曾翠玲，鄭凌云，邢麗英，李香莉，王麗京

(廣東藥學院，血管生物學研究所，廣州 510006)

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Slit2在非酒精性脂肪肝中的作用

曾翠玲，鄭凌云，邢麗英，李香莉，王麗京

(廣東藥學院，血管生物學研究所，廣州 510006)

目的探討Slit2蛋白在非酒精性脂肪肝中的作用。方法選取8周齡雄性LDLR-/-小鼠和LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠，各6只，高脂喂養(yǎng)12周建立NAFLD模型后，眼眶靜脈叢取血測定血清TC,TG,LDL-C,HDL-C的水平，取肝臟組織做切片染色觀察病理改變并提取肝組織RNA用QPCR分析LDLR-/-小鼠和LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠脂代謝相關(guān)基因的表達水平。結(jié)果LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠血清中LDL-C水平明顯低于LDLR-/-小鼠；與LDLR-/-小鼠相比, LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝臟脂肪變性及肝損傷明顯減輕, 且肝臟組織脂代謝相關(guān)基因表達明顯減少。結(jié)論Slit2蛋白減輕了小鼠肝組織的病理損傷。

Slit2；非酒精性脂肪肝；脂代謝

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1]。隨著生活水平的改善、生活方式的改變、肥胖患者的增加，NAFLD的發(fā)病率不斷攀升,目前已成為全球慢性肝臟疾病的首要病因。其危害在于部分患者可進而發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，并易于并發(fā)心腦血管疾病而導致相關(guān)的致死致殘率上升[2-4]。因此,研究NAFLD肝脂肪變性的發(fā)病機制具有十分重要的臨床意義。

Slit2是一種最早從果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的分泌型細胞外基質(zhì)蛋白，通過結(jié)合細胞膜上的roundabout(Robo)受體家族發(fā)揮作用。Slit/Robo信號作為神經(jīng)導向因子在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用已經(jīng)被闡述明確, 研究表明Slit/Robo信號還參與多種生理病程，如抑制白細胞趨化，參與血管的發(fā)生及腫瘤新生血管的形成[5-7]。我們實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo1信號在肝纖維化中具有重要作用，Slit2蛋白過表達可以促進小鼠肝纖維化發(fā)生，而slit2阻斷劑治療后可明顯減輕小鼠肝纖維化[8]，而Slit2蛋白在NAFLD中是否也有重要作用未見報道。本文選用Slit2蛋白過表達的LDLR-/-小鼠(即LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠)為研究對象，以LDLR-/-小鼠為對照組，通過高脂喂養(yǎng)建立NAFLD模型，觀察Slit2蛋白在NAFLD中的作用。

1　材料和方法

1.1材料

1.1 .1實驗動物

LDLR-/-小鼠(B6.129S7-Ldlrtm1Her/J)12只(雄性4只，雌性8只)購自美國Jackson實驗室,貨號：002207。Slit2過表達小鼠(Slit2-Tg小鼠)，由上海生命科學院構(gòu)建贈送[9],共6只，6～8周齡。LDLR-/-小鼠與Slit2-Tg小鼠雜交后所得LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠，通過6～8代回交且繁殖穩(wěn)定后，用于本研究。所有小鼠均在廣東藥學院實驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)擴群【SYXK(粵)2012-0125】。

1.1.2儀器及試劑

試劑：甲醇、乙醇、異丙醇和蘇木素-伊紅染色套裝( 康龍生物)，瓊脂糖(Biowest)，PCR引物(Invitrogen)，PCR Mix(Thermo),酶法血脂四項測定試劑盒(北京中生北控), RNA提取試劑盒(Takara),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)；2xRT SYBR Green Master Mix(Takara)。

儀器：組織包埋機(萊卡)、石蠟切片機(萊卡)；PCR儀( 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；光學顯微鏡(Olympus)；低溫離心機 (Thermo)；超速離心機(Beckman)；制冰機( 北京長流科學儀器有限公司)；凝膠成像儀(GE)；電泳儀(Bio-Rad)；旋轉(zhuǎn)混合儀( 寧波新芝生物科技有限公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore)。

