陳亞萍，張　彬，劉桂艷，林文彬，王　敏，孫桂波，孫曉波

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京　100081；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193；3. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱　150076)

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楊梅苷對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

陳亞萍1，張彬2，劉桂艷1，林文彬3，王敏2，孫桂波2，孫曉波2

(1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；3. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076)

目的研究楊梅苷對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法60只SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、陽性給藥組(維拉帕米100 μg/L)和楊梅苷低中高劑量組(2.5, 5, 10 mg/L)，每組10只。釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，停灌30 min，再灌45 min，造成心肌缺血再灌注損傷模型。記錄楊梅苷對(duì)心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響，測定冠脈流出液中心肌三酶LDH、CK、AST的水平，心肌組織中抗氧化酶SOD、CAT的活性及脂質(zhì)過氧化物MDA的含量。HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化。Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果楊梅苷低中高劑量組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)顯著改善，冠脈流出液中LDH、CK、AST的釋放減少，心肌組織中SOD、CAT的活性增加且MDA的產(chǎn)生減少，不同程度地減輕缺血再灌注造成的心肌損傷。Western blot結(jié)果表明楊梅苷能上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，同時(shí)抑制ERK的磷酸化。 結(jié)論楊梅苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可以改善心肌收縮功能、增強(qiáng)抗氧化能力、抑制細(xì)胞凋亡等，其機(jī)制可能是通過抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路緩解缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。

楊梅苷；心肌缺血再灌注；心臟血流動(dòng)力學(xué)；心肌三酶；細(xì)胞凋亡

缺血性心臟病(ischemic heart diseases, IHDs)是臨床上最常見的心血管疾病，其發(fā)病率和死亡率正逐年上升。傳統(tǒng)治療方法一般采用藥物溶栓、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)等手段恢復(fù)心肌血液灌注[1]。但缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞恢復(fù)血液供應(yīng)后損傷反而加重，并轉(zhuǎn)化為不可逆性，這種損傷被稱為缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion, I/R)[2]。I/R損傷造成了心臟血流動(dòng)力學(xué)改變、心肌酶釋放和心肌組織超微結(jié)構(gòu)病變等影響，是導(dǎo)致心肌損害的重要因素。研究表明細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬等諸多因素均可能為缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制[3-4]。

楊梅苷(五羥基黃酮-3-鼠李糖，myricitrin)為天然多酚羥基黃酮苷類化合物，大量存在于楊梅的果實(shí)、樹皮、樹葉及其他多種天然植物中。文獻(xiàn)報(bào)道楊梅苷具有抗氧化、清除氧自由基、擴(kuò)張血管、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌等多種功效，可改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的各種疾病如局部缺血和老年癡呆等[5-7]。本課題組研究表明表?xiàng)蠲奋諏?duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制做了初步研究[8-9]。但是，楊梅苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用目前尚不清楚。

本研究釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型, 觀察楊梅苷對(duì)缺血再灌注損傷心臟的血流動(dòng)力學(xué)、心肌三酶、抗氧化酶等相關(guān)指標(biāo)的影響，HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討楊梅苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為開發(fā)新的有效的治療缺血性心臟病的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重200～220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司【SCXK(京)2012-0001】。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房內(nèi)【SYXK (京) 2013-0023】(溫度22～25℃，濕度50%～70%，晝夜12 h交替)，自由飲水及攝食。

1.2主要試劑和儀器

楊梅苷為淡黃色粉末，能溶于水，純度98%，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)室提供；鹽酸維拉帕米注射液購于上海禾豐制藥有限公司；肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；一抗β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和ERK、p-ERK均購于美國Santa Cruz公司；NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaHCO3、Glucose、EDTA-Na、濃HCl等均由北京化學(xué)試劑公司提供。其他試劑均為分析純。

K-H液配制：用電子天平精密稱取 NaCl 20.67 g，NaHCO36.27 g, KCl 1.05 g，KH2PO40.48 g，Glucose 5.99 g，MgSO4·7H2O 0.87 g，CaCl20.85 g充分溶解于1 L蒸餾水，用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH=7.40，通過真空抽濾除去雜質(zhì)。

