謝　磊，李　由，劉新民，陳善廣，王克柱，陳怡西，王　瓊

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州　646000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193；3.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100094)

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小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立與紅景天抗疲勞作用的驗(yàn)證

謝磊1,2，李由3，劉新民2，陳善廣3，王克柱2，陳怡西1，王瓊1

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州646000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；3.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100094)

目的建立小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，挖掘評(píng)價(jià)小鼠游泳耐力的新指標(biāo)，并用此系統(tǒng)驗(yàn)證紅景天對(duì)小鼠耐力的影響。方法將計(jì)算機(jī)視頻采集技術(shù)和圖像分析技術(shù)應(yīng)用于小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)獲取小鼠游泳信息，提取包括力竭時(shí)間、首次下沉?xí)r間、下沉總時(shí)間、首次連續(xù)下沉?xí)r間在內(nèi)的多個(gè)耐力評(píng)價(jià)指標(biāo)，客觀精確地在線分析小鼠耐力數(shù)據(jù)；利用正常小鼠、紅景天給藥小鼠對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、可靠性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果計(jì)算機(jī)記錄數(shù)據(jù)與人工記錄數(shù)據(jù)具有高度相關(guān)性，r>0.95,系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。首次連續(xù)下沉?xí)r間與力竭時(shí)間的相關(guān)性系數(shù)r=0.974，其他新指標(biāo)與力竭時(shí)間的相關(guān)性系數(shù)r<0.9。紅景天給藥組較空白組，首次下沉?xí)r間和首次連續(xù)下沉?xí)r間顯著性增加。結(jié)論該系統(tǒng)用于評(píng)價(jià)小鼠游泳耐力的指標(biāo)客觀、精確、靈敏，實(shí)現(xiàn)了視頻采集、信息整合、數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)輸出一體化，尋找到了與力竭時(shí)間高度相關(guān)的新指標(biāo)-首次連續(xù)下沉?xí)r間。全套系統(tǒng)自動(dòng)化、智能化程度高，為抗疲勞藥物的篩選提供了一套可靠的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

小鼠；力竭游泳；計(jì)算機(jī)；紅景天

隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力的增加，各類急性疲勞、慢性疲勞綜合癥已成為嚴(yán)重影響人類工作、生活的社會(huì)性問題。近年來有關(guān)西藥抗疲勞藥物研究報(bào)道較少且副作用大[1]，因此，從中藥中尋找有效的抗疲勞成分已成為抗疲勞藥物研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外用于抗疲勞藥物研究的行為學(xué)方法主要包括負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等[2-4]，其中最為經(jīng)典的是負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[5]，該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)動(dòng)物心理應(yīng)激小、生理傷害少，從而被廣泛使用。

然而現(xiàn)階段大量的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)方法多為人工記錄，自動(dòng)化程度低、結(jié)果可靠性差，測(cè)試中獲得的信息量少、檢測(cè)環(huán)境不穩(wěn)定(水溫需人工調(diào)節(jié))、動(dòng)物之間相互干擾(多只動(dòng)物同時(shí)檢測(cè)，出現(xiàn)身體碰撞、相互蹬踏等不可避免的干擾因素)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差[6]。研究自動(dòng)化程度高、更為科學(xué)客觀的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，挖掘能更好評(píng)價(jià)小鼠游泳耐力的新指標(biāo)是現(xiàn)在科研工作者急需解決的問題。因此，本研究結(jié)合計(jì)算機(jī)視頻采集技術(shù)和圖像分析技術(shù)，旨在構(gòu)建一套小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)并評(píng)價(jià)疲勞相關(guān)的行為學(xué)指標(biāo)，為抗疲勞藥物的研究提供科學(xué)、客觀的實(shí)驗(yàn)方法。

