郭瑜，姚笛，侯婷婷，張微，佐兆杭，劉鑫，郭德軍（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

乳中志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

郭瑜，姚笛，侯婷婷，張微，佐兆杭，劉鑫，郭德軍
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

為了快速、有效的檢測(cè)乳中的志賀氏菌，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的熒光定量PCR方法。根據(jù)GenBank公布的志賀氏菌ipaH基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)提取的志賀氏菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，然后利用熒光定量PCR方法，對(duì)志賀氏菌進(jìn)行檢測(cè)，確定其擴(kuò)增條件。建立的方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到10-6ng/μL。利用建立的方法可檢測(cè)乳中2.84 cfu/mL的志賀氏菌。該方法為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)乳中的志賀氏菌提供了參考。

熒光定量PCR；志賀氏菌；ipaH基因

牛乳作為一種理想的營(yíng)養(yǎng)食品被人們廣泛食用，人們對(duì)乳及乳制品的需求量也在逐年增加，同時(shí)牛乳也是一種最易遭受病菌污染發(fā)生腐敗變質(zhì)的食品之一。因此，乳品安全問題成為社會(huì)各界關(guān)注的焦點(diǎn)。目前牛奶最主要的污染致病菌就是細(xì)菌，特別是腸道致病菌志賀氏菌（Shigella），該種細(xì)菌在低溫環(huán)境下可存活，在牛奶中可生存1周～2周。

志賀氏菌是引起人類細(xì)菌性痢疾的腸道病原菌，為革蘭氏陰性桿菌，具有高度傳染性，主要傳播途徑是消化道［1-2］，據(jù)調(diào)查，全球每年有1.6億人患病，大約有110萬(wàn)人死亡，其中絕大多數(shù)是兒童［3-4］。在我國(guó)最為常見的是由福氏和宋內(nèi)志賀菌引起的菌痢，并且在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)分布廣泛，成為各地衛(wèi)生部門重點(diǎn)檢測(cè)的對(duì)象。而在我國(guó)廣大農(nóng)村地區(qū)的衛(wèi)生條件差，經(jīng)常會(huì)因水源或食品受到志賀氏菌污染而引起痢疾、腹瀉等疾病爆發(fā)［5-6］。志賀氏菌有較強(qiáng)的附著力和侵襲力，能分泌內(nèi)、外毒素，可引起腹痛，腹瀉，局部黏膜炎癥，壞死和潰瘍等癥狀［7］。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的志賀氏菌檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，常規(guī)的志賀氏菌檢測(cè)方法有微生物法、理化法和免疫法等，但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)志賀氏菌的檢驗(yàn)方法大多用培養(yǎng)法和生化鑒定法，這些方法存在著操作步驟繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、容易出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn)［8］。因此，本研究根據(jù)志賀氏菌的ipaH［9］基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立志賀氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，可為志賀氏菌的快速檢測(cè)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella sonnei）標(biāo)準(zhǔn)菌株：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑

LB培養(yǎng)基為青島海博公司產(chǎn)品；TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL）、rTaq（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTPs （10 mmol/L）、DL2000DNAMarker、6×Loading Buffer、10×Loading Buffer、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）：TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒等：廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器

9700型PCR基因擴(kuò)增儀：基因有限公司；JY04S-3B電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；YJ600+型凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳有限公司；Line-Gene K型Real-Time PCR儀：杭州博日科技有限公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制造廠。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)

將宋內(nèi)氏志賀氏菌接種于固體LB培養(yǎng)基中，37℃，24 h，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)。

1.2.2DNA模板的制備

熱裂解法：取培養(yǎng)液1.0 mL，置于1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心2 min，滅菌ddH2O洗劑兩次，最后300 μL ddH2O懸浮，隔水煮沸15 min，8 000 r/min離心15 min，取上清，即為DNA模板［10］。

1.2.3引物的合成

根據(jù)GenBank公布的志賀氏菌ipaH基因的保守序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段大小為167 bp。

上游引物：5'-GAGACCTAAACAAGATAAGTCCAAC-3'

下游引物：5'-CCTAATAAATGTCCTTCGTATCGC-3'

1.2.4目的基因的擴(kuò)增和純化

以提取的志賀氏菌DNA為模板，應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行回收純化，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.5目的基因的克隆

將純化后的目的基因與pMD-18 T載體混合均勻，16℃連接2 h，取1 μL的連接產(chǎn)物加入100 μL E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，取適量均勻涂布于Amp+的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取平板中的單個(gè)菌落，接種于Amp+的LB液體培養(yǎng)液中，37℃180 r/min振搖過夜。按照說明書操作提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.6重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度C值，計(jì)算出原始拷貝數(shù)，然后進(jìn)行倍比稀釋，取不同稀釋度的質(zhì)粒模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。定量PCR的反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Tap（2X）（Tli RNaseH Plus）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為94℃30 s滅活酶，95℃5 s變性，60℃20 s退火、延伸，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7特異性檢測(cè)

