王志恒，應(yīng)春妹，趙　虎

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致陰道病的白念珠菌多位點(diǎn)序列分型分析及遺傳多樣性

王志恒1，應(yīng)春妹2，趙虎1

摘要：目的 對(duì)上海市3所婦產(chǎn)科醫(yī)院分離的114株白念珠菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，分析本地?？漆t(yī)院分離的白念珠菌主要基因型別與菌株耐藥關(guān)系，并了解菌株間遺傳多樣性與種群分類關(guān)系。方法 收集來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、上海市第一婦幼保健院和國(guó)際和平婦幼保健院共114株白念珠菌，采用eBURST進(jìn)行菌株親緣性分析，多位點(diǎn)序列分型（MLST）方法進(jìn)行分型，并采用ATBTM FUNGUS 3試劑盒作真菌體外藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果 114株菌株中共有47種DST型（diploid strain types， DST），其中已知30種，主要組群為DST 79和DST 435。114株白念珠菌對(duì)氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑敏感率分別為96.5%、100%、85.1%、55.2%、84.3%。結(jié)論 上海地區(qū)不同婦產(chǎn)科醫(yī)院致病性白念珠菌呈多克隆系，但主要為DST 79和DST 435型，且具有一定耐藥性。通過(guò)應(yīng)用MLST分型方法，初步發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)白念珠菌具有遺傳多樣性，且種群分類與基因分型具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：白念珠菌； 多位點(diǎn)序列分型； 基因分型

念珠菌性陰道病是一種常見(jiàn)婦科疾病，發(fā)病率僅次于細(xì)菌性陰道病。有研究表明，念珠菌性陰道病致病念珠菌85%～95%為白念珠菌［1］。白念珠菌陰道病危害嚴(yán)重，不僅會(huì)造成陰道瘙癢引起生活質(zhì)量下降，而且可以通過(guò)影響精子運(yùn)動(dòng)引發(fā)不孕，極少數(shù)患者會(huì)導(dǎo)致早產(chǎn)及胎兒發(fā)育不良，也可引起宮頸糜爛、輸卵管炎及盆腔炎［2］。隨著臨床抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，真菌耐藥性也越益嚴(yán)重。對(duì)真菌耐藥基因的檢測(cè)有助于抗真菌藥物的選擇，但真菌基因型隨著環(huán)境與時(shí)間的變化會(huì)產(chǎn)生一系列突變，最終導(dǎo)致其耐藥性的產(chǎn)生［3］。多位點(diǎn)序列分型（MLST）是一種基于核酸序列測(cè)定的分型方法，能對(duì)基因結(jié)構(gòu)高度多態(tài)性的致病性真菌進(jìn)行分型和遺傳分組，并能很好地區(qū)分來(lái)自同一種群或地區(qū)的菌株，其具有很高的分辨能力，適于分子流行病學(xué)研究和分子進(jìn)化學(xué)研究。本研究采用MLST方法對(duì)3所醫(yī)院114株引起念珠菌陰道病的白念珠菌進(jìn)行基因分型并探索其基因的變化過(guò)程。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源及鑒定保存

收集2013年11月—2014年1月臨床分離白念珠菌114株，其中 29株來(lái)自國(guó)際和平婦嬰保健院，26株來(lái)自上海市第一婦嬰保健院，59株來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，菌株均分離自患有念珠菌性陰道病女性的陰道分泌物，患者年齡21～56歲。陰道分泌物標(biāo)本收集后立即接種于 YPD（yeast extract peptone dextrose medium，YPD，上海生工生物工程科技有限公司）瓊脂平皿和科瑪嘉顯色平皿（上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司），置于35℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 ～48 h，YPD瓊脂平皿上菌落呈奶酪色，表面濕潤(rùn)光滑且邊緣整齊；科瑪嘉顯色平皿上菌落呈翠綠色；涂片鏡檢，見(jiàn)鏡下圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，則鑒定為白念珠菌。

1.2方法

1.2.1 DNA制備、擴(kuò)增和測(cè)序 使用Biospin真菌基因組DNA抽提試劑盒（BioFlux公司）抽提白念珠菌基因組DNA， NanoDrop2000測(cè)量DNA濃度，用雙蒸水稀釋至100～200 ng/μL。本實(shí)驗(yàn)中使用白念珠菌的7個(gè)管家基因及其PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。PCR總反應(yīng)體系為30 μL，包括：基因組DNA 50 ng，2×MasteMix 15 μL， 10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，用去離子水補(bǔ)充至30 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物測(cè)序由華大基因公司完成。1.2.2 測(cè)序結(jié)果分析和MLST 利用BioEdit以及DNAStar對(duì)菌株管家基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行閱讀和比對(duì)；將7個(gè)管家基因與數(shù)據(jù)庫(kù)上相應(yīng)的等位基因進(jìn)行比較，分別獲得每個(gè)菌株的等位基因型，并確定其DST型（diploid strain types， DST）。

