徐玉雪，邱　彬，魏　強，雍偉東

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京　100021)

?

Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區(qū)RNA表達(dá)譜系的分析比較

徐玉雪，邱彬，魏強，雍偉東

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

目的通過分析野生型小鼠(WT)與Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝臟、海馬RNA表達(dá)譜系之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路和神經(jīng)通路中的作用。方法利用第二代測序技術(shù)對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬mRNA進(jìn)行表達(dá)譜測序，將測序結(jié)果用BRB-ArrayTools進(jìn)行分析，篩選出小鼠肝臟與海馬的差異基因，然后分別利用在線工具DAVID對差異基因進(jìn)行GO本體分析，STRING數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Genecard對基因進(jìn)行注釋。 結(jié)果 (1)Fkbp51的缺失，在肝臟中造成類固醇生物合成及代謝、脂類物質(zhì)代謝以及氧化還原反應(yīng)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化；(2)在海馬中造成機械刺激探測、學(xué)習(xí)或記憶、突觸傳遞的調(diào)節(jié)、PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化；(3)在肝臟與海馬中，F(xiàn)kbp51的缺失同時造成了11個基因的共差異表達(dá)，這11個基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖顯示：HMGCS2與INSIG1及相關(guān)蛋白形成網(wǎng)絡(luò)，而USP2與PER、CRY、DBP等相關(guān)蛋白形成另一個網(wǎng)絡(luò)。這兩個網(wǎng)絡(luò)既參與代謝也參與神經(jīng)調(diào)節(jié)。結(jié)論Fkbp51在代謝與神經(jīng)中的作用既是相互獨立又是相互聯(lián)系的。

Fkbp51基因敲除小鼠；肝臟；神經(jīng)系統(tǒng)；RNA-seq

Fkbp51是一種具有肽酰脯氨酰順-反異構(gòu)酶活性的免疫親和蛋白，含有肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用。其作為一種共伴侶蛋白，能夠直接與伴侶蛋白(熱休克蛋白HSP90/70等)結(jié)合并參與激素-受體復(fù)合物的形成及調(diào)控[1]。已有研究表明，F(xiàn)kbp51在代謝與神經(jīng)方面發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp51可通過調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝在動物體代謝過程中發(fā)揮作用。在肝臟中，糖皮質(zhì)激素(GC)的重要作用是促進(jìn)糖異生，但GC的過度刺激往往會引發(fā)糖尿病和某些代謝綜合征，如向心性肥胖、脂肪病變和胰島素抵抗等[2-3]。GC激活糖皮質(zhì)激素受體(GR)后可直接促進(jìn)Fkbp51的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)反饋作用于GR，使其對GC的敏感性降低[4-6]，促進(jìn)機體穩(wěn)態(tài)的平衡。此外，近些年Fkbp51在脂肪細(xì)胞分化中的作用也引起了研究者們的關(guān)注，Toneatto J等[7]人發(fā)現(xiàn)Fkbp51可抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，而Stechschulte等[8]人的研究則發(fā)現(xiàn)脂肪的生成需要Fkbp51的參與，這些矛盾的體外實驗結(jié)果，可能是由于培養(yǎng)和誘導(dǎo)體系不同所導(dǎo)致的。我們前期利用Fkbp51基因敲除小鼠(Fkbp51KO)，通過高脂喂養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)敲除Fkbp51基因可對抗高脂誘導(dǎo)的肥胖[9]，并且其體內(nèi)脂肪含量明顯減少。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp51KO肝臟、肌肉和脂肪組織中GR的活性明顯大于野生型小鼠(WT)，提示Fkbp51可能通過調(diào)節(jié)GR活性及其下游基因在代謝中發(fā)揮作用[10]。

此外，F(xiàn)kbp51在神經(jīng)方面也發(fā)揮著重要作用。海馬是應(yīng)激反應(yīng)的整合部位，在海馬中存在糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)就是通過GR和MR調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。HPA軸通過釋放皮質(zhì)類固醇激素來應(yīng)對外界的各種壓力，這類激素的釋放可激活神經(jīng)元中GR活性和一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因[11]，但這些調(diào)控機制的紊亂則會導(dǎo)致與壓力相關(guān)腦疾病的產(chǎn)生。Binder和他的同事發(fā)現(xiàn)Fkbp51基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與抑郁癥及其治療密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)為抗抑郁藥物的研究提供了新的方向[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，這些存在于Fkbp51基因組中的SNPs能夠使Fkbp51蛋白表達(dá)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致GR活性下降，引起HPA軸調(diào)節(jié)的紊亂。持續(xù)的GR抵抗使個體極易發(fā)生與壓力相關(guān)的精神疾病。近年的研究還發(fā)現(xiàn)Fkbp51基因的SNPs變異與多種精神疾病的發(fā)病具有高度相關(guān)性，包括重度抑郁、雙相情感障礙以及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)等[13-14]。

