劉冬，邱婧云，王霞，鐘海清，萬(wàn)琳琳，楊清香，2，*（.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河南師范大學(xué)），河南新鄉(xiāng)453007）

ARTP誘變選育高產(chǎn)油脂酵母菌

劉冬1，邱婧云1，王霞1，鐘海清1，萬(wàn)琳琳1，楊清香1，2，*
（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河南師范大學(xué)），河南新鄉(xiāng)453007）

從實(shí)驗(yàn)室保藏的15株酵母中篩選獲得一株油脂產(chǎn)量相對(duì)較高的酵母菌KC 8，經(jīng)96 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，油脂產(chǎn)量為1.22 g/L。利用分子生物學(xué)鑒定，該菌株的26S rDNA序列與膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）具有100%相似性；以KC 8為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP誘變，最終從300株誘變存活菌株中篩選得到高產(chǎn)油脂突變菌株Y3，經(jīng)96 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，油脂產(chǎn)量為2.38g/L；對(duì)菌株Y3的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株在葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，碳氮比為90∶1，培養(yǎng)基初始pH為6.5時(shí)，在28℃恒溫條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，油脂產(chǎn)量最高達(dá)到了3.96 g/L；GC-MS對(duì)油脂組分進(jìn)行分析結(jié)果表明，該脂肪酸主要由棕櫚油酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸組成，與植物油成分相似。

酵母；油脂；ARTP誘變；脂肪酸組分

當(dāng)今世界，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，化石能源的大量消耗和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，人們迫切地尋求一種新的綠色能源來(lái)緩解這些危機(jī)，因此，生物柴油便應(yīng)運(yùn)而生。生物柴油具有低含硫量、易燃燒、可再生、儲(chǔ)運(yùn)安全等優(yōu)點(diǎn)，可以作為化石燃料的替代品［1］。目前，生物柴油的生產(chǎn)主要以動(dòng)植物油脂原料［2］，生產(chǎn)成本高，原料供應(yīng)不足等問(wèn)題始終制約著生物柴油的規(guī)模化生產(chǎn)。因此，必須發(fā)展新型、低成本的油脂生產(chǎn)技術(shù)，來(lái)解決生物柴油生產(chǎn)中的難題。

在自然界中，一些微生物能夠通過(guò)自身代謝將碳?xì)浠衔?、碳水化合物以及普通油脂等轉(zhuǎn)化為油脂，貯存在菌體細(xì)胞內(nèi)，我們通常將油脂的含量超過(guò)菌體自身生物總量20%的微生物稱為產(chǎn)油微生物［3］。產(chǎn)油微生物種類繁多，在細(xì)菌、真菌以及藻類中都能發(fā)現(xiàn)，在某些真菌中，其菌體內(nèi)的油脂含量甚至超過(guò)了生物量的70%。微生物油脂的脂肪酸組主要為C16、C18系脂肪酸（如硬脂酸、油酸和亞油酸），與植物油脂成分相似［4］。微生物自身生產(chǎn)油脂與傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)相比，具有生產(chǎn)周期短、成本低、不受季節(jié)、場(chǎng)地的限制，以及容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，對(duì)產(chǎn)油脂微生物的研究，并選育出高油脂產(chǎn)率微生物有著重大意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究人員通過(guò)從自然界中篩選、優(yōu)化培養(yǎng)基以及采用誘變等方式來(lái)獲得高油脂產(chǎn)率的產(chǎn)油菌株［5-8］，通過(guò)誘變育種的方式可以提高微生物的油脂產(chǎn)量。本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌中篩選得到一株油脂產(chǎn)率較高的酵母菌株作為誘變出發(fā)菌株，通過(guò)采用新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變處理，以獲得高油脂產(chǎn)率的突變株，并對(duì)獲得的高產(chǎn)油脂突變株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高其油脂產(chǎn)量。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

酵母菌：由河南師范大學(xué)資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，共15株。

斜面活化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，瓊脂20，pH自然。

種子液培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏0.5，（NH4）2SO42，KH2PO41，MgSO4·7 H2O 0.5，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa滅菌30 min。