美國Radnoti 離體灌流系統(tǒng)；成都泰盟BL-420/820四道生理記錄儀；天津奧特賽恩斯AP-01P型真空泵；梅特勒pH 計(jì)；DY89-Π型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)；MQX200型酶標(biāo)儀；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；PYY-7C型電泳儀；Chemi DOCTM型凝膠成像系統(tǒng)。

1.3分組與給藥

雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、陽性給藥組(Verapamil 100 μg/L)和楊梅苷低中高劑量組(Myricitrin 2.5, 5, 10 mg/L)，每組10只。

1.4 Langendorff離體心臟灌流技術(shù)檢測血流動(dòng)力學(xué)[10-11]

將SD大鼠用20%烏拉坦腹腔麻醉后，舌下靜脈給予肝素(25 mg/kg)。迅速開胸，切斷主動(dòng)脈，取出心臟置于K-H營養(yǎng)液的玻璃器皿中，使心臟迅速停搏。分離主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管并結(jié)扎固定于灌流裝置中的心臟套管上，釆用Langendorff法逆灌含氧K-H液，切開左心耳，將帶有測壓導(dǎo)管的球囊插入左心室，測壓導(dǎo)管另一端連接多道生理記錄儀，向球囊內(nèi)緩緩注入適量蒸餾水。全過程采用K-H液灌注，并連續(xù)通入體積分?jǐn)?shù)95% O2和5% CO2的混合氣體，灌流液溫度維持在37 ℃，灌流液流速恒定為7 mL/min。

正常對(duì)照組：待心臟功能處于穩(wěn)定狀態(tài)15 min后，恒定流速灌流90 min。模型組：待心臟功能處于穩(wěn)定狀態(tài)15 min后，恒定流速繼續(xù)灌流15 min，然后停灌30 min，再灌45 min。陽性給藥組：待心臟功能處于穩(wěn)定狀態(tài)15 min后，改用100 μg/L鹽酸維拉帕米注射液恒定流速繼續(xù)灌流15 min，然后停灌30 min，再灌45 min。楊梅苷低中高劑量組：待心臟功能處于穩(wěn)定狀態(tài)15 min后，恒定流速改用低中高(2.5, 5, 10 mg/L)濃度的楊梅苷繼續(xù)灌流15 min，然后停灌30 min，再灌45 min。分別記錄各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即左室發(fā)展壓(left ventricular develop pressure, LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(maximal positive velocity of left ventricular pressure, +dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(maximal negative velocity of left ventricular pressure, -dp/dtmax)、心率(heart rate, HR)。

1.5測定冠脈流出液中LDH、CK及AST的活性

收集再灌注45 min時(shí)的灌流液凍存于-80℃待測。按試劑盒說明書操作，測定灌流液中LDH、CK及AST的活性。

1.6測定心肌組織勻漿中LDH、CK、AST的活性，SOD、CAT的活性，MDA的含量

取出心臟，冰水浴研磨，制備10%心肌組織勻漿。按試劑盒說明書操作，測定心肌組織勻漿中LDH、CK、AST的活性， SOD、CAT的活性，MDA的含量。

1.7HE染色觀察心肌組織病理情況

灌注完畢，將心臟迅速放入4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水，浸蠟包埋，切片與貼片，脫蠟染色，脫水透明，封固，觀察心肌組織病理情況。

1.8Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

灌注完畢，低溫下將心臟組織剪碎，加入RIPA蛋白裂解液(含蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，快速勻漿、裂解、離心，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入loading buffer煮沸5 min，使蛋白充分變性。取等量樣本上樣于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳完畢后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉3 h。分別加入相應(yīng)一抗(β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、ERK、p-ERK)，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。再用TBST洗滌3次，加入增強(qiáng)型ECL顯色液避光孵育5 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次，用Gel-Pro 灰度分析軟件計(jì)算各組蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，各組蛋白水平以對(duì)照的百分比表示。

1.9統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

2.1楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

平衡時(shí)，各組間的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均無顯著性差異。停灌30 min，再灌45 min后，與正常對(duì)照組比較，模型組HR、LVDP、± dp/dtmax均明顯降低(P< 0.05)。與模型組比較，陽性給藥組和楊梅苷給藥組HR、LVDP、± dp/dtmax均明顯改善。且楊梅苷低中高劑量組對(duì)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，高劑量效果最好(圖1)。

