(2-△△Ct)如圖12所示,IL-6 mRNA在8 h上調(diào)(2.49±0.5)倍,P<0.05,IL-8 mRNA在24 h上調(diào)(6.82±1.69)倍,P<0.05。

        圖6 DENV-2感染的pHDMECs 4、8、12、24和48 h NS1基因的相對(duì)表達(dá)Fig.6 Related expression of NS1 gene in pHDMECs in 4,8,12,24 and 48 h by DENV-2 infectionNote: Compare with 4 h,*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

        圖7 免疫熒光法檢測(cè)DENV-2對(duì)pHDMECs的感染(×100)Fig.7 Immunofluorescence showed infection of pHDM-ECs and BHK cells(×100) Note: A.BHK cells was infected by DENV-2 as positive control;B.DENV-2 infected pHDMECs.

        圖8 FCM檢測(cè)DENV-2感染的pHDMECs中NS1部分序列蛋白Fig.8 Determination of protein NS1 of DENV-2 infected pHDMECs by FCMNote: A,B.Isotype control of BHK cells and pHDMECs;C,D.BHK cells and pHDMECs was infected by DENV-2.

        圖9 Transwell小室中pHDMECs被DENV-2感染后下室熒光值的動(dòng)態(tài)變化Fig.9 Dynamic fluorescence values in out-chamber of Transwell where was cultured DENV-2 infected pHDMECs

        圖10 DENV感染的pHDMECs 72 h的凋亡Fig.10 Apoptosis of pHDMECs with DENV-2 incubation in 72 hNote: Ratio of cell late apoptosis and necrosis was scattered in Q2;cell early apoptosis in Q3;A.Blank control;B.pHDMECs was infected by DENV-2.

        圖11 β-Actin,IL-6,IL-8 mRNA熔解曲線Fig.11 Melt curves of β-Actin,IL-6 and IL-8 mRNA Note: A.β-Actin;B.IL-6;C.IL-8.

        圖12 pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8mRNA的相對(duì)表達(dá)變化Fig.12 Relative expression of IL-6 and IL-8 mRNA of DENV-2 infected pHDMECs in various timesNote: Compare with control,***.P<0.001.

        圖13 pHDMECs被DENV-2感染后IL-6和IL-8的分泌Fig.13 Assay of IL-6 and IL-8 secretion by DENV-2 infected pHDMECsNote: Compare with control,***.P<0.001.

        表1相關(guān)基因的擴(kuò)增引物

        Tab.1Enhancement primer of related Genes

        GenePrimer(5'→3')Length(bp)Tmβ-ActinF:GCATGGGTCAGAAGGATTCCTR:TCGTCCCAGTTGGTGACGAT11260NS1F:AGAGCGTGAAAAGGTGGATGR:CTGTCTGCGTAGTTGATGCC14760IL-6F:GCATAAAGACATACTCCAAACCR:ACTTCTCCACAACCCTCTG16855IL-8F:TTCGGTCCAGTTGCCTTCTR:GGTGAGTGGCTGTCTGTGTG12060

        2.8雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)pHDMECs被DENV-2感染后細(xì)胞因子的分泌DENV-2感染pHDMECs在各時(shí)間點(diǎn)IL-6和IL-8蛋白水平如圖13所示,在8 h IL-6蛋白水平明顯高于對(duì)照組;IL-8在4~24 h DENV-2感染組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,而在48 h明顯增高。

        3討論

        DENV主要通過(guò)白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播,可引起致命的DHF/DSS,表現(xiàn)為微血管滲漏、伴有血小板下降、出血甚至休克等癥狀,其致病機(jī)制至今尚不完全清楚[1,7]。

        DENV感染過(guò)程中引起的VECs功能紊亂和通透性增加是DHF/DSS重要的發(fā)病機(jī)制[7],所以各種VECs成為研究DENV感染致病機(jī)制的細(xì)胞模型,但各種內(nèi)皮細(xì)胞株并不是完美的模型。ECV 304細(xì)胞已證實(shí)為膀胱癌細(xì)胞系而不是VECs[12]。研究表明,DENV感染后重癥患者微脈管系統(tǒng)通透性顯著增強(qiáng),常見(jiàn)胸腔積液、腹水等血漿滲漏癥狀和皮下、胃腸道等明顯出血傾向,而不是大血管內(nèi)皮細(xì)胞(如HUVECs)[13];目前也有用微血管細(xì)胞株HMEC-1研究DENV致病機(jī)制的報(bào)道,但HMEC-1是經(jīng)過(guò)攜帶猴病毒40A基因的pSVT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的穩(wěn)定細(xì)胞株,并非原代微血管細(xì)胞[14],因此,以上VECs模型并不能真實(shí)地反映機(jī)體各組織器官的VECs被DENV感染的情況。