1.2產(chǎn)油酵母菌菌株的篩選

取一環(huán)保藏菌種接種至斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h活化菌種。用5 mL無(wú)菌水將斜面菌種洗下，轉(zhuǎn)接入裝液量為20 mL/100 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)36 h，獲得種子液。按10%接種量接入裝液量50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)96 h。取少量菌液，采用蘇丹黑染色的方法對(duì)產(chǎn)油脂酵母進(jìn)行初篩［9］。然后將菌液8 000 r/min離心10 min，收集菌體測(cè)定酵母生物量和油脂產(chǎn)量，選用油脂產(chǎn)量最高的菌株做為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變育種，并對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定［10］。

1.3生物量的測(cè)定

菌體生物量的測(cè)定采用菌體干質(zhì)量法［11］。

菌體生物量/（g/L）=菌體干質(zhì)量（g）/發(fā)酵液體積（L）

1.4油脂的提取和產(chǎn)量測(cè)定［12］

取45 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3次，收集菌體，加入4 mol/L的鹽酸15 mL，混勻后室溫下浸泡1 h，沸水浴5 min后迅速冷卻，6 000 r/min離心10 min，去除HCl，向離心管中加入15 mL氯仿/甲醇（體積比1∶1）溶液，室溫下震蕩混勻，6 000 r/min離心10 min，取氯仿層，加入相同體積的0.1%的NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溶液，振蕩混勻，6 000 r/min離心10 min，用已知質(zhì)量的蒸餾瓶收集氯仿層后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將氯仿蒸干，再次稱量瓶中，得出油脂產(chǎn)量以及油脂產(chǎn)率。

將浸提液適當(dāng)稀釋后，利用分光光度計(jì)在487 nm處測(cè)定其吸光度值，然后按下式計(jì)算類胡蘿卜素的產(chǎn)量：

油脂產(chǎn)率/%=油脂產(chǎn)量/干菌體質(zhì)量×100

1.5酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［13］

菌株在斜面培養(yǎng)基上活化后，取一環(huán)接種至種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中從4 h后開(kāi)始，每隔2 h取樣測(cè)菌液在600 nm處的OD值，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.6誘變處理及正向突變菌株的篩選

菌懸液的制備：從斜面活化培養(yǎng)基上挑取適量菌體接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌3遍，重懸浮，制成菌體細(xì)胞濃度為108CFU/mL的菌懸液。

常壓室溫等離子體（ARTP）誘變：采用清華大學(xué)化工系自主研發(fā)的ARTP II常壓室溫等離子體誘變儀對(duì)菌懸液進(jìn)行誘變處理。固定儀器的電源功率、氣流量、等離子體發(fā)射源與菌懸液之間的距離等條件，將處理時(shí)間作為誘變的可變參數(shù)［14］。在本研究中ARTP的設(shè)定條件為：處理距離2 mm，處理功率120 W，氣流量10 SLM，處理時(shí)間分別為0、30、60、90、120、150、180 s，處理后菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋涂布到固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，計(jì)算致死率并繪制致死曲線。

正向突變菌株的篩選：首先通過(guò)蘇丹黑染色的方法對(duì)突變株進(jìn)行初篩，選取油脂含量較多的突變株，按照前述方法通過(guò)對(duì)突變株進(jìn)行生物量以及油脂產(chǎn)量測(cè)定來(lái)進(jìn)行高產(chǎn)油脂突變株的篩選。

1.7遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選獲得的高產(chǎn)油脂紅酵母菌株接種至斜面固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，共傳10代，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其生物量和油脂產(chǎn)量，檢測(cè)篩選得到的高產(chǎn)油脂菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.8培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)法研究不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖），不同氮源（硫酸銨、氯化銨、硝酸銨），不同碳氮比（30∶1、50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1）和不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對(duì)菌株產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.9油脂成分的分析

1.9.1油脂的甲酯化［15］

稱取提取的酵母油脂100 mg，向其加入2 mL的 0.6 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液和2 mL的正己烷，振蕩2 min，在室溫下放置15 min后，加入5 mL蒸餾水，靜置分層，取正己烷層，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后制得脂肪酸甲酯樣品，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）測(cè)定其脂肪酸組成。

1.9.2GC-MS試驗(yàn)條件［16］

GC條件：進(jìn)樣器240℃；程序升溫：初始溫度50℃，保留5 min；以10℃/min的速度升至170℃，保留10 min；以3℃/min的速度升至205℃，保留20 min；再以10℃/min的速度升至250℃，保留5 min；離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。