1　材料和方法

1.1儀器

計(jì)算機(jī)主機(jī)(Pentium 3.2 GHz，內(nèi)存2.00 GB，硬盤 500 G)、攝像機(jī)(VS-250DH，分辨率752*582，)、鏡頭(AFT-VS0410ZM)，圖像采集卡(維視MV-E8800，總線數(shù)據(jù)傳輸速率250MByte/S，10bit AD轉(zhuǎn)換芯片)、顯示器(Dell 17寸顯示器，分辨率1280*1024)、負(fù)重游泳測(cè)試缸及附屬配件、恒溫裝置(享庭X-218加熱棒，功率1000w)、負(fù)重游泳測(cè)試桶。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(京)2012-0001】。給藥期間喂養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)室溫度恒定保持25℃，12h照明/12h黑暗環(huán)境(8：00 am開燈，20:00 pm 關(guān)燈)，動(dòng)物自由飲食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在協(xié)和藥用植物研究所動(dòng)物房進(jìn)行【SYXK(京)2013-0023】，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2.2材料

央科藏域紅景天膠囊：購(gòu)自西藏央科生物科技有限公司，生產(chǎn)日期：20140410，生產(chǎn)批號(hào)：140401

羧甲基纖維素鈉300～800 mPa·s：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

鉛皮：漁具店購(gòu)買。

1.3小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立

1.3.1硬件的研制

硬件包括測(cè)試缸，及測(cè)試缸內(nèi)的測(cè)試桶(2個(gè))、加熱裝置、LED燈和測(cè)試缸外的主支架、相機(jī)支架、亞格力透光板、攝像機(jī)(2個(gè))、LED背景燈控制器、視頻采集卡和計(jì)算機(jī)。采用全開放式缸體設(shè)計(jì)，單一測(cè)試缸尺寸750×350×400 mm (長(zhǎng)×寬×高)的組合式長(zhǎng)方體超白玻璃缸，內(nèi)含兩個(gè)平行放置的有機(jī)玻璃桶。實(shí)驗(yàn)桶尺寸為250×300 mm (直徑×高)，右側(cè)壁板上安置加熱裝置一套。缸外頂部和前部安置有攝像裝置，攝像裝置分別通過各自相機(jī)支架固定于主支架的頂部和前部。缸外底部和后部有與攝像裝置相對(duì)應(yīng)的紅色LED背景燈，LED背景燈與缸體之間間隔一層亞格力透光板，LED背景燈外側(cè)有主支架，主支架對(duì)測(cè)試缸及其他結(jié)構(gòu)起支撐作用。硬件結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1　小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Diagram of swimming endurance system in mice

1.3.2軟件的研制

軟件系統(tǒng)采用MIcrosoft Visual C++ 6.0語(yǔ)言開發(fā)環(huán)境，運(yùn)行于XP操作系統(tǒng)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)參數(shù)、實(shí)驗(yàn)操控、數(shù)據(jù)輸出4大功能模塊。設(shè)定包括力竭模式、下沉次數(shù)模式和下沉總時(shí)間模式等3種不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。軟件可提取的耐力指?biāo)包括：1)力竭時(shí)間(exhaustive time, ET)，動(dòng)物從開始檢測(cè)至全部軀干浸入水下超過7 s計(jì)算機(jī)所記錄的游泳時(shí)間；2)首次下沉?xí)r間(first sink time, FST)，動(dòng)物從開始檢測(cè)至首次全部軀干浸入水下計(jì)算機(jī)所記錄的游泳時(shí)間；3)下沉總時(shí)間(total sink time, TST)，動(dòng)物從開始檢測(cè)至力竭期間或指定時(shí)間點(diǎn)下沉?xí)r間的總和；4)下沉次數(shù)(sink frequency, SF)，動(dòng)物從開始檢測(cè)至力竭期間或指定時(shí)間點(diǎn)下沉次數(shù)的總和；5)首次連續(xù)下沉?xí)r間(continuous sink time, CST)：動(dòng)物從開始檢測(cè)至7 s內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)2次或以上的下沉行為計(jì)算機(jī)所記錄的游泳時(shí)間。軟件界面圖見圖2。

圖2　小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件界面圖Fig.2　software interface of swimming endurance system in mice