本實驗通過分析Fkbp51基因敲除小鼠肝臟、海馬RNA表達(dá)譜系與野生型小鼠之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路與神經(jīng)通路以及共同通路中的差異基因,進(jìn)而進(jìn)一步研究Fkbp51在生物體中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物

2月齡清潔級Fkbp51KO與同窩野生型雄鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供【SYXK(京)2014-0029】【SCXK(京)2014-0004】，體重20g～24g。動物實驗方案經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(zhǔn)。在使用實驗動物的過程中充分考慮到動物的福利原則，尊重動物生命,善待動物，減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害，采取脫頸的方法處置動物。

1.2方法

1.2.1RNA提取及測序

脫頸處死同窩Fkbp51KO與WT雄鼠各3只，取肝臟和海馬，利用Trizol法提取組織的RNA，樣品交由華大基因測序。

1.2.2差異表達(dá)基因的篩選

利用BRB-ArrayTools軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。該軟件基本功能包括數(shù)據(jù)可視化、標(biāo)準(zhǔn)化處理、差異基因篩選、聚類分析等。BRB-ArrayTools以Excel加載宏的形式呈現(xiàn),計算由Excel外部的分析工具完成,用來比較兩個組間的基因表達(dá)差異,集中關(guān)注一組顯著上調(diào)或下調(diào)的基因,以此來闡述不同處理對樣本產(chǎn)生的影響或揭示其中的生物學(xué)意義。

1.2.3差異基因的GO本體分析以及KEGG通路分析

通過在線工具DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異基因進(jìn)行分析?；虮倔w數(shù)據(jù)庫GO(Gene Ontology)具有3個結(jié)構(gòu)化的網(wǎng)絡(luò)，從生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能三個方面分別對肝臟與海馬的差異基因進(jìn)行注釋。

1.2.4差異表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫是一個有關(guān)已知或預(yù)測蛋白質(zhì)間相互作用的數(shù)據(jù)庫,這些相互作用包括物理上的直接作用和功能上的間接關(guān)系。它們主要來自高通量實驗、共表達(dá)分析、基因組內(nèi)容、已有的知識這四個資源數(shù)據(jù)子庫。本文章主要利用此數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肝臟與海馬共差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，來進(jìn)一步研究蛋白之間的直接與間接相互作用。

1.2.5Genecard注釋及分析

通過在線工具Genecard(http://www.genecards.org/)對基因進(jìn)行注釋。Genecard是一個全面的，綜合的收集了所有已知的或者預(yù)測的基因。它整合了跟基因相關(guān)的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、臨床等相關(guān)信息，收集整理了超過100個網(wǎng)站的數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達(dá)基因的分析

2.1.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達(dá)基因的GO本體分析

利用BRB-ArrayTools軟件對Fkbp51KO和WT小鼠的肝臟基因進(jìn)行差異篩選，共篩選出206個差異基因，其中154個基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，52個基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。通過在線工具DAVID對肝臟的差異基因進(jìn)行GO本體分析，分別從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能對基因進(jìn)行注釋(圖1)，并統(tǒng)計每個注釋中的上調(diào)基因和下調(diào)基因個數(shù)(表1)。從圖中可以看出，肝臟中的差異基因主要涉及與脂類物質(zhì)代謝相關(guān)的生物學(xué)過程，在細(xì)胞組成中涉及到高密度脂蛋白顆粒，在分子功能中涉及到芳香化酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性以及類固醇脫氫酶活性。這一分析也進(jìn)一步驗證了這些差異基因在肝臟中的重要性。

對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)過程分析發(fā)現(xiàn)：主要涉及類固醇生物合成過程、氧化還原反應(yīng)、類固醇代謝過程、脂類生物合成過程等生物學(xué)過程(表2)。

表1　KO與WT小鼠肝臟差異基因的變化趨勢

表2　KO與WT小鼠肝臟差異基因的生物學(xué)過程

注：Fisher檢驗,P< 0.001；Benjamini-Hochberg校正,P<0.01。

Note: Fisher’s exact test,P<0.001; Benjamini-Hochberg corrected,P<0.01.

