萬(wàn)佳　張碩　李阿茜　曲靖　李川　李德新　梁米芳

?

·論著·

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白IFITM1/2/3對(duì)SFTS病毒感染的影響

萬(wàn)佳張碩李阿茜曲靖李川李德新梁米芳

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

【摘要】目的在細(xì)胞水平初步探索IFITM1/2/3對(duì)SFTS病毒感染的影響。方法分別構(gòu)建IFITM1/2/3真核表達(dá)載體并驗(yàn)證其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)IFITM l/2/3的Vero和THP-1細(xì)胞中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)SFTS病毒的復(fù)制情況。結(jié)果間接免疫熒光及Western Blot檢測(cè)顯示重組IFITM l/2/3表達(dá)質(zhì)粒在Vero細(xì)胞及THP-1細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，IFITM1/2/3對(duì)SFTS病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染均具有顯著的抑制作用，尤其是在細(xì)胞感染早期，過(guò)表達(dá)的IFITM1/2/3對(duì)低劑量SFTS病毒感染的抑制作用更為明顯。結(jié)論IFITM l/2/3可在細(xì)胞水平抑制病毒復(fù)制。

【主題詞】IFITM1/2/3；SFTS病毒；抗病毒作用

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane proteins, IFITMs) 是一組由干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes, ISGs)編碼表達(dá)的抗病毒蛋白[1]。在干擾素(Interferon, IFN)刺激下, IFITMs的表達(dá)水平顯著提高。作為細(xì)胞內(nèi)參與天然免疫的限制因子，IFITM家族中序列高度同源的IFITM l、IFITM2和IFITM3表現(xiàn)出廣譜的抗病毒活性[2-5]，對(duì)立夫特谷熱病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)、拉克羅斯病毒(La Crosse virus, LCV)及漢灘病毒(Hantaan virus)等布尼亞病毒均有明顯的抑制作用[6，7]。

SFTS病毒(Sever fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV) 主要經(jīng)蜱傳播，可引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征，病死率較高，無(wú)特異性治療手段及有效的疫苗[8]。IFN誘導(dǎo)的抗病毒蛋白IFITM l、IFITM2和IFITM3主要通過(guò)影響病毒入侵過(guò)程發(fā)揮作用[2-7,9]。研究這些IFITMs蛋白對(duì)SFTS病毒感染與復(fù)制的影響，或可加強(qiáng)對(duì)SFTS病毒侵入與感染細(xì)胞的機(jī)制的了解。目前國(guó)內(nèi)外尚未有IFITM l、IFITM2和IFITM3對(duì)SFTS病毒相關(guān)作用的研究報(bào)道。

1材料與方法

1.1材料HEK293T細(xì)胞、THP-1細(xì)胞、VERO細(xì)胞均購(gòu)自ATCC；SFTS病毒HB29毒株及pCAGEN載體由本室保存；DH5α感受態(tài)菌株購(gòu)自全式金公司。胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、DMEM及1640培養(yǎng)基、青鏈霉素(Penicillin Streptomycin, PS)、Ampicillin購(gòu)自德國(guó)Gibco公司；IFN-α、PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、鼠源β-Actin抗體購(gòu)自Sigma公司；兔源IFITM1/2/3多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光溶液購(gòu)自PerkinElmer公司；RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；內(nèi)切酶XhoI、NotI購(gòu)自美國(guó)NEB公司。T4 DNA連接酶、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Ambion公司；熒光定量PCR相關(guān)引物和探針交(上海)生工公司定制。

1.2IFITM1/2/3表達(dá)載體的構(gòu)建用含有10%FBS、1%PS的DMEM培養(yǎng)基將IFN-α稀釋至mg/ml，在5%CO2、37 ℃條件下刺激293T細(xì)胞24 h后收集并提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR分別擴(kuò)增IFITM1/2/3相應(yīng)基因，所用引物如下：