1.4系統(tǒng)驗(yàn)證

1.4.1指標(biāo)可靠性驗(yàn)證

1.4.2小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的應(yīng)用

2　結(jié)果

2.1指標(biāo)相關(guān)性驗(yàn)證

結(jié)果顯示，ET、FST、TST、SF、CST計(jì)算機(jī)記錄值與人工記錄值均高度相關(guān)，除TST的人機(jī)相關(guān)系數(shù)r=0.96，其余4個(gè)指標(biāo)的人機(jī)相關(guān)系數(shù)均>0.99,也進(jìn)一步驗(yàn)證了下沉閾值(=0.5 s)的可靠性(表1)。

2.2新指標(biāo)與經(jīng)典指標(biāo)(ET)相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，TST與ET間相關(guān)性最低(r=0.043)，CST與ET間的相關(guān)性最高(r=0.974)，SF與ET間相關(guān)性較低(r=0.16)，F(xiàn)ST與ET間相關(guān)性較高(r=0.771)。分段后各時(shí)刻得到的下沉次數(shù)、下沉總時(shí)間分別與力竭時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性分析所得到的相關(guān)性系數(shù)均較力竭時(shí)刻的下沉次數(shù)、下沉總時(shí)間的相關(guān)性系數(shù)高，且所取時(shí)刻越大，相關(guān)性越高。提示下沉次數(shù)和下沉總時(shí)間兩個(gè)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析時(shí)應(yīng)在固定游泳時(shí)間下進(jìn)行分析。結(jié)果如表2、表3、表4。

方法(Methods)力竭時(shí)間(Exhaustivetime,ET)(s)首次下沉?xí)r間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(shù)(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時(shí)間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續(xù)下沉?xí)r間(Continuoussinktime,CST)(s)人工記錄(Manualrecord)490.1±199.8317.6±169.412.1±6.833.7±14.6426.7±212.6計(jì)算機(jī)記錄(Computerrecord)490.6±200.0317.0±170.012.4±7.234.4±14.7426.7±212.5相關(guān)性系數(shù)(Pearsonvalue)>0.99>0.99>0.99=0.96>0.99

新指標(biāo)(Newindexes)首次下沉?xí)r間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(shù)(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時(shí)間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續(xù)下沉?xí)r間(Continuoussinktime,CST)(s)新指標(biāo)值(ValueofNewindexes)317.6±169.412.1±6.833.7±14.6426.7±212.6力竭時(shí)間(Exhaustivetime,ET)(s)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關(guān)性系數(shù)(Pearsonvalue)0.7710.160.0430.974

表3小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)分時(shí)段下沉次數(shù)(次)與力竭時(shí)間(s)相關(guān)性分析(x±s,n=20)

分段下沉次數(shù)(Paragraphofsinkfrequency)150s下沉次數(shù)(Sinkfrequencyof150s)200s下沉次數(shù)(Sinkfrequencyof200s)250s下沉次數(shù)(Sinkfrequencyof250s)分段值(ValueoftheParagraphs)0.6±1.571.0±2.431.95±3.36力竭時(shí)間(Exhaustivetime,ET)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關(guān)性系數(shù)(Pearsonvalue)0.420.4420.596

分段下沉總時(shí)間(Paragraphoftotalsinktime)150s下沉總時(shí)間(Totalsinktimeof150s)200s下沉總時(shí)間(Totalsinktimeof200s)250s下沉總時(shí)間(Totalsinktimeof250s)分段值(ValueoftheParagraphs)1.06±2.972.34±7.44.03±8.89力竭時(shí)間(Exhaustivetime,ET)490.1±199.8490.1±199.8490.1±199.8相關(guān)性系數(shù)(Pearsonvalue)0.4110.3930.525

2.3紅景天對(duì)小鼠耐力的研究

結(jié)果顯示，紅景天能明顯增加ICR小鼠游泳耐力，ICR雄性小鼠經(jīng)14 d灌胃后，體重與空白組比較無(wú)顯著性差異，表現(xiàn)出首次下沉?xí)r間、首次連續(xù)下沉?xí)r間兩項(xiàng)指標(biāo)顯著性(P<0.05)增加，力竭時(shí)間也有很大增加(P=0.057)。