2.2.2Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

同時DAVID在線工具對上述差異基因進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要參與藥物代謝、視黃醇代謝、細(xì)胞色素P450外源性代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝等信號通路(表3)。

2.2Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達(dá)基因的分析

2.2.1Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達(dá)基因的GO本體分析

利用BRB-ArrayTools軟件對Fkbp51KO和WT小鼠的海馬基因進(jìn)行差異篩選，共篩選出364個差異基因，其中172個上調(diào)基因，192個下調(diào)基因。通過在線工具DAVID對海馬的差異基因進(jìn)行GO本體分析，分別從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能對基因進(jìn)行注釋(圖2)，并統(tǒng)計每個注釋中的上調(diào)基因和下調(diào)基因個數(shù)(表4)。從圖中可以看出，海馬中的差異基因主要涉及與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的生物學(xué)過程，在細(xì)胞組成方面涉及到與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的纖維以及微管，在分子功能上涉及順-反異構(gòu)酶等的活性。這一統(tǒng)計也正進(jìn)一步驗證了這些差異基因在海馬中的重要性。

通過對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)過程分析發(fā)現(xiàn)：主要涉及機械刺激探測、學(xué)習(xí)或記憶、多糖分解過程、突觸傳遞的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程(表5)。

表3　KO與WT小鼠肝臟差異基因的KEGG通路

注：Fisher檢驗,P<0.001；Benjamini-Hochberg校正,P<0.01。

Note: Fisher’s exact test,P<0.001; Benjamini-Hochberg corrected,P<0.01.

圖2　KO與WT小鼠海馬差異基因GO本體分析Fig.2　GO analysis of the Hippocampus differentially expressed genes in KO and WT

表4　KO與WT小鼠海馬差異基因的變化趨勢

表5　WT與Fkbp51KO小鼠海馬差異基因的生物學(xué)過程

注：Fisher檢驗,P<0.001。

Note:Fisher’s exact test,P<0.001.

表6　WT與Fkbp51KO小鼠海馬差異基因的KEGG通路

注：Fisher檢驗,P< 0.001。

Note:Fisher’s exact test,P<0.001.

2.2.2Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

同時DAVID在線工具對上述差異基因進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要參與PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、軸突導(dǎo)向通路、神經(jīng)配體-受體相互作用通路等信號通路(表6)。

2.3Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達(dá)基因的分析

2.3.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達(dá)基因的篩選

通過BRB-ArrayTools工具對兩樣本分類比較后一共找出11個共差異表達(dá)基因(圖3)，其中Abca3、Cela1、Fkbp5、Glo1、Hmgcs2、Insig1、Per3、Usp2在肝臟與海馬中的變化趨勢相同，而Cml1、Dbp、Gstm6變化趨勢相反，具體見表7。

圖3　 海馬與肝臟共差異表達(dá)基因Fig.3　Coexpression analysis of liver and hippocampus differentially expressed genes

表7KO與WT小鼠肝臟與海馬差異基因

Tab.7Liver and hippocampus differentially expressed genes differentially expressed genes in KO and WT

序號Number基因名稱NameofgenesKO/WT倍數(shù)(肝臟)KO/WTmultiple(liver)KO/WT倍數(shù)(海馬)KO/WTmultiple(hippocampus)1Abca34.4964↑1.1996↑2Cela14.3763↑2.0984↑3Cml13.4376↑0.6860↓4Dbp31.4498↑0.9561↓5Fkbp50.0180↓0.1159↓6Glo12.5599↑2.0965↑7Gstm62.5472↑0.6540↓8Hmgcs20.4022↓0.4807↓9Insig13.2643↑1.3971↑10Per310.4440↑1.2905↑11Usp24.9330↑1.2301↑

2.3.2Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達(dá)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

通過STRING在線工具對11個差異表達(dá)基因編碼的蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(圖4-左)，發(fā)現(xiàn)PER3、DBP與USP2之間存在相互作用關(guān)系，HMGCS2與INSIG1之間存在互作關(guān)系，而其他蛋白之間無網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp51通過HSP90AA1、CSNKLE與PER3、USP2、DBP、PER1、PER2、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTl形成相互作用的網(wǎng)絡(luò)，而HMGCS2、INSIG1與SREBF2、SCAP形成網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖4-右、表8)。HSP90AA1、CSNK1E、PER1、PER2、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTl、SREBF2以及SCAP雖然未出現(xiàn)在我們的測序數(shù)據(jù)里，但是為我們研究這些共差異蛋白在脂類代謝與神經(jīng)調(diào)節(jié)中的作用提供了一個明確的思路，具有非常重要的意義。

