那璐，高俊峰，2，仇建華，李榮，邵志輝，張艷，王春仁

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

東方次睪吸蟲PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

那璐1，高俊峰1，2，仇建華1，李榮1，邵志輝1，張艷1，王春仁1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所）

為了快速準(zhǔn)確地檢測鴨、犬等動物東方次睪吸蟲的感染情況，根據(jù)GenBank中發(fā)表的東方次睪吸蟲ITS序列設(shè)計一對特異性引物，以糞便樣品中蟲卵DNA為模板，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，經(jīng)過敏感性、特異性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，建立檢測動物糞便中東方次睪吸蟲蟲卵的方法。結(jié)果，陽性樣品可擴(kuò)增得到260 bp的特異性條帶，華支睪吸蟲、卷棘口吸蟲、纖細(xì)背孔吸蟲DNA樣品檢測均為陰性，檢測到的最低蟲卵數(shù)為0.031 25個/克糞便，表明研究建立的PCR檢測方法具有較高的特異性和靈敏性。臨床檢測87份鴨糞樣本，其中6份為陽性，陽性率為6.9%，結(jié)果顯示大慶地區(qū)鴨子存在東方次睪吸蟲感染，所建立的方法適合于鴨子及其他家禽東方次睪吸蟲的檢測。

東方次睪吸蟲；PCR檢測方法；建立；應(yīng)用

東方次睪吸蟲（Metorchis orientalis）隸屬于后睪科（Opisthorchiidae）、次睪屬（Metorchis），主要寄生于雞鴨等禽類的膽管和膽囊內(nèi)，也可寄生于犬、貓，人也有感染的報道［1-2］。該病主要流行于我國，福建、黑龍江、安徽等10多個省區(qū)有感染的報道［1-4］。動物感染后會出現(xiàn)膽囊高度腫大，肝膽區(qū)疼痛、腹痛、腹瀉、體重減輕、消瘦、貧血等癥狀，嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡，給畜牧業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。

目前對該病的診斷主要是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，通過對蟲體和蟲卵進(jìn)行形態(tài)鑒定來確診。在實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)蟲卵較少或混合感染時容易造成漏檢或誤診；對解剖發(fā)現(xiàn)的成蟲進(jìn)行鑒定雖然準(zhǔn)確，但需要剖殺動物，還需要制作裝片才能確定。目前還未發(fā)現(xiàn)該病的免疫學(xué)診斷方法，因此我們迫切需要尋找一種快速、簡便、特異、敏感的方法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的人意識到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在臨床診斷中的有效應(yīng)用，從細(xì)菌到病毒再到寄生蟲，PCR秉承著其快捷、準(zhǔn)確、安全的優(yōu)點(diǎn)不斷進(jìn)步，不斷發(fā)展。因此，實(shí)驗(yàn)擬建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測東方次睪吸蟲蟲卵的PCR方法，并進(jìn)行臨床樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體

采自大慶市周邊鴨場糞便樣本若干份，-20℃保存；東方次睪吸蟲DNA及對照蟲體DNA：華支睪吸蟲DNA、卷棘口吸蟲DNA、纖細(xì)背孔吸蟲DNA均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.2 主要試劑

dNTP Mixture、Ex Taq酶和DNA Marker為大連寶生物（Takara）公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、Tris堿、Tris Base、EDTA、裂解液、液氮、蛋白酶K、Tris飽和酚（4℃保存）、三氯甲烷、醋酸鈉、無水乙醇、蒸餾水、酒精等為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

將GenBank上發(fā)表的東方次睪吸蟲ITS基因序列［5］與華支睪吸蟲等的ITS序列進(jìn)行對比，尋找突變區(qū)設(shè)計一對引物GN1。應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計引物，引物序列為GN1 F：5’-TGT ACC CAG TGT GTG TGC CT-3’和GN1 R：5’-GCA GTG AGA CAA GCT AGA CA-3’，預(yù)測擴(kuò)增大小為260 bp。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 糞便中蟲卵DNA的提取

參照王珍麗等［6］血吸蟲蟲卵DNA的快速提取法，進(jìn)行改良。

1.2.3 PCR進(jìn)行擴(kuò)增

以從鴨糞便中提取出的東方次睪吸蟲蟲卵（動物接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)成蟲為東方次睪吸蟲）的DNA為模板，利用設(shè)計的特異性引物對東方次睪吸蟲核糖體ITS部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，混入1 μL的6×Loading buffer，用移液槍混勻后加入配置好的1%瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳25 min，取出后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄下來。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

以東方次睪吸蟲DNA、華支睪吸蟲DNA、卷棘口吸蟲DNA、纖細(xì)背孔吸蟲DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)陰性對照。

1.2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

將感染寄生蟲的鴨子的陽性糞樣在顯微鏡下對蟲卵進(jìn)行計數(shù)，所檢的蟲卵依次為100個、10個和1個/克糞便，同時將每克糞便1個蟲卵提取的DNA模板倍比稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定最小蟲卵檢出量。

1.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為保證實(shí)驗(yàn)的可靠和準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取6個陽性樣品和6個陰性樣品，用建立的PCR方法進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測

