陳小芳，婁永江*，王錦富

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.寧波南聯(lián)冷凍食品有限公司，浙江寧波315211）

乳酸菌發(fā)酵法制備軟殼脊尾白蝦技術(shù)

陳小芳1，婁永江1*，王錦富2

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.寧波南聯(lián)冷凍食品有限公司，浙江寧波315211）

利用乳酸菌發(fā)酵作用制備軟殼脊尾白蝦，研究了溫度、時間、接種量等影響發(fā)酵的因素并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：乳酸菌發(fā)酵制備軟殼脊尾白蝦最佳條件為：時間24 h，接種量為108cfu/mL，糖添加質(zhì)量分數(shù)20%，溫度25℃，此時的脊尾白蝦蝦殼穿刺峰值為169.4 g，蝦肉pH為6.5，蝦風(fēng)味保存良好。

乳酸菌發(fā)酵；脊尾白蝦；軟化；響應(yīng)面優(yōu)化

脊尾白蝦（Palaemon carincauda Holthuis）肉質(zhì)細膩，深受消費者的喜愛。然而由于蝦殼質(zhì)地堅硬，極大地影響食用，往往只能丟棄，但殼中含有豐富的鈣和甲殼素［1-2］，資源浪費極為嚴重。對蝦殼進行軟化是新思路，在不影響蝦風(fēng)味的前提下將蝦殼軟化，不僅能夠在食用蝦時沒有堅硬的蝦殼，同時蝦殼中含有的營養(yǎng)成分也易于吸收［3-4］，可以有效地避免蝦殼資源的浪費。

目前蝦殼軟化方法主要為化學(xué)法和酶法，化學(xué)法大多采用檸檬酸這一較為常用的食用酸，然而檸檬酸與蝦殼中鈣產(chǎn)生的檸檬酸鈣不溶于水，無法吸收利用；酶法通過酶降解達到軟化蝦殼的目的，其軟化效果不佳。國外已有利用乳酸菌發(fā)酵對蝦加工廢棄物的研究，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸會將蝦頭、蝦殼中不溶性鈣鹽轉(zhuǎn)化為可溶性乳酸鈣為人體補充鈣質(zhì)，同時發(fā)酵可以消除一定的腥臭味［5］，發(fā)酵條件也較為溫和。

作者以浙江舟山海塘養(yǎng)殖脊尾白蝦為研究對象，通過對其蝦殼乳酸菌軟化技術(shù)的研究，為實現(xiàn)軟殼脊尾白蝦制品提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1脊尾白蝦浙江舟山海塘養(yǎng)殖品，條長6～8 cm。活體運輸至實驗室，于90～95℃含1%食鹽、0.3%檸檬酸熱水中漂燙2 min，迅速用流動水冷卻至常溫，包裝后于-28℃（溫差范圍±2℃）下速凍至中心溫度為-18℃，移至-18℃冷庫冷藏備用。

1.1.2植物乳桿菌寧波大學(xué)水產(chǎn)品加工與貯藏實驗室保藏菌種。

1.1.3試劑MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉為分析純。

1.1.4主要儀器食品物性測試儀（TA-XT Plus）：Stable micro Systems（UK）；酸度計PHSJ-3F：上海雷磁；Sartorius分析天平：賽多利斯天平有限公司；冷凍離心機：湖南湘儀。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)酵菌液的制備將植物乳桿菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)1～2次，使菌種活化，4℃、3 000 r/min離心10 min，傾去上清液，加入預(yù)先滅菌冷卻至4℃的0.85%的生理鹽水，混勻后制成濃度約為108cfu/mL的乳酸菌液，4℃下冷藏備用。

1.2.2蝦體穿刺實驗使用TA-XT Plus食品物性測試儀進行穿刺實驗［6-7］。將處理后的脊尾白蝦瀝水5 min，平整放置，穿刺位置在蝦體第二節(jié)蝦殼處［8］。物性儀參數(shù)設(shè)定為：P/2N探頭，測試前后移動速度為5 mm，測試時的移動速度為1 mm，測試距離為4 mm。