圖4　肝臟與海馬共差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4　Protein-protein interaction network of the differentially expressed genes

表8　肝臟與海馬共差異表達(dá)基因的可能作用基因

3　討論

Fkbp51在代謝與神經(jīng)中的具體作用機制目前仍不清楚，其作用機制可能涉及多個方面，這是一個多基因、多途徑、多步驟、多信號通路相互作用和相互影響的過程。因此，研究Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬RNA-seq，對于從分子水平揭示Fkbp51在生物體內(nèi)的作用是一個重要的突破口。

首先，對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，共篩選出206個差異表達(dá)基因。通過進(jìn)一步的GO本體和KEGG通路分析，我們發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要參與類固醇生物合成與代謝、脂類代謝、藥物代謝通路、視黃醇代謝通路、細(xì)胞色素P450外源性代謝通路、花生四烯酸以及亞油酸代謝通路等分子生物過程及信號通路。而Akr1c、Hsd3b、Sc4molL和Fdps幾乎參與上述所有過程。研究報道：Akr1c編碼酮類還原酶家族，此家族包含40種已知的酶。這些酶利用NADH/NADPH催化醛與酮之間的轉(zhuǎn)換；Hsd3b編碼的蛋白為一種雙功能酶，在類固醇的所有生物合成階段發(fā)揮重要作用；Sc4molL編碼甲基固醇單加氧酶，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，在內(nèi)源性膽固醇合成中扮演重要角色；而Fdps編碼法尼基焦磷酸合酶，可以催化合成香葉基焦磷酸酯和法尼基焦磷酸酯，而法尼基焦磷酸酯是膽固醇和甾醇生物合成過程中重要的中間物質(zhì)。因此深入研究Fkbp51與這些基因之間的關(guān)系，對于探究Fkbp51在脂代謝中的作用具有重要意義。

然后，對Fkbp51KO與WT小鼠的海馬數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，共篩選出364個差異表達(dá)基因。這些差異基因主要參與機械刺激探測、學(xué)習(xí)或記憶、多糖分解過程、突觸傳遞的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程以及PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、軸突導(dǎo)向通路、神經(jīng)配體-受體相互作用通路等信號通路。同時我們對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)泛素蛋白C(Ubiquitin C，UBC)居于網(wǎng)絡(luò)中心，我們通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)UBC與蛋白降解、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、激酶修飾以及細(xì)胞內(nèi)吞作用均有關(guān)，且該蛋白參與PI-3K級聯(lián)反應(yīng)。

最后，在肝臟與海馬的共差異表達(dá)分析中，我們發(fā)現(xiàn)HMGCS2與INSIG1存在互作關(guān)系。Hmgcs2編碼3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合酶2，是一種線粒體酶，催化生酮反應(yīng)的第一步反應(yīng)，主要在碳水化合物缺失(比如禁食)時發(fā)揮作用，研究顯示野生型小鼠體重減輕時，此蛋白表達(dá)量也隨之降低。Insig1是胰島素誘發(fā)基因1，編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)此蛋白具有促進(jìn)膽固醇合成和抑制脂類生成的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SCAP和SREBF2也參與此互作關(guān)系。Srebf2是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子2，調(diào)節(jié)低密度脂蛋白、膽固醇和脂肪酸的轉(zhuǎn)錄，維持脂類穩(wěn)態(tài)。SCAP是SREBP的伴侶蛋白，在高膽固醇和氧甾醇密集時，SREBP-SCAP復(fù)合物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留蛋白INSIG1的作用滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；而在低膽固醇時，SREBP-SCAP復(fù)合物離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入細(xì)胞核激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)固醇、脂肪酸以及甘油三酯等物質(zhì)的合成[15]。在Fkbp51KO與WT小鼠的測序數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)KO與WT小鼠相比，其HMGCS2表達(dá)量下降，而INSIG1表達(dá)量升高，這些均提示敲除Fkbp51基因可能通過這些基因調(diào)節(jié)脂類合成和代謝[16]。