采集黑龍江省大慶周邊個體養(yǎng)殖的鴨糞樣87份，應(yīng)用建立的PCR檢測方法對糞樣中東方次睪吸蟲蟲卵檢測。選擇檢測出的陰陽鴨子各2只進(jìn)行剖檢，以確定建立方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳觀察后，得出結(jié)果，從圖1可看出，只有東方次睪吸蟲在260 bp位置出現(xiàn)一條與預(yù)計片段大小相符的條帶，而華支睪吸蟲、卷棘口吸蟲、纖細(xì)背孔吸蟲和陰性對照組均未擴(kuò)增出目的條帶，表明該方法具有較好的特異性。

圖1 PCR特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR specific detection

2.2 敏感性實(shí)驗(yàn)

以100個、10個和1個蟲卵DNA按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀釋后DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果隨著DNA濃度的降低，目的條帶的亮度也越來越弱，在稀釋到1∶32之后，特異性條帶消失（圖2）。即確定每克糞便中含有0.031 25個蟲卵時為PCR檢測的最小劑量，表明該方法具有良好的敏感性。

圖2 PCR敏感性檢測擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of PCR sensitive detection

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取的6份陽性和陰性樣品，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示陽性樣品在260 bp的位置處出現(xiàn)了目的條帶，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們將實(shí)驗(yàn)重復(fù)幾次，最終得到的結(jié)果一致，證明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 臨床樣品的檢測

用建立的PCR診斷方法對大慶市周邊禽場的鴨子糞便進(jìn)行檢測，隨機(jī)提取87份糞便DNA，進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，6份經(jīng)PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)陽性條帶（圖3），感染率為6.9%。剖殺的2只陽性鴨子均在肝臟中檢出東方次睪吸蟲，而2只陰性鴨子沒有檢出蟲體。

圖3 部分樣品檢測結(jié)果Fig.3 The results of sample detection

3 討論

寄生蟲的準(zhǔn)確分類和鑒定是從事一切寄生蟲學(xué)和寄生蟲病學(xué)研究的基礎(chǔ)。由于一些寄生蟲有著十分相近的形態(tài)和發(fā)育史，給傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類和鑒定帶了一定的困難，阻礙了一些科研工作的順利進(jìn)行。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于病毒、真菌、細(xì)菌等各個領(lǐng)域［7-8］。寄生蟲學(xué)的研究也不例外，目前應(yīng)用也較多，特別是用于檢驗(yàn)動物糞便中蟲卵。如人蛔蟲卵、熊貓蛔蟲卵、犬細(xì)粒棘球絳蟲卵和日本血吸蟲蟲卵的檢測等［6，9-11］，然而對于東方次睪吸蟲蟲卵的檢測還未見報道。

研究中，通過網(wǎng)上已有的東方次睪吸蟲的基因序列，在其基因的變異區(qū)設(shè)計一對特異性引物，用來鑒別與東方次睪吸蟲形態(tài)極為相近的一些吸蟲。研究使用的樣品為來自糞便中的蟲卵，所以糞便中蟲卵DNA的成功提取為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。提取糞便中蟲卵的DNA方法有多種，其中一種方法是用商品試劑盒提取，雖效果很好，但成本較高。試驗(yàn)所用的方法為改良的有機(jī)溶劑提取法，不僅可以提取出較多量的DNA，同時可以濃縮出較為純凈的DNA。能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，同時具有簡單、方便、價格便宜和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)成功地建立了檢測家禽糞便中東方次睪吸蟲蟲卵的PCR方法，該方法與已知的陰陽樣品符合率為100%，具有快速、簡便、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，臨床樣本檢測顯示大慶地區(qū)鴨子存在東方次睪吸蟲感染。

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Establishment and App lication of PCR M ethods of Meotrchis orientalis

Na Lu1，Gao Junfeng1，2，Qiu Jianhua1，Li Rong1，Shao Zhihui1，Zhang Yan1，W ang Chunren1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science）

To establish a method for detecting Meotrchis orientalis，two specific primers were synthesized according to the sequence of ITS rDNA of M.orientalis on the GenBank to amplify the DNA in the eggs by optimizing PCR conditions，then evaluating sensitivity，specificity and repeatability.Finally，a method of detect ing M.orientalis was set up.The results showed that the obtained specific band was 260 bp，and under the same constraint，PCR assay was negative to Clonorchis sinensis，Echinostoma revolutum，Notocotylus attenuatus，Echinostoma revolutum DNA.The method’s minimum detect limit was 0.031 25 eggs DNA per gram feces.Among 87 clinical samples there were six positive samples，so the positive rate was 6.9%.The results indicated that there was M.orientalis in the poultry farm in Daqing city.The PCR method had high sensitivity and specificity，which could be used to diagnose M.orientalis in ducks and other poultry.

Metorchis orientalis；PCR method；establishment；application

S856.5

A

1002-2090（2016）03-0043-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.009

2015-03-28

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2014C033）；家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（SKLVEB2014KFKT006）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（201410223001）。

那璐（1988-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2012級碩士研究生。

王春仁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chunrenwang@sohu.com。