嚴(yán)　珺，王永杰，孟春陽，李　雷，趙嘉勛，郭貴君，彭川莉，尹　飛，郭　麗*

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春130033)

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鋅對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的影響

嚴(yán)珺1，王永杰1，孟春陽2，李雷1，趙嘉勛1，郭貴君1，彭川莉1，尹飛2，郭麗1*

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春130033)

摘要：目的探討鋅對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)增殖及向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。方法貼壁法體外分離培養(yǎng)BMSCs，MTT法檢測不同濃度的鋅處理BMSCs 24 h、48 h及72 h后增殖活性。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測不同濃度的鋅處理BMSCs Ki67的表達(dá)。BMSCs分空白對(duì)照組、缺鋅誘導(dǎo)組、正常誘導(dǎo)組、低濃度鋅處理組和高濃度鋅處理5組。除空白對(duì)照組外，其余4組在含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，維甲酸繼續(xù)培養(yǎng)14 d，誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞暴露在鋅濃度為200×10-7mol/L時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力均最強(qiáng)；免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示：缺鋅組Ki67陽性表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組、缺鋅組和高濃度鋅處理組(P<0.05)；缺鋅組、正常誘導(dǎo)組和低濃度鋅處理組GFAP和NSE陽性率顯著高于空白對(duì)照組和高濃度鋅處理組(P<0.05)，正常誘導(dǎo)組和低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率顯著高于缺鋅組(P<0.05)，低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著高于正常誘導(dǎo)組(P<0.05)。結(jié)論鋅在一定濃度范圍內(nèi)能夠提高BMSCs增殖能力及促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；鋅；增殖；分化

(ChinJLabDiagn,2016,20:1045)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類可以自我更新、具有強(qiáng)大增殖能力以及多向分化潛能的干細(xì)胞[1，2]。有研究證實(shí)，通過化學(xué)等誘導(dǎo)物在體內(nèi)或體外適宜條件下可以使BMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病以及神經(jīng)功能障礙帶來新的希望，引起越來越多的各界學(xué)者的關(guān)注[3，4]。但BMSCs在體外經(jīng)過幾次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞的增殖及分化潛能下降，因此人們一直尋找增加BMSCs增殖和分化功能的處理因素。鋅是細(xì)胞中各種酶的必需組成成分，在機(jī)體的生長發(fā)育中扮演重要角色。有研究證明，鋅不僅對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的存活有著重要影響，而且對(duì)其增殖、分化以及誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)元起關(guān)鍵作用[5，6]。但對(duì)于鋅在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中的作用研究卻較少。本研究對(duì)鋅對(duì)BMSCs的增殖和向神經(jīng)樣細(xì)胞分化影響作用進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1動(dòng)物和主要試劑一周齡健康SD大鼠，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)購自PeproTech公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體購自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離培養(yǎng)一周齡SD大鼠置于超凈工作臺(tái)中，脫頸處死，于75%酒精滅菌，無菌條件下將骨髓腔中的細(xì)胞沖入含DMEM-F12培養(yǎng)液的廣口瓶中，制成單細(xì)胞懸液，以1×106/mL細(xì)胞密度接種于75 mL培養(yǎng)瓶，于5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。3 d后換半液，7 d左右以1∶2傳代。

1.2.2Zn對(duì)BMSCs增殖的影響①M(fèi)TT法 將第三代BMSCs細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞、200 μl的密度接種于96孔培養(yǎng)板。次日分別換成不同濃度硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)(0、50×10-7、100×10-7、200×10-7、400×10-7、800×10-7、1 600×10-7、3 200×10-7)mol/L的培養(yǎng)液，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μl，孵育4 h，在490 nm波長的酶聯(lián)檢測儀上測量各孔吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞活力。②細(xì)胞增殖抗原Ki67的檢測待第三代BMSCs細(xì)胞長滿蓋玻片后分空白對(duì)照組、缺鋅組(每毫升血清中添加0.1 g Chelex-100螯合樹脂)、低濃度鋅處理組(200×10-7mol/L)、高濃度鋅處理組(1600×10-7mol/L)四組，培養(yǎng)3 d。預(yù)冷的95%乙醇固定20 min，干燥后-20℃保存用于免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測。