從共差異表達(dá)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖中，我們還發(fā)現(xiàn)USP2與PER、CRY、DBP等蛋白存在相互作用。Usp2基因編碼泛素特異性肽酶2，具有去泛素化作用，主要靶蛋白為脂肪酸合成酶、小鼠雙微粒2(MDM2)以及細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)，并且在腫瘤壞死因子α(TNF-α)和核因子kB(NF-kB)信號通路中發(fā)揮重要作用。其中Mdm2是腫瘤抑制基因P53的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，而細(xì)胞周期蛋白D1在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。Dbp基因編碼白蛋白啟動子D位點結(jié)合蛋白，可結(jié)合白蛋白、Cyp2a4和Cyp2a5等基因的啟動子區(qū)，此外還能夠調(diào)節(jié)與生物節(jié)律相關(guān)的基因的表達(dá)。而Per3基因編碼的蛋白屬于生物鐘節(jié)律蛋白，是自發(fā)活動、代謝、行為的生物周期節(jié)律的蛋白組件，主要參與生物節(jié)律通路。CLOCK/ARNTL異質(zhì)二聚體可以上調(diào)該蛋白，而PER/CRY異二聚體可以通過結(jié)合CLOCK/ARNTL進(jìn)而抑制其上調(diào)作用。在代謝方面有研究報道，小鼠肝臟中的USP2A可以通過促進(jìn)CRY1去泛素化來增加其穩(wěn)定性，以此來對抗炎癥反應(yīng)，而這一穩(wěn)定性的維持則是通過抑制Per2啟動子活性實現(xiàn)的。有趣的是，促炎癥因子、TNF-α可以使CRY1蛋白表達(dá)水平增加并抑制與生物鐘相關(guān)的基因表達(dá)[17]。在神經(jīng)方面研究報道稱，USP2的去泛素化作用與生物節(jié)律蛋白密切相關(guān)，在低光照強度下Usp2-/-小鼠比WT小鼠的相位延遲明顯提高。最近的流行病研究顯示：生物節(jié)律的混亂會造成代謝上的紊亂[17-18]。在我們的測序數(shù)據(jù)中，USP2、PER與DBP蛋白在肝臟與海馬中的變化正是說明代謝調(diào)節(jié)與神經(jīng)調(diào)節(jié)是緊密聯(lián)系的。

本研究通過對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬RNA-Seq數(shù)據(jù)分析后，發(fā)現(xiàn)Fkbp51在脂類代謝和神經(jīng)調(diào)節(jié)中的作用既是相互獨立又是相互聯(lián)系的，也為下一步深入研究Fkbp51基因在脂類代謝和神經(jīng)調(diào)節(jié)中作用的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。未來我們將繼續(xù)展開工作，對這些數(shù)據(jù)分析進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)實驗，以期進(jìn)一步驗證這些分析的可靠性。

[1]Zannas A S, Wiechmann T, Gassen N C,etal. Gene-Stress-Epigenetic Regulation of FKBP5: Clinical and Translational Implications[J]. Neuropsychopharmacology, 2015,16(2):33-42.

[2]Vegiopoulos A, Herzig S. Glucocorticoids, metabolism and metabolic diseases[J]. Mol Cell Endocrinol, 2007, 275(1-2): 43-61.

[3]Sapolsky R M, Romero L M, Munck A U. How do glucocorticoids influence stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions[J]. Endocr Rev, 2000, 21(1): 55-89.

[4]Hubler T R, Scammell J G. Intronic hormone response elements mediate regulation of FKBP5 by progestins and glucocorticoids[J]. Cell Stress Chaperones, 2004, 9(3): 243-252.

[5]U M, Shen L, Oshida T,etal. Identification of novel direct transcriptional targets of glucocorticoid receptor[J]. Leukemia, 2004, 18(11): 1850-1856.

[6]Paakinaho V, Makkonen H, Jaaskelainen T,etal. Glucocorticoid receptor activates poised FKBP51 locus through long-distance interactions[J]. Mol Endocrinol, 2010, 24(3): 511-525.

[7]Toneatto J, Guber S, Charo N L,etal. Dynamic mitochondrial-nuclear redistribution of the immunophilin FKBP51 is regulated by the PKA signaling pathway to control gene expression during adipocyte differentiation[J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 23): 5357-5368.