IFITM1-F: ccgCTCGAGATGCACAAGGAGGAACATGAGG

IFITM1-R: tgtgGCGGCCGCCTAGTAACCCCGTTTTTCCTG

IFITM2-F: ccgCTCGAGATGAACCACATTGTGCAAACC

IFITM2-R: tgtgGCGGCCGCCTATCGCTGGGCCTGGACGACC

IFITM3-F: ccgCTCGAGATGAATCACACTGTCCAAACC

IFITM3-R: tgtgGCGGCCGCCTATCCATAGGCCTGGAAGATC

1.3重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞將重組質(zhì)粒pCAGEN-IFITM1、pCAGEN-IFITM2、pCAGEN-IFITM3分別轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞和THP-1細(xì)胞(操作步驟參考 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent說(shuō)明書)。其中THP-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前，用含有2%FBS、1%PS的1640培養(yǎng)基將PMA稀釋至mg/ml，在5%CO2、37 ℃條件下誘導(dǎo)分化48 h[10]。同時(shí)設(shè)空載體pCAGEN及空細(xì)胞對(duì)照。

1.4間接免疫熒光(Immunofluorescence, IFA)檢測(cè)IFITM1/2/3的表達(dá)利用過(guò)表達(dá)IFITM l/2/3的Vero細(xì)胞及THP-1細(xì)胞制作抗原片，同時(shí)設(shè)空載體pCAGEN對(duì)照。加兔源IFITM1/2/3多克隆抗體(一抗，PBS 1∶100稀釋)37 ℃孵育30 min。蒸餾水輕柔吹洗，加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(二抗，伊文斯藍(lán)1∶200稀釋)37 ℃孵育30 min。蒸餾水輕柔吹洗，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)IFITM1/2/3的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞蛋白變性，上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉2 h，加兔源IFITM1/2/3多克隆抗體(一抗，5%脫脂奶1∶1000稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育。置于搖床用PBST洗30 min，加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(二抗，5%脫脂奶1∶5000稀釋)孵育1 h。置于搖床用PBST洗30 min，化學(xué)發(fā)光ECL法顯跡檢測(cè)IFITM1/2/3表達(dá)。同時(shí)設(shè)空載體pCAGEN及空細(xì)胞對(duì)照，以β-Actin作為內(nèi)參照。

1.6IFITM1/2/3對(duì)SFTS病毒感染的影響IFITM1/2/3表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞及THP-1細(xì)胞48 h后，將SFTS病毒HB29毒株按0.1 MOI和1.0 MOI分別感染上述細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(pCAGEN)及空白細(xì)胞對(duì)照。分別在感染病毒后12 h、24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA(操作步驟參考 RNeasy Mini Kit說(shuō)明書)，利用real-time RT-PCR方法測(cè)定不同細(xì)胞、不同染毒量在不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量。以Human GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)Dunnett-t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差別，通過(guò)SNK-q檢驗(yàn)比較各實(shí)驗(yàn)組之間的差別。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上統(tǒng)計(jì)分析利用IBM SPSS statistics 20.0軟件完成。

2結(jié)果

圖1　間接免疫熒光檢測(cè)IFITM1/2/3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.1　IFA test for intracellular expression of IFITM1/2/3

圖2　Western Blot檢測(cè)IFITM1/2/3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.2　Western blot detection for intracellular expression of IFITM1/2/3

2.1IFITM1/2/3的表達(dá)與鑒定IFN-α刺激293T細(xì)胞24 h后收集并提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳可見三段400 bp左右的條帶，大小與預(yù)期相符；重組載體經(jīng)雙酶切鑒定顯示片段已成功構(gòu)建入表達(dá)載體pCAGEN；測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件與GenBank中IFITM1/2/3基因序列比對(duì)，無(wú)突變。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞和THP-1細(xì)胞48 h后，分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行IFA及Western Bolt檢測(cè)。

IFA結(jié)果顯示Vero和THP-1細(xì)胞均可見特異性綠色熒光(圖1)。說(shuō)明IFITM1/2/3在Vero和THP-1細(xì)胞中能夠有效表達(dá)，且廣泛分布在胞膜和胞漿內(nèi)。據(jù)此結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料[2-7，9]，可推斷IFITM1/2/3不僅在細(xì)胞膜上發(fā)揮各種功能，還可能參與細(xì)胞內(nèi)的各種活動(dòng)。