MS條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質(zhì)荷比掃描范圍35～450。

2　結(jié)果及分析

2.1產(chǎn)油脂酵母菌菌株的篩選及鑒定

按照材料方法所述從15株酵母菌中獲得一株生物量，油脂產(chǎn)量均較高的菌株KC 8，在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)96 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，其生物量為（14.02±0.15）g/L，油脂產(chǎn)量為（1.22±0.07）g/L。

對(duì)其26S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序（GenBank登錄號(hào)：KP760069）并在NCBI進(jìn)行Blast同源性檢索，結(jié)果表明與Rhodotorula mucilaginosa有100%的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）表明，KC 8與Rhodotorula mucilaginosa聚為一簇，因此該紅酵母菌株KC 8的鑒定結(jié)果為膠紅酵母（R.mucilaginosa）。

圖1　基于26S rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences

2.2菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

誘變處理一般選取對(duì)數(shù)期的菌株，此時(shí)菌體生長(zhǎng)狀況比較同步，代謝活性高而穩(wěn)定，生活力強(qiáng)，易變異且重復(fù)性好。菌株KC 8在種子液培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

由圖2可知，菌株KC 8在種子液培養(yǎng)基中28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至12 h～24 h期間處于對(duì)數(shù)期，本試驗(yàn)選取培養(yǎng)20 h后的菌液進(jìn)行誘變處理。

圖2 菌株KC 8在種子液培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2　The growth curve of initial strain KC 8 in seed culture

2.3ARTP誘變致死率曲線的測(cè)定

ARTP誘變的致死結(jié)果如圖3所示。

圖3誘變致死曲線Fig.3　The curve of mutation fatality rate

對(duì)酵母菌誘變處理時(shí)間在30 s到150 s范圍內(nèi)，隨著等離子體對(duì)菌體細(xì)胞的照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高。當(dāng)照射時(shí)間為120 s時(shí)，致死率為85%左右，而當(dāng)照射時(shí)間為150 s時(shí)，菌體細(xì)胞幾乎全部被殺死，致死率接近100%。當(dāng)致死率在85%左右時(shí)，有較高的正突變率［17］，因此選擇照射時(shí)間為120 s。

2.4高產(chǎn)油脂酵母菌株的篩選

按照方法1.6對(duì)紅酵母菌株KC 8進(jìn)行誘變處理，從誘變后獲得的突變株中挑選出300株生長(zhǎng)良好的菌株，測(cè)其生物量及油脂產(chǎn)量。通過(guò)對(duì)突變株的篩選，共獲得4株油脂產(chǎn)量明顯提高的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3、Y4，各自的生物量、油脂產(chǎn)量及產(chǎn)率如表1所示。

表1　各突變株的生物量、油脂產(chǎn)量及油脂產(chǎn)率Table 1　The biomass，oil yield and oil productivity of each mutant strain

ARTP誘變是一種新型誘變技術(shù)，和傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP誘變對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，獲得突變型多樣性的可能性較大，研究結(jié)果表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母等微生物［18-20］。由表1可以看出，篩選獲得的4株突變株的生物量以及油脂產(chǎn)量與出發(fā)菌株KC 8相比，均有不同程度的提高。其中，突變株Y 3的有著較高的生物量和油脂產(chǎn)量，分別是出發(fā)菌株KC 8的1.07倍和1.95倍。從表1可以看出，出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)ARTP誘變后，其生物量變化不是太大，而油脂產(chǎn)量卻有大幅升高。這與金麗華等［14］報(bào)道的利用ARTP誘變技術(shù)選育高產(chǎn)油脂的釀酒酵母研究中的結(jié)果相一致，因此，證明了新型的ARTP誘變技術(shù)對(duì)提高該紅酵母油脂產(chǎn)量的作用比較明顯。

2.5菌株Y3遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將菌株Y3傳代10次，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并分別測(cè)定每次傳代菌株的生物量和油脂產(chǎn)量，測(cè)定結(jié)果如表2所示，菌株的油脂產(chǎn)量比較穩(wěn)定，說(shuō)明該菌株的產(chǎn)脂穩(wěn)定性較好。