1.2.3BMSCs的分化待第三代BMSCs細(xì)胞長滿蓋玻片后分空白對(duì)照組、缺鋅組(Chelex-100螯合樹脂+誘導(dǎo)劑)、正常誘導(dǎo)組、低濃度鋅處理組(200×10-7mol/L Zn+誘導(dǎo)劑)、高濃度鋅處理組(1600×10-7mol/L Zn+誘導(dǎo)劑)五組(低、高鋅濃度由MTT篩選)。除空白對(duì)照組外，其他組在含有bFGF、EGF誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，維甲酸繼續(xù)誘導(dǎo)14 d。95%預(yù)冷的乙醇固定20 min，晾干、-20℃保存。

1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測GFAP、NSE蛋白以及Ki67蛋白的陽性表達(dá)取出細(xì)胞片，0.5%Triton X-100溶液孵育20 min，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育30 min，動(dòng)物非免疫血清封閉30 min，一抗孵育(Ki67、GFAP、NSE，1∶200)過夜，生物素標(biāo)記的第二抗體孵育30 min，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶30 min， DAB顯色，蘇木精染核，脫水、透明，封片，顯微鏡觀察。

2結(jié)果

2.1BMSCs的培養(yǎng)

細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶24 h后見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)多為圓形。48 h后貼壁細(xì)胞逐漸增加，形成大小不同的細(xì)胞集落。72 h后細(xì)胞逐漸增大，呈長梭形或多角形，換半液。7 d后傳代，傳代后細(xì)胞以梭形為主。

2.2Zn對(duì)BMSCs增殖的影響

2.2.1MTT結(jié)果MTT結(jié)果顯示，BMSCs在暴露于不同濃度Zn2+24 h、48 h和72 h的條件下，細(xì)胞在200×10-7mol/L濃度時(shí)，BMSCs活力達(dá)到最頂峰，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1)。結(jié)果表明在一定劑量范圍(0-200×10-7mol/L)內(nèi)，隨著Zn濃度增長，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，在Zn濃度為200×10-7mol/L時(shí)，活力最強(qiáng)。隨著鋅濃度進(jìn)一步增加(200×10-7mol/L-1600×10-7mol/L)，細(xì)胞活力下降；隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞活力下降。

2.2.2增殖抗原Ki67的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，缺鋅誘導(dǎo)組Ki67陽性表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組與缺鋅誘導(dǎo)組(P<0.05)，高濃度鋅處理組Ki67陽性表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組和低濃度鋅處理組(P<0.05)(見圖2)。

圖1　不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度鋅對(duì)BMSCs細(xì)胞活力增殖曲線

A.空白對(duì)照組400×；B.缺鋅組400×；C.低濃度鋅處理組400×；D.高濃度鋅處理組400×；E.aP<0.05，與空白對(duì)照組比較；bP<0.05，與缺鋅組比較；cP<0.05，與低濃度鋅處理組比較

圖2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測增殖抗原Ki67的表達(dá)

2.3誘導(dǎo)BMSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，不同組有不同程度GFAP和NSE的表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，缺鋅組、正常誘導(dǎo)組和低濃度鋅處理組GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)；同時(shí)，與缺鋅組比較，正常誘導(dǎo)組和低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)，與正常誘導(dǎo)組比較，低濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率均顯著升高(P<0.05)，高濃度鋅處理組的GFAP和NSE陽性率顯著低于缺鋅組、正常誘導(dǎo)組和低濃度鋅處理組(P<0.05)(見圖3)。

3討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于BMSCs不存在取材困難以及倫理之爭等諸多優(yōu)勢已經(jīng)作為組織工程及細(xì)胞和基因治療的種子細(xì)胞[7]。BMSCs在適宜誘導(dǎo)條件下，能夠定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病帶來新的希望。

aP<0.05，與空白對(duì)照組比較；bP<0.05，與缺鋅組比較；cP<0.05，與正常誘導(dǎo)組比較；dP<0.05，與低濃度鋅處理組比較

圖3誘導(dǎo)BMSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)

本研究對(duì)鋅在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中的作用進(jìn)行了探討，鋅作為生物體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞的生化過程中發(fā)揮不同的作用，包括生長、分裂以及酶系統(tǒng)的活動(dòng)中都體現(xiàn)著重要功能[8]。本實(shí)驗(yàn)采用不同處理組來研究鋅對(duì)BMSCs增殖活力的影響，MTT結(jié)果表明在達(dá)到閾值之前，隨著Zn濃度增加，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，鋅含量過高不利于細(xì)胞增殖，細(xì)胞活力下降。Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鋅對(duì)BMSCs增殖活力的影響，本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白Ki67的表達(dá)，缺鋅組Ki67陽性表達(dá)率顯著低于空白對(duì)照組，低濃度鋅處理組Ki67陽性表達(dá)率顯著高于空白對(duì)照組、缺鋅組和高濃度鋅處理組，這一結(jié)果與MTT結(jié)果相符合，說明適宜濃度的鋅能夠促進(jìn)BMSCs增殖，而鋅濃度增加到一定閾值，增殖能力反而下降甚至起到抑制作用。