        DENV是否能感染VECs及DENV是否在VECs內(nèi)有效增殖,是否能夠引起VECs通透性的改變?研究表明,DENV可通過(guò)β3整合素或含有硫酸肝素的蛋白多糖受體感染HUVECs[15]。本課題以DENV-2作用pHDMECs,病毒NS1部分序列基因相對(duì)表達(dá)顯著增加,具有時(shí)間相關(guān)性,但未能檢測(cè)到DENV-2 NS1蛋白,由此可知pHDMECs能夠被DENV-2感染。可能是由于DENV-2感染的pHDMECs分泌IFN-β而抑制了DENV-2相關(guān)蛋白合成[8],此結(jié)果與pHUVECs感染情況一致[11]。同時(shí)被DENV-2感染的pHDMECs通透性顯著增高,提示感染后的pHDMECs形態(tài)和功能可能發(fā)生了變化,這將對(duì)DENV感染引起的出血產(chǎn)生重要影響,同時(shí)也驗(yàn)證了DHF/DSS患者出現(xiàn)皮下出血癥狀的原因[7]。

        DENV-2引起pHDMECs通透性增加可能有以下兩種原因:DENV-2直接對(duì)pHDMECs產(chǎn)生的損傷作用。細(xì)胞凋亡是VECs損傷和通透性增加的重要因素,然而DENV感染VECs是否引起細(xì)胞凋亡仍是個(gè)爭(zhēng)論的問(wèn)題。臨床研究表明,DENV-2僅僅引起VECs短暫的通透性增加,并無(wú)血管內(nèi)皮的損傷[15];Qi等[11,16]在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DENV-2感染的pHUVECs沒(méi)有明顯細(xì)胞凋亡 。但是Long等[10]研究表明,DENV-2感染pHUVECs后通過(guò)外源性調(diào)亡受體Fas/FasL途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生。本次研究表明,以DENV-2感染pHDMECs未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡,其原因可能為上調(diào)的IFN-α誘導(dǎo)基因IFI6抑制了細(xì)胞凋亡[16]。因此,DENV-2引起pHDMECs通透性增加與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。VECs的損傷在DHF/DSS患者中并不具有普遍性,由此推斷細(xì)胞凋亡可能不是DENV致病機(jī)制的重要因素。但有報(bào)道稱,DENV-2 NS1部分序列蛋白通過(guò)TLR4途徑直接引起HUVECs通透性增加,但本次研究中未檢測(cè)到DENV-2 NS1部分序列蛋白,因此可排除其對(duì)pHDMECs通透性增加的直接作用[17]。

        DENV-2感染的pHDMECs發(fā)生功能紊亂,分泌相關(guān)細(xì)胞因子所致。研究表明,VECs被DENV感染后導(dǎo)致部分細(xì)胞因子上調(diào),這些因子可能也是DHF/DSS患者上調(diào)的細(xì)胞因子來(lái)源之一[4,5]。VECs可能作為非免疫細(xì)胞參與了DENV感染的免疫應(yīng)答過(guò)程。本次研究中,DENV-2感染的pHDMECs IL-6,IL-8分泌顯著增加,且與pHDMECs通透性增加的時(shí)間點(diǎn)有相關(guān)性。IL-6作用于HUVECs可增加細(xì)胞通透性,并與IL-6的濃度呈正相關(guān)[8]。DENV-2引起pHDMECs通透性的變化可能是IL-6調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白所致。Tina等[18]研究表明,IL-6通過(guò)PKC通路使ZO-1和細(xì)胞骨架蛋白actin發(fā)生重排增加VECs的通透性。此外,IL-6通過(guò)JUK、MEK及PI3K信號(hào)通路上調(diào)Claudin-2來(lái)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的緊密連接[19,20]。IL-8可能直接作用于pHDMECs使其通透性發(fā)生改變。研究表明,DENV-2感染HMEC-1細(xì)胞釋放的IL-8使細(xì)胞骨架發(fā)生重排使VECs的通透性增加[9]。IL-8也是CXC型趨化因子,可激活和趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞[21],從而間接地影響pHDMECs的結(jié)構(gòu)與功能。如DENV感染的VECs釋放IL-8趨化并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒并釋放彈性蛋白酶(Elastase),后者可損傷VECs和激活補(bǔ)體系統(tǒng)而使VECs的通透性發(fā)生改變[22]。據(jù)此推測(cè),IL-6、IL-8在DENV-2感染引起pHDMECs通透性增加過(guò)程發(fā)揮了重要的作用。