表2 突變株Y3的遺傳穩(wěn)定性Table 2　The hereditary stability of mutant strain Y3

2.6菌株Y3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.6.1碳源對(duì)菌株Y3油脂發(fā)酵的影響

分別選用了葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的單一碳源，其他條件不變，待其發(fā)酵96 h以后，測(cè)得不同碳源發(fā)酵條件下的菌株生物量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 碳源對(duì)菌株Y3的油脂發(fā)酵的影響Fig.4　Effect of carbon source on fermentation efficiency of the strain Y3

葡萄糖和蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的單一碳源時(shí)，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量均較高，其中以蔗糖為碳源時(shí)，菌體的生物量最高，為（15.09±0.10）g/L，以葡糖糖為碳源時(shí)，菌體的油脂產(chǎn)量最高，為（2.37±0.02）g/L，當(dāng)以麥芽糖為碳源時(shí)，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量均為最低，分別為（9.32±0.12）g/L和（1.07±0.08）g/L。因此，菌株Y3發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為葡萄糖。

2.6.2氮源對(duì)菌株Y3油脂發(fā)酵的影響

以葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，分別選用硫酸銨、氯化銨、硝酸銨作為氮源，其他條件不變，發(fā)酵96 h以后，測(cè)得不同碳源發(fā)酵條件下的菌株生物量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 氮源對(duì)菌株Y3的油脂發(fā)酵的影響Fig.5　Effect of nitrogen source on fermentation efficiency of the strain Y3

菌株Y3以硫酸銨為氮源時(shí)，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量均為最高，分別為（15.02±0.11）g/L，（2.34±0.03）g/L，說(shuō)明硫酸銨為該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基分別以氯化銨和硝酸銨作當(dāng)?shù)磿r(shí)，菌體的生物量和油脂產(chǎn)量差別不大，但均不是最高，說(shuō)明菌株Y3對(duì)氯化銨和硝酸銨的利用效率不如硫酸銨。

2.6.3碳氮比對(duì)菌株Y 3油脂發(fā)酵的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源即 （NH4）2SO4的用量，以葡萄糖（碳源）為變量，分別測(cè)定菌株Y 3在碳氮比為30∶1、50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后，菌體的生物量以及油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 碳氮比對(duì)菌株Y3油脂發(fā)酵的影響Fig.6　Effect of carbon-to-nitrogen ratio on fermentation efficiency of the strain Y3

當(dāng)碳氮比在30∶1到70∶1范圍內(nèi)時(shí)，菌體的生物量隨著碳氮比的增大而逐漸升高，并在碳氮比為70∶1時(shí)達(dá)到最大值，為（15.73±0.11）g/L。而當(dāng)碳氮比為90∶1，生物量開(kāi)始下降，說(shuō)明當(dāng)培養(yǎng)基中的氮源過(guò)少時(shí)，不利于菌體的生長(zhǎng)，但是此時(shí)，菌體的油脂產(chǎn)量卻達(dá)到了最大值，為（3.95±0.07）g/L，說(shuō)明當(dāng)培養(yǎng)基中氮源缺乏而碳源充足時(shí)，更有利于菌體油脂的積累。

2.6.4培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株Y3油脂發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，碳氮比為90∶1，用鹽酸和氫氧化鈉分別調(diào)至pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分別測(cè)定菌株Y3在不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)集中發(fā)酵96 h后的菌體生物量和油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株Y3油脂發(fā)酵的影響Fig.7　Effect of initial pH on ermentation efficiency of strain Y3

培養(yǎng)基的初始pH的過(guò)低或者過(guò)高都不利于菌株的生長(zhǎng)和油脂的積累，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.5時(shí)，菌株的油脂產(chǎn)量達(dá)到了最大值，為（3.96±0.03）g/L，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH為6.5。

從對(duì)菌株Y3的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果可以看出，菌株Y3油脂發(fā)酵的最適碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，碳氮比為90∶1，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5，在該發(fā)酵條件下，菌株Y3經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，菌株的生物量為（14.98±0.11）g/L，油脂產(chǎn)量為（3.96± 0.05）g/L，油脂含量占菌體干重的26.4%。