注：A. 心率HR；B. 左室發(fā)展壓LVDP；C. 左室內(nèi)壓最大上升速率+ dp/dtmax；D. 左室內(nèi)壓最大下降速率-dp/dtmax。圖1　楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響 ± s, n=10 )Note: A. heart rate (HR); B. left ventricular develop pressure (LVDP); C. maximal positive velocity of left ventricular pressure (+ dp/dtmax); D. maximal negative velocity of left ventricular pressure (-dp/dtmax).Fig.1　Effect of myricitrin on myocardial hemodynamic parameters in isolated rat hearts ± s, n=10 )

2.2楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟組織勻漿和冠脈流出液中LDH、CK及AST活性的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組心肌組織勻漿中LDH、CK及AST活性明顯降低(P< 0.01)，灌流液中LDH、CK及AST活性明顯升高(P< 0.01)，說明缺血再灌注引起心肌組織受損，心肌三酶漏出量增加。與模型組相比，楊梅苷給藥組心肌組織勻漿內(nèi)LDH、CK及AST活性增高(P< 0.05)，而灌流液中LDH、CK及AST活性明顯降低(P< 0.05)，并呈一定量效關(guān)系，提示楊梅苷可能通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞膜穩(wěn)定性，減少心肌三酶的漏出量，發(fā)揮心肌保護(hù)作用(圖2)。

注：A. 心肌組織中心肌酶水平(A1. LDH(U/gprot)；A2. CK(U/mgprot)；A3. AST(U/gprot))；B. 冠脈流出液中心肌三酶水平(A1. LDH(U/L)；B2. CK(U/mL)；B3. AST(U/L))。與正常組相比，##P < 0.01；與模型組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2　楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟組織勻漿和冠脈流出液中心肌酶水平的影響 ± s, n =10 )Note: A. The levels of cardiac enzymes in myocardial tissue (A1. LDH (U/gprot); A2. CK (U/mgprot); A3. AST (U/gprot)). B. The levels of cardiac enzymes release in perfusate (B1. LDH (U/L); B2. CK (U/mL); B3. AST (U/L)). ##P < 0.01, vs. the control group; *P < 0.05, **P < 0.01, vs. the model group.Fig.2　Effect of myricitrin on the levels of cardiac enzymes in myocardial tissue and perfusate after I/R ± s, n=10 )

2.3楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟組織勻漿SOD、CAT活力及MDA含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中SOD、CAT活性明顯降低(P< 0.05)，而MDA含量明顯增加(P< 0.05)。與模型組比較，楊梅苷給藥組大鼠心肌組織中SOD、CAT活性明顯升高，而 MDA 含量明顯減少，并呈一定量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)(圖3)。

注：A. SOD(U/mgprot)；B. CAT(U/mgprot)；C. MDA(nmol/mgprot)。與正常組相比，##P < 0.01；與模型組相比，*P < 0.05,**P < 0.01。圖3　楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟SOD、CAT活力及MDA含量的影響Note: A. SOD (U/mgprot); B. CAT (U/mgprot); C. MDA (nmol/mgprot). ##P < 0.01, vs. the control group; *P < 0.05, **P < 0.01, vs. the model group.Fig.3　Effect of myricitrin on the activities of SOD, CAT and the content of MDA in myocardial tissue after

2.4楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟組織病理學(xué)變化的影響

心肌缺血再灌注過程中會(huì)涉及到心肌細(xì)胞的水腫、組織壞死等病理學(xué)變化。我們通過心臟病理切片檢測心臟的病理學(xué)變化情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組無明顯病理學(xué)變化；模型組大部分心肌呈灶性壞死，纖維組織腫脹、斷裂；楊梅苷低中高劑量組對(duì)心肌損傷有不同程度的改善，心肌纖維斷裂和壞死區(qū)域減少，劑量依懶性的減輕心肌組織病變程度(圖4)。