1.2.3蝦肉pH測定按照GB/T 5009.45-2003方法測定［9］。

1.3實驗設(shè)計

1.3.1單因素試驗分別以時間 （0～60 h）、溫度（20～40℃）、接種量（105～109cfu/mL）、糖質(zhì)量分數(shù)（0%～24%）、固液比（1∶1～1∶3）、初始pH（5.5～7.5）為考察因素與水平，測定蝦殼穿刺峰值和蝦肉pH值，分析各因素對脊尾白蝦的影響。

1.3.2優(yōu)化試驗設(shè)計采用軟件 Design-expert 8.0.6（State-Ease，Minneapolis，MN，USA）中的Box-Behnken模式進行響應(yīng)曲面試驗設(shè)計［10-11］，以穿刺峰值和蝦肉pH為響應(yīng)值，實驗因子和水平見表1。

表1　　響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1　Analysis of factors and levels of response surface

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進行統(tǒng)計處理，用SAS 9.2進行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD法進行差異顯著性檢驗。用Design Expert 8.0.6建立響應(yīng)曲面回歸方程，響應(yīng)曲面實驗結(jié)果利用最小二乘法進行二次多項式回歸統(tǒng)計分析，其基本模型如下：

式中，β0，βi，βii和βij為回歸系數(shù)；Xi和Xj為不同的自變量；Y為響應(yīng)變量。

2結(jié)果與討論

2.1影響蝦殼軟化因素的研究

蝦殼中的鈣成分流失降低了其脆度，使得蝦殼的韌性增強，軟化效果越好，其韌性越強，使得探頭穿刺過蝦殼所需的力越大，穿刺峰值越大，軟化效果和穿刺試驗的穿刺峰值之間存在正相關(guān)的關(guān)系［8］。

圖1～6是各單因素與脊尾白蝦蝦殼軟化效果的關(guān)系?？梢钥闯觯瑫r間、接種量、蔗糖添加量、發(fā)酵溫度對于蝦殼的軟化效果具有顯著的影響 （P＜0.05），而初始pH和固液比在一定范圍內(nèi)對于其影響較小，這與劉斯雅等［12］采用植物乳桿菌發(fā)酵蝦頭、蝦殼從而回收蛋白質(zhì)和甲殼素的研究結(jié)果接近。這固然與菌種本身的生長繁殖、代謝產(chǎn)物的積累有密不可分的關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵時間越長、溫度越高、初始接種體積分數(shù)越大，軟化效果越好。

但過多的乳酸會導(dǎo)致蝦肉的pH過低，對蝦肉的品質(zhì)破壞嚴重。從圖1～6中穿刺峰值和蝦肉pH整體變化考慮，蔗糖添加量與發(fā)酵時間、接種體積分數(shù)、溫度等四個因素影響顯著，有待進一步優(yōu)化。

圖1　　軟化時間與脊尾白蝦軟化效果的關(guān)系Fig.1　Softening effect of time on Palaemon carincauda Holthuis

圖2　　接種量與脊尾白蝦軟化效果的關(guān)系Fig.2　Softening effect of inoculation amount on Palaemon carincauda Holthuis

圖3　　蔗糖添加質(zhì)量分數(shù)與脊尾白蝦軟化效果的關(guān)系Fig.3　Softening effect of sucrose amount on Palaemon carincauda Holthuis

圖4　　固液比與脊尾白蝦軟化效果的關(guān)系Fig.4　Softening effect of the ratio of solid to liquid on Palaemon carincauda Holthuis

圖5　　初始pH與脊尾白蝦軟化效果的關(guān)系Fig.5　Softening effect of initial pH on shrimp Palaemon carincauda Holthuis

圖6　溫度與脊尾白蝦蝦殼軟化效果的關(guān)系Fig.6　Softening effect of temperature on Palaemon carincauda Holthuis

2.2響應(yīng)面法技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化

以穿刺峰值（Y1）和蝦肉pH值（Y2）為響應(yīng)值，按照優(yōu)化試驗設(shè)計進行試驗，結(jié)果見表2。通過Design-Expert8.0.6軟件對響應(yīng)值與各因素編碼值進行回歸擬合分析，得到回歸方程為：