1.2方法

1.2.1LDLR-/-小鼠的鑒定

剪取3周齡小鼠尾尖部約1 cm ,置于1 mL離心管中，加入180 μL 50 mmol/L的NaOH，100℃水浴裂解30 min后加入20 μL 1 mmol/L的Tri-HCL 充分混勻，離心所得上清液即為提取的DNA。將提取的DNA按以下條件鑒定：LDLR-/-基因引物P1：AATCCATCT TGTTCAATGGCCGATC；LDLR-/-基因引物P2：CCATATGCATCCCCAGTCTT；LDLR-/-基因引物P3：GCGATGGATACACTCACTGC。PCR反應(yīng)條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72℃充分延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果: LDLR-/-基因的擴增產(chǎn)物片段長度約為350 bp，野生型擴增產(chǎn)物片段長度約為167 bp。

1.2.2LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠的鑒定

LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠的鑒定分為兩部分，第一部分鑒定LDLR-/-基因，鑒定步驟見1.2.1；第二部分鑒定Slit2基因，Slit2基因的鑒定條件：Slit2基因引物P1: CCCTCCGGATCCTTTACCTGTCAAGG TCCT，Slit2基因引物P2: TGGAGAGAGCTCACAG AACAAGCCACTGTA。PCR反應(yīng)條件為94℃預變性4 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次，72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。Slit2基因的擴增產(chǎn)物片段長度約為600 bp。在350 bp和600 bp處均有擴增產(chǎn)物的為LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠。

1.2.3NAFLD動物模型構(gòu)建

LDLR-/-小鼠與 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠每組各6只，8周齡左右，均為雄性，對照組給予普通飼料，模型組進行高脂飼料(普通飼料87.5%，豬油10%，膽酸鹽0.5%，膽固醇2%)喂養(yǎng)12周建立NAFLD動物模型。高脂飼料喂養(yǎng)12周后取材，取材前一天禁食12 h，對各組小鼠分別進行眼眶靜脈叢取血并取肝臟組織用于下一步實驗。

1.2.4小鼠血脂分析

用北京中生北控血脂測定試劑盒，參照試劑盒說明書測定小鼠血脂，通過酶標儀測定相應(yīng)的吸光值。TC,TG和HDL-C的濃度分別根據(jù)吸光度直接計算得出，TG<4.5 mmol/L時，LDL-C濃度由Friedewald公式法推算得到，LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.5小鼠肝臟組織病理學觀察

用頸椎脫臼法處死小鼠，分別取對照組和模型組LDLR-/-小鼠與LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝臟組織進行固定，經(jīng)脫水后石蠟包埋、切片，進行HE染色，鏡下觀察各組肝臟組織的病理改變。

注：Marker: DNA marker 2000；1～4號為子代小鼠DNA擴增結(jié)果，其中1號為野生型小鼠；2和3號小鼠為LDLR+/-;Slit2-Tg小鼠，4號小鼠為 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠。圖1　LDLR-/-小鼠與 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠鑒定圖Note: Marker: DNA marker 2000；1～4:Identification results of the offsprings by PCR，No．1 is wild type mouse，No．2,3 are LDLR+/-;Slit2-Tg mice,No．4 is LDLR-/-;Slit2-Tg mouse.Fig.1　PCR results of LDLR gene and Slit2 gene for identification of LDLR-/- mice and LDLR-/-;Slit2-Tg mice