2.5楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組心肌組織中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 及促凋亡蛋白Bax顯著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P< 0.01)。與模型組相比，楊梅苷高劑量組能夠顯著抑制凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)抗蛋白Bcl-2表達(dá)(P< 0.05，圖5 C)。此外，模型組p-ERK的表達(dá)較正常組顯著增加，楊梅苷預(yù)給藥可以抑制ERK的磷酸化(P< 0.05，圖5 E)。

3　討論

缺血心肌恢復(fù)血液灌流，常導(dǎo)致缺血心肌損傷加重，出現(xiàn)再灌注損傷。心肌收縮和舒張功能下降是I/R損傷的主要表現(xiàn)。HR、LVDP、± dp/dtmax是衡量心肌舒縮功能的常用指標(biāo)。其中，LVDP反映等容收縮期左室內(nèi)壓變化，體現(xiàn)心肌順應(yīng)性；+ dp/dtmax可間接反映心肌收縮的縮短程度，是評(píng)價(jià)心肌收縮性能的敏感指標(biāo)；-dp/dtmax是用于反映心臟舒張功能的敏感指標(biāo)。本研究釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，模擬心肌缺血再灌注損傷模型，測定HR、LVDP、± dp/dtmax等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組心臟的HR、LVDP、± dp/dtmax均明顯降低，提示缺血再灌注后心臟功能受損。相對(duì)于模型組，楊梅苷低中高劑量組在再灌注期左室HR、LVDP、± dp/dtmax顯著升高，表明楊梅苷預(yù)處理可改善缺血再灌注心臟收縮及舒張功能，其中高劑量作用最明顯。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)，具有生物毒性；SOD、CAT是能夠清除自由基的酶，維持機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。因此，心肌組織中MDA、SOD、CAT水平可間接反應(yīng)心肌損傷的程度和清除自由基的能力[12]。心肌細(xì)胞內(nèi)含有大量的心肌三酶CK、LDH和AST，正常情況下，心肌三酶存在于細(xì)胞內(nèi)，但當(dāng)心肌受損時(shí)，心肌細(xì)胞膜被破壞，其通透性改變，心肌三酶和自由基釋放到血液中，通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對(duì)心肌造成進(jìn)一步的損害[13]，因此心肌三酶含量也可以反映心肌組織受損情況。為進(jìn)一步研究楊梅苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，我們測定了心肌組織中心肌三酶和抗氧化酶的活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，楊梅苷能減少LDH、CK及AST的外漏，提高SOD、CAT的活性，降低MDA的含量。由此可見，楊梅苷可以保護(hù)心肌細(xì)胞，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。HE染色后發(fā)現(xiàn)I/R模型組心肌損傷嚴(yán)重，楊梅苷可改善I/R的心肌損傷，減少心肌纖維斷裂和壞死區(qū)域。上述結(jié)果證明楊梅苷對(duì)I/R誘導(dǎo)的心肌損傷具有顯著的保護(hù)作用。

1994年Gottlieb等[14]利用家兔離體心臟灌注模型發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。此后，許多研究證實(shí)，心肌缺血再灌注損傷能夠引起心肌細(xì)胞凋亡[15]。凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的程序性死亡。凋亡信號(hào)通路主要包括外源性途徑(死亡受體凋亡途徑)和內(nèi)源性途徑(線粒體凋亡途徑)。在生理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞有序而協(xié)調(diào)地激活凋亡誘導(dǎo)基因(Bax、Fas和p53等)和凋亡抑制基因(Bcl-2等)，共同調(diào)控細(xì)胞代謝而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但在缺血再灌注過程中，凋亡相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16-17]。本研究結(jié)果表明，楊梅苷可顯著抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，并促進(jìn)抗蛋白Bcl-2表達(dá)。提示楊梅苷可調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間平衡，抑制Caspase家族蛋白的激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用。同時(shí)楊梅苷可以降低ERK1/2的磷酸化水平，提示楊梅苷可能通過抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來緩解缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，楊梅苷對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與楊梅苷的清除氧自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性、抑制細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)，進(jìn)一步的作用機(jī)制可能是通過抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路緩解缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。由于心肌缺血再灌注過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生是多因素和多途徑的[18]，所以阻斷細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和抑制參與多信號(hào)途徑的介質(zhì)可能是防治缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡的有效方法。