時(shí)間Date(d)空白組(Controlgroup)紅景天組(Integripetalrhodiolaherbgroup)126.58±1.5228.22±1.51429.54±1.2229.35±1.34730.20±1.4530.35±1.511031.18±1.2931.22±1.651431.45±1.2831.80±1.65

指標(biāo)(Indexes)力竭時(shí)間(Exhaustivetime,ET)(s)首次下沉?xí)r間(Firstsinktime,FST)(s)下沉次數(shù)(Sinkfrequency,SF)(次)下沉總時(shí)間(Totalsinktime,TST)(s)首次連續(xù)下沉?xí)r間(Continuoussinktime,CST)(s)空白對(duì)照組(Controlgroup)717.9±277.4439.9±190.220.1±17.751.9±33.7612.3±238.1紅景天組(Integripetalrhodiolaherbgroup)1179.4±601.3798.0±310.135.6±32.570.1±66.1984.5±455.9兩樣本t檢驗(yàn)值(ValuesofIndependent-SamplesTtests)0.0570.0060.2020.4470.034

3　討論

力竭游泳實(shí)驗(yàn)是臨床前實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)小動(dòng)物耐力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法[11]。王艷杰等[12]采用透光材質(zhì)將動(dòng)物分區(qū)實(shí)驗(yàn)，解決了動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中相互干擾的問題，但仍采用人工記錄數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)方法；張衛(wèi)華等[13]研制的動(dòng)物游泳實(shí)驗(yàn)視頻觀察儀器，解決了力竭實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的圖像失真，動(dòng)物位置偏好等問題，可獲得漂浮時(shí)間、游泳時(shí)間、力竭時(shí)間三個(gè)指標(biāo)；莊成樂等[14]研制的大小鼠力竭游泳裝置采用在大小鼠口鼻尖放置傳感器來判定動(dòng)物下沉行為，獲得動(dòng)物下沉總時(shí)間10 s的時(shí)刻。本課題采用同一軟件系統(tǒng)下，同時(shí)捕獲4只動(dòng)物在不同游泳桶內(nèi)的二維活動(dòng)，既避免了動(dòng)物的相互干擾，又更準(zhǔn)確提取了動(dòng)物下沉行為信息，測(cè)試樣本量也增加四倍。該系統(tǒng)設(shè)計(jì)的“小鼠力竭游泳實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)軟件”在現(xiàn)有指標(biāo)下，增加了首次下沉?xí)r間、下沉次數(shù)、下沉總時(shí)間、首次連續(xù)下沉?xí)r間，還可提取分時(shí)段的下沉次數(shù)及分時(shí)段的下沉總時(shí)間。經(jīng)過數(shù)百次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些指標(biāo)穩(wěn)定可靠，與經(jīng)典的力竭時(shí)間指標(biāo)有很好的相關(guān)性。

研究表明，力竭時(shí)間是經(jīng)典的負(fù)重游泳耐力評(píng)價(jià)指標(biāo)，但動(dòng)物力竭后生理及心理應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，與動(dòng)物倫理及福利相違背[15]。龔夢(mèng)娟等[5]研制出一套小鼠游泳計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制與圖像分析處理系統(tǒng)，首次提出了首次下沉?xí)r間的概念。因此，本課題致力于挖掘與力竭時(shí)間高度相關(guān)的耐力評(píng)價(jià)新指標(biāo)，以多角度、小應(yīng)激、低死亡、高精度為目的評(píng)價(jià)小鼠游泳耐力強(qiáng)弱。結(jié)果顯示，首次連續(xù)下沉?xí)r間與力竭時(shí)間相關(guān)性最高，且出現(xiàn)時(shí)間更早，提示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少或者負(fù)重游泳測(cè)試后需進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定等的實(shí)驗(yàn)，可用首次連續(xù)下沉?xí)r間代替力竭時(shí)間來對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，劉靜波等人研究指出，影響負(fù)重游泳的最大因素為游泳水溫[16]，利用本系統(tǒng)的恒溫裝置可將水溫恒定在25±1℃，大大減少了實(shí)驗(yàn)的變量，保證了實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定。經(jīng)前期研究證明，體重對(duì)負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)影響較大，相對(duì)較重的體重在進(jìn)行力竭游泳測(cè)試時(shí)，各指標(biāo)的數(shù)據(jù)分布更集中，標(biāo)準(zhǔn)差更小。因此，推薦力竭游泳實(shí)驗(yàn)測(cè)試時(shí)盡量選用大周齡小鼠(w>7)，但購(gòu)入動(dòng)物不能超過4周齡，以免動(dòng)物發(fā)生同籠廝打行為。