1.2.6小鼠肝組織脂代謝相關(guān)基因mRNA表達

分別取高脂飼料喂養(yǎng)12周后的LDLR-/-小鼠和LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝組織，Trizol裂解法抽提總RNA。每個樣品以1 μg RNA按Takara的試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用Takara的SYBR Green試劑盒檢測脂代謝相關(guān)基因LXR-α，LXR-β，SREBP-1c和FAS的表達水平。引物序列：Mouse GAPDH，5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′(Forward),5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′(Reverse), 產(chǎn)物大小233 bp；Mouse LXR-α，5′-CTCAATGCCTGATGTTTCTCCT-3′(Forward), 5′-TCCAACCCTATCCCTAAAGCAA-3′(Reverse),產(chǎn)物大小150 bp；Mouse LXR-β，5′-ATGTCTTCCCCC ACAAGTTCT-3′(Forward), 5′-GACCACGATGT AGGCAGAGC-3′(Reverse),產(chǎn)物大小156 bp；Mouse SREBP-1c，5′-GCAGCCACCATCTAGCCTG-3′(Forward), 5′-CAGCAGTGAGTCTGCCTTGAT-3′(Reverse),產(chǎn)物大小199 bp；Mouse FAS，5′-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3′(Forward),5′-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3′(Reverse),產(chǎn)物大小140 bp。 Realtime PCR 反應(yīng)條件為：95℃預變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。測得的閾循環(huán)(threshold cycle, Ct值)，根據(jù)公式△Ct=[ Ct(目的基因)]-[ Ct(GAPDH)]和△△Ct=[△Ct(實驗組)]-[△Ct(對照組)]，計算出2-△△Ct，反應(yīng)目的基因表達水平。

1.2.7統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1LDLR-/-小鼠與 LDLR-/-;Slit2-Tg 小鼠的鑒定結(jié)果

將LDLR-/-小鼠和Slit2-Tg小鼠雜交。對其F2代進行LDLR基因和Slit2基因的鑒定, LDLR-/-小鼠基因條帶為350 bp,LDLR+/+小鼠基因條帶為167 bp; Slit2-Tg小鼠基因的條帶為600 bp。圖1A為LDLR基因的鑒定圖，4號小鼠是LDLR-/-小鼠。圖1B為Slit2基因的鑒定圖，2～4號小鼠為Slit2-Tg小鼠。綜上，1號小鼠為野生型小鼠，2和3號小鼠為LDLR+/-;Slit2-Tg小鼠，4號小鼠為LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠。

2.2Slit2過表達對高脂誘導的小鼠血脂水平的影響

8周齡左右的雄性LDLR-/-小鼠(n=6)與 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠(n=6)進行高脂飼料喂養(yǎng)12周后，小鼠血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)濃度均比正常飲食情況下增高,而高密度脂蛋白(HDL-C)沒有變化。其中LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠血清中LDL-C濃度明顯低于LDLR-/-小鼠(P<0.01)。

注:與LDLR-/-組相比，** P<0.01。圖2　小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平(mmol/L，n=6)Note:Compared with the LDLR-/- group，** P<0.01.Fig.2　The serum TC，TG，HDL-C，and LDL-C levels of the mice (mmol/L，n=6)

2.3Slit2過表達對小鼠肝臟組織的影響

HE染色結(jié)果顯示，普通飼料喂養(yǎng)12周(對照組)的LDLR-/-和LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。肝細胞呈多邊形,核大而圓,位于肝細胞中央。高脂飼料喂養(yǎng)12周(模型組)后，LDLR-/-小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)不完整，肝細胞排列紊亂,有些肝細胞腫大變圓,內(nèi)有脂肪滴，伴氣球樣變,炎性細胞浸潤，部分出現(xiàn)肝細胞水腫，組織壞死。LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠也出現(xiàn)肝細胞脂肪變性,但相較于LDLR-/-小鼠明顯減輕,肝臟組織結(jié)構(gòu)較完整。

注：A:LDLR-/-小鼠(對照組)；B:LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠(對照組)；C:LDLR-/-小鼠(模型組)；D:LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠(模型組)。圖3　小鼠肝臟HE染色(標尺=50 μm)Note:A:LDLR-/- mice(Control)；B:LDLR-/-;Slit2-Tg mice(Control)；C:LDLR-/- mice(Model)；D:LDLR-/-;Slit2-Tg mice(Model).Fig.3　HE staining of the liver(Bar=50 μm)