        研究與DENV感染致病機(jī)制密切相關(guān)的細(xì)胞因子并作為治療靶點(diǎn)對(duì)防治重癥DENV感染疾病具有重要意義。pHDMECs被DENV-2感染后,是否分泌其他引起細(xì)胞通透性增加的細(xì)胞因子仍需探索。盡管如此,也有研究表明促炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8能激活或趨化多種免疫細(xì)胞至感染部位,在急性感染期保護(hù)機(jī)體免受病原體的侵害[23]。由此推測(cè),在DENV感染過(guò)程中多數(shù)細(xì)胞因子既保護(hù)了機(jī)體也促進(jìn)疾病發(fā)展,可能因?yàn)楫a(chǎn)生的階段以及量上的差異而表現(xiàn)出相反的作用。這也為研究DENV引起VECs通透性增加的機(jī)制提供了新視角。

        參考文獻(xiàn):

        [1]John DV,Lin YS,Perng GC,etal.Biomarkers of severe dengue disease a review [J].J Biomed Sci,2015,22:83.

        [2]Bhatt S,Gething PW,Brady OJ,etal.The global distribution and burden of dengue [J].Nature,2013,496(7446):504-507.

        [3]Chen R,Han GZ.Dengue in china:comprehensive phylogenetic evaluation reveals evidence of endemicity and complex genetic diversity [J].Am J Trop Med Hyg,2016,94(1):198-202.

        [4]Huang X,Yue Y,Li D,etal.Antibody-dependent enhancement of dengue virus infection inhibits RLR-mediated type I IFN-independent signaling through upregulation of cellular autophagy [J].Sci Rep,2016,6:22303.

        [5]Nadine A,Dalrymple,Erich R,etal.Endothelial cells elicit immune-enhancing responses to dengue virus infection [J].J Virol,2012,86(12):6408-6415.

        [6]Huang YH,Lei HY,Liu HS,etal.Dengue virus infects human endothelial cells and induces IL-6 and IL-8 production [J].Am J Trop Med Hyg,2000,63(1-2):71-75.

        [7]Peter V,Kurt V,Sandra L.Endothelial dysfunction in dengue virus pathology [J].Rev Med Virol,2015,25(1):50-67.

        [8]Tseng CY,Chang JF,Wang JS,etal.Protective effects of N-acetyl cysteine against diesel exhaust particles induced intracellular ROS generates proinflammatory cytokines to mediate the vascular rermeability of capillary-like endothelial tubes [J].PLoS One,2015,10(7):e0131911.

        [9]Talavera D,Castillo AM,Dominguez MC,etal.IL8 release,tight junction and cytoskeleton dynamic reorganization conducive to permeability increase are induced by dengue virus infection of microvascular endothelial monolayers [J].J Gen Virol,2004,85:1801-1813.

        [10]Long X,Li Y,Huang J,etal.XAF1 contributes to dengue virus-induced apoptosis in vascular endothelial cells [J].FASEB J,2013,27(3):1062-1073.

        [11]崔麗麗,余芳芳,馬靜,等.水凝膠上培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞感染登革病毒Ⅱ型對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-29的表達(dá)影響[J] 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2015,35(1):7-13.

        [12]Yang J,Zou L,Hu Z,etal.Identification and characterization of a 43 kD actin protein involved in the DENV-2 binding and infection of ECV304 cells[J].Microbes Infect,2013,15(4):310-318.

        [13]Morens DM.Dengue fever and dengue hemorrhagic fever [J].Pediatr Infect Dis J,2009,28(7):635-636.

        [14]Ades EW,Candal FJ,Swerlick RA,etal.HMEC-1:establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line[J].J Invest Dermatol,1992,99(6):683-690.

        [15]任瑋,左麗,呂秉樂(lè),等.登革病毒Ⅱ型對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,31(7):592-596.