[8]Stechschulte L A, Hinds T J, Khuder S S,etal. FKBP51 controls cellular adipogenesis through p38 kinase-mediated phosphorylation of GRalpha and PPARgamma[J]. Mol Endocrinol, 2014, 28(8): 1265-1275.

[9]張曼，邱彬，曹勇，等. 共伴侶蛋白FKBP51在高脂誘導(dǎo)肥胖中的作用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015(07): 53-58.

[10]Ratajczak T, Cluning C, Ward B K. Steroid Receptor-Associated Immunophilins: A Gateway to Steroid Signalling[J]. Clin Biochem Rev, 2015, 36(2): 31-52.

[11]de Kloet E R, Joels M, Holsboer F. Stress and the brain: from adaptation to disease[J]. Nat Rev Neurosci, 2005, 6(6): 463-475.[12]Binder E B, Salyakina D, Lichtner P,etal. Polymorphisms in FKBP5 are associated with increased recurrence of depressive episodes and rapid response to antidepressant treatment[J]. Nat Genet, 2004, 36(12): 1319-1325.

[13]Binder E B. The role of FKBP5, a co-chaperone of the glucocorticoid receptor in the pathogenesis and therapy of affective and anxiety disorders[J]. Psychoneuroendocrinology, 2009, 34 Suppl 1: S186-S195.

[14]Ratajczak T, Cluning C, Ward B K. Steroid Receptor-Associated Immunophilins: A Gateway to Steroid Signalling[J]. Clin Biochem Rev, 2015, 36(2): 31-52.

[15]Zheng W, Reem R E, Omarova S,etal. Spatial distribution of the pathways of cholesterol homeostasis in human retina[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e37926.

[16]Gao J, He J, Zhai Y,etal. The constitutive androstane receptor is an anti-obesity nuclear receptor that improves insulin sensitivity[J]. J Biol Chem, 2009, 284(38): 25984-25992.

[17]Tong X, Buelow K, Guha A,etal. USP2a protein deubiquitinates and stabilizes the circadian protein CRY1 in response to inflammatory signals[J]. J Biol Chem, 2012, 287(30): 25280-25291.

[18]Shimba S. The roles of clock genes in obesity[J]. Nihon Rinsho, 2013, 71(2): 244-248.

The gene expression profiling difference of liver and brain hippocampus between wild type andFkbp51 knockout mice

XU Yu-xue, QIU Bin, WEI Qiang,YONG Wei-dong

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medical Center，Peking Union Medical College (PUMC); Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China)

ObjectiveThe purpose of this study is to understand the function ofFkbp51 in metabolic pathways and neural pathways by profiling gene expression of liver and hippocampus tissues of bothFkbp51KO and WT mice.Methods mRNAs of liver and hippocampus ofFkbp51KO and WT mice were isolated and expression profiling was performed using RNA-seq. Differentially expressed gene between KO and WT were analyzed using BRB-Array Tools. DAVID, STRING, Genecard programs, the Gene Ontology, the Protein-protein Interaction Network and the Gene Annotation were applied to identify significant functional-relevant pathways. ResultsWhen compared differentially expressed genes betweenFkbp51KO and WT in liver, we found that the loss ofFkbp51 in liver has large effect on the genes related to steroid biosynthetic and metabolic process, lipid biosynthetic process and oxidation reduction. When differentially expressed gene in hippocampus was studied between genotypes, we found that elimination ofFkbp51 has much effect on genes related to detection of mechanical stimulus, learning or memory, regulation of synaptic transmission and the pathway of PPAR and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) e.g. When intersection of gene lists between liver and hippocampus tissues, we identified 11 common differentially expression genes. In these genes, HMGCS2 and INSIG1 are grouped in one protein-protein interaction network, and USP2, PER, CRY and DBP are grouped in another network. ConclusionsThe role ofFkbp51 in metabolism and nervous system is not only independent but also interactive.

Fkbp51 knockout mice;Liver; Nervous system;RNA-seq

國家自然科學(xué)基金(81272273)；協(xié)和青年基金和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(333320140151、3332015054、3320140086)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資助(DWS201508)。

徐玉雪(1988-)，女，碩士，研究方向：基因與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: 978268201@qq.com。

雍偉東(1967-)，男，研究方向：生殖與發(fā)育生物學(xué)。Email: wyong@cnilas.org；魏強(1964-)，男，研究方向：實驗動物病毒學(xué) Email: weiqiang0430@sohu.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0040-09

10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.005.006

2016-01-10