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.楊梅苷低劑量組(Myr 2.5 mg/L)；D.楊梅苷中劑量組(Myr 5 mg/L)；E.楊梅苷高劑量組(Myr 10 mg/L)；F.陽性給藥組(維拉帕米100 μg/L)。圖4　楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟組織病理學(xué)變化的影響Note: A. control gtoup; B. model group; C. myricitrin low dose group (Myr 2.5 mg/L); D. myricitrin middle dose group (Myr 5 mg/L); E. myricitrin high dose group (Myr 10 mg/L); F. positive administration group (Ver 100 μg/L).Fig.4　Effect of myricitrin on the pathological changes of isolated rat hearts

注：A. Westen blot檢測凋亡相關(guān)蛋白和ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況；B. Caspase-3和Caspase-9相對(duì)表達(dá)水平 C. Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平；D. Bax相對(duì)表達(dá)水平；E. p-ERK1/2相對(duì)ERK1/2表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，# P < 0.01，與模型組比較，。圖5　楊梅苷對(duì)大鼠離體工作心臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note: A. The expression of proteins related to apoptosis and ERK1/2 determined by Western blot analysis; B. Statistical results of Caspase-3, Caspase-9 expression levels relative to the control group; C. Statistical results of Bcl-2 expression level relative to the control group; D. Statistical results of Bax expression level relative to the control group; E. Statistical results of p-ERK1/2/ ERK1/2 expression level relative to the control group. ##P < 0.01, vs. the control group; *P < 0.05, **P < 0.01, vs. the model group.± s, n=3).Fig.5　Effect of myricitrin on the expression of apoptosis related proteins in isolated rat hearts

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Protective effects of myricitrin on ischemic/reperfusion injury in isolated rat hearts

CHEN Ya-ping1, ZHANG Bin2, LIU Gui-yan1, LIN Wen-bin3, WANG Min2, SUN Gui-bo2, SUN Xiao-bo2

(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 3. Center of Research and Development onLife Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of myricitrin on myocardial ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts and its underlying mechanism. Methods Sixty SD rats were randomly divided into: (1) control group; (2) model group; (3) positive administration group (verapamil of 100 μg/L); (4) three dose groups with varying amount of myricitrin (2.5, 5, 10 mg/L). Each group included ten rats. The myocardial ischemia/reperfusion injury model was constructed using the Langendorff method. The isolated working hearts were ischemia for 30 min followed by reperfusion for 45 min after in equilibrium for 15 min. During the process, we determined myocardial hemodynamic parameters, myocardial enzyme indicators (lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and aspartate aminotransferase (AST)) and antioxidative parameters (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA)). Furthermore, we performed histopathological examination of left ventricles and detected the expression of apoptosis related proteins (e.g., Bcl-2, Bax, Caspase-3 and Caspase-9) by western blot. Results Compared with the model group, myricitrin could significantly improve cardiac constriction and relaxation function, decrease the levels of LDH, CK and AST in perfusate, enhance the activities of SOD and CAT, and decrease the content of MDA in myocardial tissue. The cardiac protective effect of myricitrin was further confirmed by histopathological examination. Apparently, myricitrin pretreatment restrained myocardial apoptosis as evidenced by increasing the level of Bcl-2 expression, decreasing the levels of Bax, Caspase-3 and Caspase-9 expression, and inhibiting the phosphorylation of ERK. Conclusions Myricitrin had a protective effect on myocardial ischemia/reperfusion injury. It showed ability of improving myocardial contractile function, increasing anti-oxidation ability and inhibiting apoptosis. The possible mechanism of cardiac protection of myricitrin was that the agent attenuated myocardial cell apoptosis induced by ischemia reperfusion via inhibiting ERK signaling pathway.

Myricitrin; Myocardial ischemia/reperfusion; Cardiac hemodynamics; Myocardial enzymes; Cell apoptosis

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目 (2012ZX09501001-004)；

陳亞萍(1992-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)。

孫曉波(1958-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，E-mail: sun-xiaobo@163.com；孫桂波(1973-)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，E-mail: sunguibo@126.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0031-09

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.005

2016-03-23