Western Bolt檢測(cè)結(jié)果可見三條16kDa左右的條帶(圖2)，大小與預(yù)期相符，說(shuō)明IFITM1/2/3在Vero和THP-1細(xì)胞中能夠有效表達(dá)，且具有良好的抗體結(jié)合活性；空載體pCAGEN及空細(xì)胞對(duì)照未見目的條帶表達(dá)。

2.2IFITM1/2/3抑制SFTS病毒的感染利用real-time RT-PCR測(cè)定不同細(xì)胞、不同染毒量在不同時(shí)間點(diǎn)的Ct值，并轉(zhuǎn)換為TCID50值，分析IFITM1/2/3對(duì)SFTS病毒感染的抑制作用(圖3)。Vero細(xì)胞各孔內(nèi)參Human-GAPDHCt值的均值為19.72±0.35，變異系數(shù)CV=1.77%；THP-1細(xì)胞各孔內(nèi)參Human-GAPDHCt值的均值為17.64±0.41，變異系數(shù)CV=2.32%；未見過(guò)大或過(guò)小的離群值，說(shuō)明PCR數(shù)據(jù)未受到各孔內(nèi)核酸濃度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。Vero和THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IFITM1、IFITM2和IFITM3的實(shí)驗(yàn)組TCID50值低于對(duì)照組(Dunnett-t檢驗(yàn)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，實(shí)驗(yàn)組各組之間TCID50值沒有明顯差異(SNK-q檢驗(yàn)，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，即IFITM1、IFITM2和IFITM3對(duì)SFTS病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染及復(fù)制均有抑制作用，且作用大小沒有顯著區(qū)別。同時(shí)，分析數(shù)據(jù)可知：SFTSV感染細(xì)胞12 h～24 h時(shí)，0.1 MOI染毒劑量組內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異顯著高于1.0 MOI染毒劑量組內(nèi)的差異，但這種差異隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而減小。這說(shuō)明在細(xì)胞感染早期，過(guò)表達(dá)的IFITM1/2/3對(duì)低劑量SFTS病毒感染有更為明顯的抑制作用。

注：1、2、3分別表示轉(zhuǎn)染IFITM1/2/3并染毒的細(xì)胞；4表示轉(zhuǎn)染pCAGEN載體并染毒的細(xì)胞；5表示只染毒的細(xì)胞圖3　IFITM1/2/3抑制SFTS病毒感染Note：1、2 and 3 represent cells transfected with IFITM1/2/3 and infected by SFTS virus; 4 represents cells transfected with pCAGEN vector and infected by SFTS virus; 5 represents cells infected by SFTS virusFig.3　IFITM1/2/3 inhibit SFTS virus infection

3討論

作為人體天然免疫機(jī)制的重要組成部分，IFN對(duì)入侵人體的病毒并不直接發(fā)揮其抗病毒作用，而是通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)多種抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP)間接達(dá)到抗病毒效果。編碼這些抗病毒蛋白的基因稱干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISG)，而IFITM蛋白家族就是ISG的一組表達(dá)產(chǎn)物[13]。人體內(nèi)的IFITM蛋白家族成員有IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5。其中IFITM1、IFITM2和IFITM3與人體免疫相關(guān)，具有廣譜的抗病毒活性，在體內(nèi)多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)。

IFITM1/2/3的抗病毒活性具有一定選擇性，且它們對(duì)同一種病毒的抑制作用亦有差別。對(duì)于形態(tài)相似，且包膜上均有相似糖蛋白的布尼亞病毒，IFITM1/2/3的抑制作用亦是如此：沒有IFITMs能夠抑制克里米亞一剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)，僅IFITM 2和IFITM3能夠分別抑制RVFV[8]。作為我國(guó)新發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒，SFTS病毒是否受到IFITMs的抑制作用尚未明晰。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆并表達(dá)IFITM1/2/3，在細(xì)胞水平初步探索其對(duì)SFTS病毒感染的抑制作用。結(jié)果顯示，IFITM1、IFITM2和IFITM3對(duì)SFTS病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染均有明顯抑制作用，且作用大小沒有顯著區(qū)別。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)提示，在細(xì)胞感染早期，過(guò)表達(dá)的IFITM1/2/3對(duì)低劑量SFTS病毒感染有更為明顯的抑制作用。這可能與IFITM1/2/3主要在細(xì)胞感染的早期階段阻礙SFTS病毒與細(xì)胞受體結(jié)合或抑制SFTS病毒早期膜融合有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