Y1=166.04+15.45X1+12.48X2+6.19X31+6.4X4-4.00X1X2-4.96X1X3+1.07X1X4-2.32X2X3+6.76X2X4-1.07X3X4-16.18X12-24.20X22-12.33X32-19.98X42；

Y2=6.68-0.83X1-0.50X2-0.022X3-0.57X4-0.28 X1X2+0.000X1X3-0.27X1X4-0.16X2X3-0.32X2X4-0.26X3X4+0.021X12-0.049X22+0.035X32+0.11X42。

響應(yīng)值所建立的回歸方程模型具有高度的顯著性 （P1、P2均小于0.000 1），失擬項不顯著 （P1= 0.025 6，P2=0.131 5均大于0.05），模型決定系數(shù)R12=0.984 3、R22=0.989 2，模型校正決定系數(shù)AdjR12=0.968 6、AdjR22=0.978 5，模型信噪比（Adeq. Precision）分別為27.040、35.440大于臨界值4。說明兩個模型的擬合程度較好，試驗誤差小，因此可以采用該模型來分析和預(yù)測蝦殼軟化及蝦肉pH的變化。

表2　　響應(yīng)曲面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2　Response surface experimental design and results

對于脊尾白蝦穿刺峰值（Y1）模型，回歸方程的方差分析結(jié)果表明，因素的一次項和二次項的影響均非常顯著（P＜0.000 1），4因素對脊尾白蝦穿刺峰值影響的排序為時間（X1）＞接種量（X2）＞溫度（X4）＞糖添加量（X3）。在交互項中，X1X2、X1X3、X2X4也具有顯著的影響（P＜0.05），見圖7～9。其原因在于，利用植物乳桿菌發(fā)酵法軟化蝦殼過程中，不僅能分泌大量乳酸分解蝦殼碳酸鈣，使脊尾白蝦穿刺峰值上升，同時也分泌出胞外蛋白酶系，導(dǎo)致蝦肉降解糜爛，從而在穿刺測定時形成緩沖填，造成穿刺峰值下降。

圖7　　時間與接種量對穿刺峰值的交互影響等高線圖Fig.7　Contour plots of interaction effect between time and amount of inoculation on puncture peak

圖8　　時間與糖添加質(zhì)量分數(shù)對穿刺峰值交互影響等高線圖Fig.8　Contour plots of interactive effects between time and amount of sugar on puncture peak

圖9　　接種量與溫度對穿刺峰值交互影響等高線圖Fig.9　Contour　plotsofinteractive　effectsbetween inoculation　quantity　and　temperature　on puncture peak

對于脊尾白蝦蝦肉pH（Y2）模型，回歸方程的方差分析結(jié)果表明，方程中僅時間（X1）、接種量（X2）、溫度（X4）三個因素的線性和溫度（X4）的平方項的影響顯著 （P＜0.000 1），4個因素對蝦肉pH值影響的排序為時間（X1）＞接種量（X2）＞溫度（X4）＞糖添加質(zhì)量分數(shù)（X3）。

在交互項中，X1X2、X1X4、X2X4、X3X4也具有顯著影響（P＜0.05），見圖10-13。這與植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸的含量有關(guān)，大量乳酸除去作用于蝦殼碳酸鈣部分，滲入蝦肉中改變蝦肉的pH值。

圖10　　時間與接種量對蝦肉pH的交互影響等高線圖Fig.10　Contour plots of interaction effect between time and amount of inoculation on shrimp pH

圖11　　時間與溫度對蝦肉pH的交互影響等高線圖Fig.11　Contour plots of interaction effect between time and temperature on shrimp pH

圖12　　接種量與溫度對蝦肉pH的交互影響等高線圖Fig.12　Contourplotsofinteraction　effectbetween inoculation amount and temperature on shrimp pH

圖13　糖添加質(zhì)量分數(shù)與溫度對蝦肉pH的交互影響等高線圖Fig.13　Contour plots of interactive effects between amount of sugar and temperature on shrimp pH