以往研究表明BMSCs在體外條件下可以分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，已經(jīng)作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有前景的干細(xì)胞[9]。我們的研究中，與空白對(duì)照組比較，缺鋅誘導(dǎo)組與正常誘導(dǎo)組GFAP和NSE陽性表達(dá)率顯著升高，提示BMSCs具備向神經(jīng)樣細(xì)胞分化潛能。在正常誘導(dǎo)組與低濃度鋅處理組陽性率顯著高于缺鋅誘導(dǎo)組，而且，低濃度鋅處理組顯著高于正常誘導(dǎo)組，提示在適宜鋅濃度處理下能夠促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。我們的研究結(jié)果中，GFAP和NSE在高濃度鋅處理組陽性表達(dá)率低于缺鋅組、正常誘導(dǎo)組以及低濃度鋅處理組，表明鋅濃度過高對(duì)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化起到抑制作用。鋅是人體必須的微量元素之一，不能通過簡單擴(kuò)散跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，需要特殊的膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)助下才能進(jìn)入細(xì)胞。有研究表明，器官或細(xì)胞中鋅的動(dòng)態(tài)平衡是由ZnT和ZIP膜蛋白介導(dǎo)，ZnT能夠調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鋅離子外流或使細(xì)胞內(nèi)鋅區(qū)室化，來減少細(xì)胞內(nèi)鋅含量。ZIP則相反，作為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)鋅的攝入或調(diào)節(jié)細(xì)胞器釋放鋅來增加胞漿內(nèi)的鋅含量[10，11]。但在我們的研究中，對(duì)于ZnT和ZIP如何調(diào)節(jié)鋅含量的研究機(jī)制還不夠明確，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，一定濃度的鋅能夠提高BMSCs增殖活性，促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，但鋅如何發(fā)揮調(diào)控BMSCs的分化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81573067)；吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20130413023GH)；吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃項(xiàng)目

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1045-04

中圖分類號(hào)：Q813

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2016-04-15)

Effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells

YANJun1,WANGYong-jie1,MENGChun-yang2,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells.MethodsBMSCs were isolated by adherence and cultured in vitro.MTT method was used to detect the proliferation activity of BMSCs treated with different concentration zinc in 24 h,48 h,72 h.The Ki67 expression in BMSCs administrated by different concentration zinc were detected by immunocytochemical method.The third generation BMSCs were divided into five groups,including blank control group,zinc deficiency group,normal induction group,low concentration zinc treatment group and high concentration zinc treatment.Apart from the blank control group,BMSCs in the other four groups were cultured for 5 days in differentiation induction culture medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF),then were induced to differentiate into neural-like cells in the culture medium with retinoic acid for 14 days.Cell growth morphology was observed by inverted microscope.The expression of glial fiber acidic protein (GFAP) and neuron specific enzyme (NSE) were detected by immunocytochemistry.ResultsMTT assay showed cell viability of BMSCs exposed to 200×10-7mol/L zinc were highest at different time points;immunocytochemistry results showed that Ki67-positive cells percentage of BMSCs in zinc deficiency group was lower than that in blank control group (P<0.05),Ki67-positive cells percentage of BMSCs in low zinc treatment group was significantly higher than those in the blank control group,zinc deficiency group and high zinc treatment group (P<0.05);GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in zinc deficiency group,the normal induced group and low zinc treatment group were significantly higher than those in blank control group and high zinc treatment group (P<0.05),and GFAP-positive and NSE- positive percentages of BMSCs in normal induced group and the low zinc treatment group were significantly higher than that in zinc deficiency group (P<0.05),GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in low zinc treatment group were significantly higher than those in normal induced group (P<0.05).ConclusionZinc can enhance the proliferation of BMSCs and promote the differentiation of BMSCs into neural-like cells in a certain concentration range.

Key words:Bone marrow mesenchymal stem cells;Zinc;proliferation;differentiation

(2014Z046)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015533));大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(2014A72312)