2.4Slit2過表達對小鼠脂代謝相關(guān)基因表達的影響

注：與LDLR-/-組相比，*為P≤0.05，**為P≤0.01，***為P≤0.001，(n=6)。LXR-α，肝臟X受體-α；LXR-β，肝臟X受體-β；FAS，脂肪酸合成酶；SREBP-1c，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c。圖4　高脂喂養(yǎng)12周后小鼠肝臟LXR-α、LXR-β、FAS和SREBP-1c mRNA的表達(n=6) Note:Compared with the LDLR-/- group，*P≤0.05，** P<0.01，*** P≤0.001，(n=6).LXR-α,Liver X receptor-α; LXR-β, Liver X receptor-β; FAS, Fatty acid synthase;SREBP-1c,Sterol regulatory element binding protein-1c.Fig.4　The expression levels of LXR-α、LXR-β、FAS and SREBP-1c mRNA in the liver after 12 weeks of high-fat diet(n=6)

實時定量RT-PCR的方法檢測模型組LDLR-/-小鼠與 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝臟中與脂代謝通路相關(guān)因子mRNA的表達。高脂喂養(yǎng)12周后，與LDLR-/-小鼠相比，LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠的LXR-α，LXR-β，SREBP-1c和FAS的mRNA水平都有顯著下調(diào)。結(jié)果顯示，LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠的LXR-β和FAS的表達明顯下降(P<0.05)，LXR-αmRNA的差異更顯著(P<0.01)，SREBP-1c在LDLR-/-小鼠與 LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠肝臟中表達差異最明顯(P<0.001)。

3　討論

NAFLD的發(fā)生與遺傳，環(huán)境，代謝密切相關(guān)，根據(jù)病因分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，原發(fā)性NAFLD與肥胖、糖尿病及高脂血癥等有關(guān)，繼發(fā)性NAFLD則由某些特殊原因所致，如藥物、毒物、減肥手術(shù)等[10]。隨著高血脂癥發(fā)病率的逐年上升, 大量研究證實高脂血癥是誘發(fā)脂肪肝的主要因素[11-12]。NAFLD的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前多認為其致病機制涉及胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、細胞凋亡和脂肪因子等多重打擊過程。目前較為公認的是1998年Day和James提出的二次打擊學說，認為一次打擊是多種原因?qū)е碌母沃x紊亂，引起肝脂肪變性。二次打擊則是由于肝臟脂肪變性，抗損傷能力下降，進而發(fā)展為脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化甚至肝癌。其中脂質(zhì)代謝紊亂引起肝脂沉積是NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13-15]。脂代謝信號轉(zhuǎn)導途徑錯綜復雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，LXR-α信號轉(zhuǎn)導途徑和SREBP-1c信號轉(zhuǎn)導途徑的紊亂在高脂血癥和脂肪肝的形成中具有重要的作用[16]。

本實驗采用LDLR-/-小鼠，通過高脂喂養(yǎng)建立了一種NAFLD模型，結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)12周后，血清TG、TC、LDL-C濃度均比正常飲食情況下增高，表現(xiàn)出高血脂的特征，肝臟病理形態(tài)表現(xiàn)出明顯的脂肪肝。同時利用LDLR-/-小鼠和Slit2蛋白過表達小鼠雜交建立了穩(wěn)定遺傳的LDLR-/-;Slit2-Tg小鼠，觀察Slit2對血脂，肝臟病理改變及脂代謝相關(guān)基因的影響。