表1　白念珠菌7種管家基因引物序列Table 1 Primers of 7 housekeeping genes of Candida albicans

1.2.3 菌株進(jìn)化關(guān)系分析 采用eBURST進(jìn)行菌株親緣性分析，并參照網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的所有白念珠菌MLST信息，利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)菌株進(jìn)行聚類分析和數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 真菌體外藥物敏感試驗(yàn) 菌株分離純化后，使用酵母樣真菌敏感性檢測(cè)試劑盒（ATBTMFUNGUS 3，法國(guó)生物梅里埃公司）鑒定。該試劑盒包括氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑5種抗真菌藥物。以近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為質(zhì)控菌株。

2　結(jié)果

2.1MLST分型結(jié)果

通過(guò)對(duì)114株白念球菌的7個(gè)管家基因的測(cè)序結(jié)果分析和在線比對(duì)，97株菌株為網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記DST型，見(jiàn)表2。17株可能為新DST型，網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未登記。

2.2菌株親緣性分析

由于17株菌落可能的DST型未在數(shù)據(jù)庫(kù)中登記，其DST型還沒(méi)有確定，因此，只對(duì)已登記的97株菌株進(jìn)行分析。97株DST型菌株中，有30種不同的基因型。通過(guò)eBURST分析，30種基因型的白念球菌分2個(gè)主要克隆群：DST 79和DST 435，其中DST 79共有40株，占總數(shù)的35.1%（40/114），DST 435有 14株， 占 12.3% （14/114）。DST 1395有7株，DST 2627有4株，其他DST型菌株單個(gè)或雙個(gè)分散存在，為獨(dú)特型，見(jiàn)圖1。

表2　部分白念珠菌等位基因數(shù)和DST型Table 2 Allele number of selected genes and DST type of Candida albicans

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/calbicans/）中世界各地不同DST型菌株進(jìn)行eBURST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，菌株群可分為多個(gè)分支，主要克隆群是DST 69，由DST 69菌株群向其他類型菌株分離進(jìn)化。我們實(shí)驗(yàn)中得到的DST 79是DST 69的一個(gè)直接分支，再由DST 79向DST 435方向進(jìn)一步分型，見(jiàn)圖2。

2.3體外藥物敏感性試驗(yàn)

114株白念珠菌中，所有菌株對(duì)兩性霉素B敏感，敏感率100%；110株對(duì)氟胞嘧啶敏感，占96.5%；97株對(duì)氟康唑敏感，占85.1%；63株對(duì)伊曲康唑敏感，占55.2%；96株對(duì)伏立康唑敏感，占84.3%。見(jiàn)表3。

2.4菌株進(jìn)化與耐藥性關(guān)系分析

圖1　30種DST型菌株eBURST親緣性分析Figure 1 Phylogenetic analysis of 30 DST isolates by eBURST

利用SPSS對(duì)114株白念球菌進(jìn)行聚類分析，采用Between-groups linkage聚類方法分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。所有菌株主要分為8個(gè)分支，其中，主要克隆群DST 79和DST 435處于同一組中，其余分散存在的克隆以及未知DST型克隆分別在其他7個(gè)分支中。

圖2　DST 69、DST 79和DST 435克隆群分布圖Figure 2 Colony distribution of DST 69， DST 79 and DST 435

表3　114株白念珠菌對(duì)5種抗真菌藥物敏感率Table 3 Susceptibility of 114 strains of Candida albicans to 5 antifungal agents

將DST聚類分析與其相應(yīng)的耐藥性相比較，主要的耐藥菌株類型為DST 79、DST 435和DST 608等，見(jiàn)表4。通過(guò)將3所醫(yī)院取得的菌株分別統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分離的菌株DST型種類最多，且主要的耐藥菌株類型是DST 79和DST 435；第一婦嬰保健院主要的耐藥菌株類型是DST 79；國(guó)際和平婦嬰保健院耐藥株比例較低，主要也為DST 79株。

3　討論

MLST作為基因分型的標(biāo)準(zhǔn)方法被廣泛應(yīng)用于微生物感染的分子流行病學(xué)研究中［4］。本研究采用MLST方法分析了上海3所婦產(chǎn)科醫(yī)院陰道分離的114株白念珠菌，主要結(jié)果：①分離自患者陰道分泌物的致病白念珠菌主要類型是DST 79 和DST 435克隆群；②DST 79和DST 435克隆群屬于祖源型菌株DST 69的一個(gè)分支型，也是本實(shí)驗(yàn)中主要耐藥型菌株；③菌株主要分布于8個(gè)分支，DST 79和DST 435集中在同一分支，其余分散存在的克隆以及未知DST型克隆分別分在另外7個(gè)分支中。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株的基因型集中在DST 79、DST 435、DST 608、DST 1395、DST 2627 和DST 2897基因型，但這6種基因型菌株耐藥率并不是100%，且對(duì)不同藥物的耐藥率不同。DST 608型菌株雖然對(duì)其中3種藥物的耐藥率為100%，但由于該基因型菌株只有1株，不足以說(shuō)明該基因型的確切耐藥情況。TAVANTI等［5］和ODDS 等［6］利用MLST方法也有類似的狀況，耐藥基因型也是散在不同分支中，且同一分支菌株耐藥率并不是100%。導(dǎo)致同類型菌株不同耐藥性的原因可能是不同基因型如特定位點(diǎn)雜合子或純合子差異等。