總之，本研究驗(yàn)證了IFITM1/2/3在細(xì)胞水平對(duì)SFTS病毒感染的抑制作用，為進(jìn)一步探尋IFITM蛋白家族抑制病毒的機(jī)理、SFTS病毒感染細(xì)胞的機(jī)制及后續(xù)抗病毒藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

[1]Duggal NK, Emerman M. Evolutionary conflicts between viruses and restriction factors shape immunity[J]. Nat Rev lmmunol, 2012, 12: 687-695. doi: 10.1038/nri3295. Epub 2012 Sep 14.

[2]Diamond MS, Farzan M. The broad-spectrum antiviral functions of IFIT and IFITM proteins[J]. Nat Rev Immunol, 2012, 13(1): 46-57. doi: 10.1038/nri3344. Epub 2012 Dec 14.

[3]Huang I C, Bailey CC, Weyer JL et al. Distinct patterns of IFITM-mediated restriction of filoviruses，SARS coronavirus, and influenza A virus[J]. PLoS Pathog, 2011, 7(1): e1001258. doi: 10.1371/journal.ppat.1001258.

[4]Wilkins C, Woodward J, Lau DT, et al. IFITM1 is a tight junction protein that inhibits hepatitis C virus entry[J]. Hepatology, 2013, 57:46l-469. doi: 10.1002/hep.26066. Epub 2012 Dec 12.

[5]Lu J, Pan Q, Rong L et al. The IFITM proteins inhibit HIV-1 infection[J]. J Virol, 201l, 85(5): 2126-2137. doi: 10.1128/JVI.01531-10. Epub 2010 Dec 22.

[6]Abraham L Brass, Huang IC, Benita Y, et al. The IFITM proteins mediate cellular resistance to influenza A Hl N1 virus, West Nile virus, and dengue virus[J]. Cell, 2009, 139(7): 1243-1254. doi: 10.1016/j.cell.2009.12.017.

[7]Mudhasani R, Tran JP, Retterer C, et al. IFITM2 and IFITM3 but not IFITM1 restrict Rift Valley fever virus[J]. J Virol, 2013,87(15): 845l-8464. doi: 10.1128/JVI.03382-12.

[8]李德新，發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25(2)：81-84. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2011.02.001.

[9]Li K, Markosyan RM, Zheng YM, et al. IFITM proteins restrict viral membrane hemifusion[J]. PLoS Pathog, 2013, 9: el003124. doi: 10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

[10]Metz P, Dazert E, Ruggieri A, et al. Identification of type I and type II interferon-induced effectors controlling hepatitis C virus replication[J]. Hepatology, 2012, 56(6), 2082-2093. doi: 10.1002/hep.25908. Epub 2012 Oct 14.

通信作者：梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.006

(收稿日期：2016-03-18)

Impact of interferon induced transmembrane proteins IFITM1/2/3 on SFTS virus infection

WanJia,ZhangShuo,LiAqian,QuJing,LiChuan,LiDexin，LiangMifang

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China.Correspondingauthor:LiangMifang,Email:mifangl@vip.sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of IFITM1/2/3 on SFTS virus infection. Methods IFITM1/2/3 expression vectors were constructed by inserting corresponding genes into pCAGEN vector respectively and the expression of IFITM1/2/3 were detected by immunofluorescence assay (IFA) and Western Blot analysis. SFTS virus load at different time post infection on Vero and THP-1 cells that overexpressing IFITM1/2/3 were determined by quantitative real-time RT- PCR. ResultsHigh intracellular antibody binding activities of IFITM l/2/3 were observed by IFA and Western Blot assay. The results of real-time RT-PCR indicated that IFITM1/2/3 could significantly inhibit the infection of SFTS virus on the above two cell lines. Furthermore, at early stage of virus infection, the inhibition effects were more obvious for low dose infection. ConclusionsIFITM1/2/3 could effectively inhibit intracellular SFTS virus infection.

【Key words】IFITM1/2/3; SFTS virus; antiviral effect