理想的軟殼脊尾白蝦制備技術(shù)應(yīng)在具有較高的軟化程度，并且盡可能對蝦肉的品質(zhì)不造成過大的影響，同時還要考慮能耗及后續(xù)工藝的影響。因此在結(jié)合響應(yīng)面模型分析的基礎(chǔ)上，以響應(yīng)曲面二次回歸模型中穿刺峰值的最大值，蝦肉pH 6.5為響應(yīng)值，以時間、接種量、糖添加質(zhì)量分數(shù)和溫度為實驗因素，利用軟件Design-Expert 8.0.6對回歸模型優(yōu)化，得出脊尾白蝦乳酸菌發(fā)酵最佳軟化工藝為：時間25.78 h，接種量為108.11cfu/mL，糖添加質(zhì)量分數(shù)19.21%，溫度24.94℃，此時的蝦殼穿刺峰值為169.425，蝦肉pH 6.499。為考慮實際生產(chǎn)工藝與生產(chǎn)的連續(xù)性，將時間調(diào)整為24 h，接種量108.0cfu/g，糖添加質(zhì)量分數(shù)20%，溫度25℃，并以此工藝進行脊尾白蝦發(fā)酵試驗。在該條件下，所得的蝦殼穿刺峰值為166.148 g，蝦肉pH 6.64，與理論值相比相對誤差＜5%。這說明二次多項式數(shù)學(xué)模型進行等高線疊加所得到的優(yōu)化技術(shù)參數(shù)符合設(shè)計目標，實驗設(shè)計和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性?？梢姴捎庙憫?yīng)面法可實現(xiàn)多目標同步優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵制備軟殼脊尾白對蝦，得到具有實際應(yīng)用價值的技術(shù)參數(shù)。

3結(jié)語

作者研究了乳酸菌發(fā)酵法制備軟殼脊尾白蝦，蝦殼軟化率（128.8%）明顯高于崔宏博等［8］報道的采用乙酸與木瓜蛋白酶結(jié)合法的軟化率 （60.5%），同時乳酸菌發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乙酸、乳酸等與蝦殼中鈣結(jié)合產(chǎn)生乳酸鈣，滲透進入蝦體可以提高鈣的生物利用率［13］。另外乳酸菌能有效抑制其他微生物的活動，降低蝦肌肉總揮發(fā)性鹽基氮的生成量［14］。

采用乳酸菌發(fā)酵法制備軟殼脊尾白蝦，與對照組相比蝦殼的穿刺峰值明顯增大，而同時蝦肉的風(fēng)味未有明顯變化，可以預(yù)見，隨著對該研究的深入，乳酸菌發(fā)酵在水產(chǎn)品加工中將是一個重要的加工手段。

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Study of Lactic Acid Fermentation Technology for Soft-Shell Palaemon carincauda Holthuis

CHEN Xiaofang1，LOU Yongjiang1*，WANG Jinfu2
（1.School of Marine Sciences of Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Ningbo Nanlian Frozen Food Co.，Ltd，Ningbo 315211，China）

By using the lactic acid fermentation technology to prepare the soft-shell Palaemon carincauda Holthuis，the factors including temperature，time，inoculum and other factors were studied.The fermentation parameters were optimized by using response surface method.The best conditions of preparation soft-shell PalaemoncarincaudaHolthuis for lactic acid bacteria fermentation were obtained as follows：fermentation time 24 h，inoculum 108cfu/mL，the amount of sugar added 20%，and temperature 25℃，under which the puncture peak of soft-shell Palaemon carincauda Holthuis reached to 169.4 g，and the pH of shrimp closed to 6.5 with well-preserved flavor.

lactic acidfermentation，PalaemoncarincaudaHolthuis，soften，responsesurface optimization

TS 254

A

1673—1689（2016）05—0510—07

2014-09-28

國家海洋公益性行業(yè)科研專項項目（013-E00180135100）。
*

婁永江（1965—），男，浙江嵊州人，農(nóng)學(xué)碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事水產(chǎn)品加工方面的研究。E-mail：louyongjiang@nbu.edu.cn