Slit2及其受體Robo1主要表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo1在非神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達，在很多腫瘤及血管性疾病中都有Slit2/Robo1的異常表達。研究發(fā)現(xiàn)Slit2在肝臟和肝癌細胞株的表達差異與腫瘤分期和分化程度相關(guān)，Slit2在晚期肝癌及低分化肝癌中表達明顯上調(diào)，在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織[17-18]。我們實驗室前期研究也分別在臨床和肝纖維化小鼠模型中證實Slit2在纖維化的肝臟組織表達明顯高于正常肝組織，Slit2蛋白過表達可以促進小鼠肝纖維化發(fā)生[8]，但是Slit2在NAFLD中的作用尚未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)12周后，與LDLR-/-小鼠相比，Slit2蛋白過表達的LDLR-/-小鼠血清LDL-C水平明顯降低，肝臟脂肪變性明顯減輕。LDLR是一種細胞膜表面的糖蛋白，存在于哺乳動物和人體幾乎所有的細胞表面上，但以肝細胞上最為豐富，其主要功能是通過攝取膽固醇進入細胞內(nèi)來調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平。LDLR功能缺陷引起血脂尤其是LDL和VLDL的清除途徑受阻，進而抑制了肝內(nèi)脂類向肝外組織的轉(zhuǎn)運，是高膽固醇血癥和脂肪肝的主要原因之一[19]。我們結(jié)果說明Slit2蛋白主要通過降低血清LDL-C水平，減輕肝臟的脂肪變性。研究表明LXR-α激活可以促進脂肪合成相關(guān)基因如脂肪酸合成酶(FAS)，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD-1)的表達，促進脂肪酸的從頭合成，進而導致肝臟脂肪變性和高膽固醇血癥[20-21]。同時LXR-α可激活SREBP-1c，上調(diào)FAS的基因轉(zhuǎn)錄促進脂肪酸合成[22-23]。我們研究結(jié)果顯示，Slit2蛋白過表達后脂代謝相關(guān)基因LXR-α和SREBP-1c基因表達均明顯下降。研究初步表明Slit2過表達可能通過抑制LXR-α—SREBP-1c—FAS信號軸抑制脂肪酸的合成，降低肝臟脂質(zhì)及血脂水平。

綜上所述Slit2過表達可以減輕肝臟脂肪變性，降低血脂水平，其機制可能是抑制LXR-α—SREBP-1c—FAS信號軸，抑制脂肪酸的合成。因此本研究為預防或治療脂肪肝提供新的線索，也為研究開發(fā)治療脂肪肝藥物提供了新的靶點。

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Effect of Slit2 on nonalcoholic fatty liver disease

ZENG Cui-ling，ZHENG Ling-yun，XING Li-ying，LI Xiang-li，WANG Li-jing

(Vascular Biology Research Institute，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Slit2 over-expression on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in mice. Methods Eight week male LDLR-/-mouse and LDLR-/-;Slit2-Tg mouse were fed a high-fat diet for 12 weeks to induce NAFLD(n=6 per group). After 12 weeks, they were taken for blood samples and dissected. The concentration of TG (triglycerides), TC(total cholesterol), LDL-C(low density lipoprotein cholesterol) and HDL-C(high density lipoprotein cholesterol)in the serum were examined respectively. Liver tissue samples were taken for HE staining to observe the morphological and pathological changes. The mRNA expression levels of hepatic genes related to lipid metabolism such as LXR-α，LXR-β FAS ,SREBP-1c was measured by real-time RT-PCR. Results The serum LDL-C levels of LDLR-/-;Slit2-Tg mouse were significantly lower than that in LDLR-/-mouse(P< 0.01).And the grade of lipid droplets and pathological injury of liver tissue decreased significantly in the LDLR-/-;Slit2-Tg mouse compared with LDLR-/-mouse. Furthermore, The mRNA expression levels of hepatic genes related to lipid metabolism decreased significantly in the LDLR-/-;Slit2-Tg mouse. Conclusions The overexpression of Slit2 can reduce the pathological injury of liver tissue in mouse with NAFLD.

Slit2; NAFLD; Lipid metabolism

國家自然科學基金資助項目(31271455；31200861)。

曾翠玲(1991-)，女，碩士生，主要從事心血管疾病研究。Email:zengcuiling0929@163.com。

王麗京，女，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學。 Email:wanglijing62@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0019-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.003

2016-02-25