圖3　MLST分型結(jié)果聚類分析圖Figure 3 Cluster analysis of genotyping results of multilocus sequence typing

表4　不同DST型耐藥菌株統(tǒng)計(jì)Table 4 Summary of drug resistant strains in terms of DSTs

祖源型菌株DST 69菌株主要分離自美國(guó)、日本、馬來(lái)西亞、中東、新西蘭、英國(guó)和歐洲等［7- 8］國(guó)家和地區(qū)，而中國(guó)的白念珠菌主要以其分支為主，很少發(fā)現(xiàn)DST 69菌株。經(jīng)過(guò)比對(duì)，WU等［9］在上海某醫(yī)院中分離的白念珠菌DST 型在本實(shí)驗(yàn)所有的分支中都有，表明上海地區(qū)人群中的白念珠菌具有較強(qiáng)的一致性。GONG等［10］通過(guò)對(duì)取自沈陽(yáng)人群消化道的白念珠菌進(jìn)行MLST發(fā)現(xiàn)，DST 1593和DST 142等是最常見(jiàn)的基因型，由此可見(jiàn)，不同地區(qū)的致病白念珠菌基因型群具有較大的差異。SHIN等［11］發(fā)現(xiàn)，從韓國(guó)人群中分離的菌株主要類型為DST 69和DST 732，包括了來(lái)自中國(guó)、韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家的菌種以及西方的主要菌種，表明白念珠菌可能隨著人群流動(dòng)而播散。

白念珠菌作為一種條件致病性真菌，其基因組具有很大的變化潛能，經(jīng)過(guò)環(huán)境選擇的壓力，其染色體更易產(chǎn)生重組從而進(jìn)化出具有較強(qiáng)的致病性特征［12］。因此，對(duì)白念珠菌的種群結(jié)構(gòu)、流行病學(xué)調(diào)查和念珠菌屬物種的系統(tǒng)發(fā)育分析，為臨床提供了有用的診斷信息。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的致病菌基因種類多樣，耐藥菌株種類集中，且主要為對(duì)伊曲康唑耐藥，而對(duì)氟胞嘧啶和兩性霉素B耐藥性非常低，因此，檢測(cè)白念珠菌類型可以更好地指導(dǎo)臨床用藥。

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2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科。

中圖分類號(hào)：R379.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-7708（2016）03-0330-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.014

收稿日期：2015-08-31 修回日期：2015-12-02

作者單位：1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；

作者簡(jiǎn)介：王志恒（1986—），男，碩士，初級(jí)技師，主要從事細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)和耐藥機(jī)制研究。

通信作者：趙虎，E-mail：hubertzhao@163.com。

Multilocus sequence typing and genetic diversity of Candida albicans in patients with vulvovaginal candidiasis

WANG Zhiheng， YING Chunmei， ZHAO Hu. （Department of Lobratory Medicine， Huadong Hospital Affliated to Fudan University， Shanghai 200040， China）

Abstract:Objective To investigate the molecular epidemiology of 114 C. albicans strains isolated from the vaginal discharge of female patients treated in three obstetrics and gynecology hospitals in Shanghai by analyzing the relationship between the main genotypes and resistance profle， and the relationship between genetic diversity and cluster of C. albicans. Methods A total of 114 strains of C. albicans were collected from the Obstetrics & Gynecology Hospital of Fudan University， Shanghai First Maternity and Infant Hospital Corporation and the International Peace Maternity & Child Health Hospital of China welfare institute. Phylogenetic analysis of strains were carried out by eBURST. C. albicans strains were also analyzed by multilocus sequence typing （MLST）. The susceptibility of the C. albicans strains was tested by ATB FUNGUS 3. Results A total of 47 diploid strain types （DSTs） were identifed from the 114 strains， 30 of which were known types. DST 79 and DST 435 were the main types. Of the 114 C. albicans strains， 96.5% were susceptible to fucytosine， 100% to amphotericin B， 85.1% to fuconazole， 55.2% to itraconazole and 84.3% to voriconazole. Conclusions The pathogenic C. albicans strains isolated from different obstetrics and gynecology hospitals in Shanghai were originated from multiple clones， the main type of which was DST 79 and DST 435 with certain degree of antifungal resistance. MLST typing suggests that genetic diversity is present in the C. albicans strains isolated in Shanghai area. The clustering analysis of C. albicans strains is consistent with its genotypes.

Key words:C. albicans； multilocus sequence typing； genotyping