        [16]Qi YM,Li Y,Zhang YK,etal.IFI6 inhibits apoptosis via mitochondrial-dependent pathway in dengue virus 2 infected vascular endothelial cells [J].PLoS One,2015,10(8):e0132743.

        [17]Modhiran N,Watterson D,Muller DA,etal.Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity[J].Sci Transl Med,2015,7(304):304ra142.

        [18]Tina R,Desai M D,Nicholas J,etal.Interleukin-6 causes endothelial barrier dysfunction via the protein kinase C pathway [J].J Surg Res,2002,104:118-123.

        [19]Suzuki T,Yoshinaga N,Tanabe S.Interleukin-6 (IL-6) regulates claudin-2 expression and tight junction permeability in intestinal epithelium [J].J Biol Chem,2011,286(36):31263-31271.

        [20]Al-Sadi R,Ye D,Boivin M,etal.Interleukin-6 modulation of intestinal epithelialtight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene [J].PLoS ONE,2014,9(3):e85345.

        [21]Juffrie M,Van Der Meer GM,Hack CE,etal.Inflammatory mediators in dengue virus infection in children:interleukin-8 and its relationship to neutrophil degranulation [J].Infect Immun,2000,68(2):702-707.

        [22]Veszeli N,Csuka D,Zotter Z,etal.Neutrophil activation during attacks in patients with hereditary angioedema due to C1-inhibitor deficiency [J].Orphanet J Rare Dis,2015,10(1):156.

        [23]Jones SA,Horiuchi S,Topley N,etal.The soluble interleukin 6receptor:Mechanisms of production and implications in disease [J].Faseb J,2001,15(1):43-58.

        [收稿2016-04-06]

        (編輯許四平)

        doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.003

        作者簡(jiǎn)介:趙軍(1989年-),男,在讀碩士,主要從事抗病毒感染的分子免疫學(xué)研究,E-mail:zddjet@foxmail.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師:左麗(1955年-),女,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事抗病毒感染的分子免疫學(xué)方面研究,E-mail:zuoligymc@163.com。

        中圖分類(lèi)號(hào)R392.9

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

        文章編號(hào)1000-484X(2016)07-0945-07

        Primary mechanism of changing permeability in DENV-2 infected primary human dermal micro-vascular endothelial cells

        ZHAO Jun,ZUO Li,DAI Xue-Ting,PEI Hua,YUAN Jing,KONG Wei-Ying.

        Department of Immunology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China

        [Abstract]Objective:To reveal the primary mechanism of changing permeability in DENV-2 infected pHDMECs.Methods: pHDMECs was incubated by DENV-2 on the concentration of 103 TCID50,and the penetrability of the cell was detected by Transwell at 4,8,12,24,48 h,respectively.Then,the partial sequence of DENV-2 NS1 was analyzed by Real time-PCR,and NS1 protein was detected by immunofluorescence and flow cytometer (FCM).The apoptosis rate of pHDMECs was assayed by FCM.Finally,IL-6 and IL-8 secreted by pHDMECs were analyzed by Real time-PCR and double antibody sandwich ELISA.Results: The relative expression of NS1 gene was elevated but NS1 protein was not detected;the permeability of DENV-2 infected pHDMECs had dramatically increased both at 24,48 h,but the apoptosis rate has little changed even been influenced by DENV-2 at 72 h.However,the relative expression of IL-6/IL-8 mRNA was boosted at 8,24 h[(2.49±0.50) and (6.82±1.69) fold,respectively,P<0.05].In protein level,compared with control(869.6±50.70)pg/ml,IL-6 secreted by DENV-2 infected pHDMECs could reach by(1 248.8±86.9)pg/ml(P<0.05),and IL-8 was(1 331.0±86.3)pg/ml(P<0.05) while the control was (967.6±156.6)pg/ml.Conclusion: Indeed,pHDMECs can be infected by DENV-2;the increasing permeability of DENV-2 infected pHDMECs may not be caused by the pHDMECs′ apoptosis but the enhancing of pro-inflammatory cytokine IL-6 /IL-8.

        [Key words]Dengue virus;Primary human dermal micro-vascular endothelial cells;IL-6;IL-8;Permeability

        ①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(31260224;81560263)和貴州省教育廳“125”重大科技專項(xiàng)(黔教合重大專項(xiàng)字[2012]008號(hào))。

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