2.7油脂的組分分析

采用GC-MS對(duì)制得的脂肪酸甲酯化樣品進(jìn)行上樣分析，菌株Y3所產(chǎn)的油脂脂肪酸甲酯的總離子流圖見(jiàn)圖8。

圖8　菌株Y3菌體油脂脂肪酸甲酯的總離子流圖Fig.8　Total ion chromatogram for fatty acid methyl esters of Y3

從圖8可以看出，各種脂肪酸甲酯都得到了分離，共分離出6種（具體組分見(jiàn)表3）。

油脂組分測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3　菌株Y3菌油脂脂肪酸組成及相對(duì)含量Table 3　Fatty acid composition and relative content of strain Y3

菌株的脂肪酸主要由C16和C18的脂肪酸組成，占脂肪酸總量的91.87%。該脂肪酸中包含了飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中油酸的含量最高，占脂肪酸總量的70.21%，其次是棕櫚油，占脂肪酸總量的14.57%，二十碳烯酸和二十四烷酸的含量較少，分別占脂肪酸總量1.06%、1.61%。從測(cè)定結(jié)果可以看出，該脂肪酸組成與植物油成分相似，因此可以替代植物油來(lái)生產(chǎn)生物柴油，很好的解決了生物柴油生產(chǎn)中原料不足的問(wèn)題。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的紅酵母進(jìn)行篩選，得到了一株油脂產(chǎn)量較高的紅酵母菌株KC 8，經(jīng)鑒定為膠紅酵母（R.Mucilaginosa），其類油脂產(chǎn)量為（1.22± 0.07）g/L；對(duì)菌株KC 8進(jìn)行ARTP誘變，篩選獲得一株高產(chǎn)油脂的突變菌株Y3，油脂產(chǎn)量為（2.38±0.02）mg/L；對(duì)菌株Y3的培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明，該菌株油脂發(fā)酵的最適碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，碳氮比為90∶1，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5，在該發(fā)酵條件下，菌株Y3經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，菌株的生物量為（14.98± 0.11）g/L，油脂產(chǎn)量為（3.96±0.05）g/L，油脂含量占菌體干重的26.4%；GC-MS對(duì)油脂組分進(jìn)行分析結(jié)果表明，該脂肪酸主要由棕櫚油酸、油酸、亞油、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸組成，與植物油成分相似，菌株Y3是一株遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)油脂能力強(qiáng)的酵母菌株，可以用來(lái)替代植物油生產(chǎn)生物柴油，具有良好開(kāi)發(fā)前景。

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Mutation Breeding of Yeast with High Lipid Production by Atmospheric and Room Temperature Plasmas

LIU Dong1，QIU Jing-yun1，WANG Xia1，ZHONG Hai-qing1，WAN Lin-lin1，YANG Qing-xiang1，2，*
（1.College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China；2.Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules（Henan Normal University），Xinxiang 453007，Henan，China）

A high lipids producing strain，KC 8，was selected from 15 yeast strains which were stored in our lab.KC8 could produce 1.22 g/L lipids after 96 h flask fermentation.Analysis on the 26S rDNA sequence indicated that KC 8 had 100%identity with Rhodotorula mucilaginosa.Using KC 8 as a starting strain，atmosphericand room temperature plasma（ARTP）was used to induce mutation for screening strains of higher lipids production.Finally，Y 3 was obtained from 300 strains of screening.The yield of lipid was 2.38 g/L after 96 hours flask fermentation by Y 3.After optimized the fermentation conditions，the lipid productivity reached 3.96 g/L under the following conditions：glucose as carbon source，（NH4）2SO4as nitrogen source，ratio of carbon to nitrogen at 90∶1，initial pH 6.5，incubated at 28℃for 96 h shaking fermentation.Gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）analysis indicated that the fatty acids were mainly composed of palmic acid，oleic acid，linoleic acid，stearic acid，eicosenoic acid and tetracosanoic acid.The compositions of fatty acids were similar to those of vegetable oil．

yeast；lipid；atmospheric and room temperature plasma mutation；fatty acid composition

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.042

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.NSFC21077032；NSFC21277041）；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（No.13IRTSTHN009）作者簡(jiǎn)介：劉冬（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物。
*

楊清香（1966—），女（漢），教授，博士，研究方向：環(huán)境微生物。

2015-05-06