《四部醫(yī)典》曾著紅景天，其性平、味澀、善潤(rùn)肺、能補(bǔ)腎、理氣養(yǎng)血。主治周身乏力、胸悶、惡心、體虛等癥。耿欣等[17]報(bào)道，紅景天具有顯著的抗疲勞、抗輻射功能，韓雪嬌，郭娜等[18]進(jìn)一步證實(shí)了紅景天中紅景天苷的抗疲勞作用。本課題利用紅景天的抗疲勞作用，再次驗(yàn)證了小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性。

本研究采用更完整的硬件設(shè)計(jì)，建立的小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，不僅有效避免了動(dòng)物間的相互干擾，還能準(zhǔn)確判斷動(dòng)物的下沉相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)溫度自動(dòng)控制，且檢測(cè)樣本量增加。開發(fā)的小鼠游泳耐力實(shí)驗(yàn)軟件系統(tǒng)，不僅穩(wěn)定可靠，還提取了與經(jīng)典指標(biāo)相關(guān)性高的新指標(biāo)。全套系統(tǒng)自動(dòng)化、智能化程度高，為抗疲勞藥物的篩選提供了一套可靠的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

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Establishment of the swimming endurance system in mice and the verification of the anti-fatigue effect in hongjingtian

XIE Lei1,2, LI You3, LIU Xin-min2, CHEN Shan-guang3,WANG Ke-zhu2, CHEN Yi-xi1, WANG Qiong1

(1.Sichuan Medical University, Luzhou 646000, China; 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;3.National Key Laboratory of Human Factors Engineering, China Astronaut Research and Training Center, Beijing 100094, China)

ObjectiveTo establish a swimming endurance system, excavating new indexes evaluating the swim capacity in mice and detecting the effects of HONGJINGTIAN (HJT) capsule on the swimming capacity in mice. Methods Combining video capture technology with image analysis technology into the Exhaustive swimming test, this system would automatically collect and objectively analyze the data when the swimming behavior perform synchronously in mice. A series of indexes would be calculated, such as Exhaustive time, First sink time, Total sink time, Sink frequency, Continuous sink time. Furthermore, the classical anti-fatigue herb named HJT will use to detect the stability and reliability of this swimming endurance system. Results The data showed high correlation between the computer and manual record (r>0.95), indicating high stability and reliability of the swimming endurance system. The continuous sink time (CST) have been proved out high correlation with Exhaustive time(ET) (r=0.974), while the correlation of others indexes less than 0.9. The mice treated with HJT by intragastric administration had showed significantly increase in the First sink time (FST) and the Continuous sink time (CST) compared with the control group. ConclusionsThe results showed that the system could assess swimming capacity objectively, precisely and sensitively in mice. In addition, this system realized integrating video capture, data analysis and data output together automatically. Besides, a new index-CST was found to be high correlation with ET. This system turn out to be high automatically and intelligently, and provide a reliable system to screen the potential anti-fatigue drugs.

Mice; Exhaustive swimming; Computer; Hongjingtian

人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(HF2012-K-01,HF2012-K-06)；國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09J12201)；四川省科技廳-瀘州市人民政府-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合科研資金項(xiàng)目(14JC01323-LH50)。

謝磊(1990-)，男，碩士生，研究方向：中藥神經(jīng)精神藥理，E-mail:296303836@qq.com。

王瓊，女，博士生導(dǎo)師，E-mail:wqimplad@126.com；劉新民，男，博士生導(dǎo)師，E-mail:liuxinmin@hotmail.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0071-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.011

2016-02-24