利用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌4種感染人的食品病原細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定志賀氏菌熒光定量PCR方法的特異性。

1.2.8靈敏性檢測(cè)

測(cè)定所提取的志賀氏菌DNA的濃度，用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，取不同稀釋度的樣品2 μL進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測(cè)定其最低檢測(cè)值。

1.2.9模擬標(biāo)本的檢測(cè)

將志賀氏菌制備一定濃度的菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋，測(cè)定菌落總數(shù)，將滅菌的牛乳中摻入志賀氏菌，使乳中菌含量為28.4、2.84×102、2.84× 103、2.84×104cfu/mL，混勻后提取DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

2　結(jié)果與分析

2.1志賀氏菌的ipaH基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

以志賀氏菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ipaH基因，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1ipaH基因的PCR擴(kuò)增Fig.1　PCR amplification of ipaH gene

由圖1可知，擴(kuò)增帶大小與預(yù)期的結(jié)果一致。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化后，提取重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，其鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2ipaH基因重組質(zhì)粒的PCR結(jié)果Fig.2　ResuLts the recombinant plasmid of ipaH gene of PCR

將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果可知擴(kuò)增產(chǎn)物與志賀氏菌的ipaH基因的相應(yīng)區(qū)域的同源性為100%。

2.2熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

將重組質(zhì)粒10倍倍比稀釋，取濃度依次為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109copies/μL，分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3　標(biāo)準(zhǔn)模板的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.3　Dynamic amplification curve of real-time PCR for standard template of Shigella

根據(jù)得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4，方程為y=-3.416 0x+ 40.552，相關(guān)系數(shù)為0.998，表明在稀釋的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。

在SYBR GreenⅠ熒光定量PCR后進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果見圖5。

圖4　標(biāo)準(zhǔn)模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of real-time PCR with standard template

圖5　標(biāo)準(zhǔn)模板的熔解曲線Fig.5　Melting curve of real-time PCR with standard template

由熒光定量PCR的熔解曲線可知，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度都為81℃。

2.3熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)

采用熒光定量PCR方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖6。

圖6　志賀氏菌熒光定量的特異性檢測(cè)Fig.6　Specificity detection of real-time PCR for Shigella

結(jié)果表明：除志賀氏菌出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽(yáng)性外，其他細(xì)菌均未出現(xiàn)曲線擴(kuò)增、結(jié)果為陰性。說明本研究建立的方法對(duì)志賀氏菌有很好的特異性，與其他相關(guān)細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2.4熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)

將志賀氏菌DNA用dd H2O10倍梯度稀釋成1× 10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7ng/μL的濃度，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示其靈敏度為1×10-6ng/μL。當(dāng)DNA的濃度只有1×10-6ng/μL時(shí)，根據(jù)公式copies/μL= （6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA length×660）計(jì)算出拷貝數(shù)為5.46×104copies/μL，依然可以檢測(cè)的到，說明熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)志賀氏菌的穩(wěn)定性好、靈敏度極高。

2.5模擬標(biāo)本的檢測(cè)

滅菌的牛乳中摻入志賀氏菌，使乳中菌的含量為2.84、2.84×101、2.84×102、2.84×103cfu/mL，采用熒光定量PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖7。

由圖7可知：當(dāng)乳中菌的含量只有2.84cfu/mL時(shí)［11］，依然可以檢測(cè)到，說明該方法的靈敏度極好。

圖7模擬標(biāo)本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.7　Amplification curve of real-time PCR for simulation specimens

3　討論

在我國(guó)，志賀氏菌在感染性腹瀉病原菌中居于首位，是一類有著高度傳染性和危害性的腸道致病菌。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳中致病菌的檢驗(yàn)大多用培養(yǎng)法和生化鑒定法進(jìn)行檢測(cè)，這種方法存在著操作步驟繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、容易出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn)。乳膠凝集法、免疫磁珠分離法、酶免疫測(cè)定等免疫學(xué)方法雖然能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法中的一些不足，但仍存在誤差大、周期長(zhǎng)的局限性。用基因探針檢測(cè)則存在檢測(cè)費(fèi)用昂貴的缺點(diǎn)［8］。熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)的應(yīng)用有效地克服了以上技術(shù)的諸多缺點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)多種致病菌，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，并且在疾病的診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景［12］。

熒光定量PCR檢測(cè)志賀氏菌的全部操作過程需要3 h左右，不僅大大提高了工作效率，并且除了需開蓋加樣，其他的全部過程都在密閉的PCR管中實(shí)現(xiàn)，有效的避免了由電泳帶來的誤差。本研究建立的熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)過對(duì)志賀氏菌及3種相關(guān)細(xì)菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，志賀氏菌的重組質(zhì)粒在濃度在1×105到1× 109copies/μL之間時(shí)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998，檢測(cè)的靈敏度達(dá)1×10-6ng/μL，計(jì)算得出拷貝數(shù)為5.46×104copies/μL，且與其他3種相關(guān)細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)。當(dāng)乳中志賀氏菌的含量為28.4 cfu/mL，依然可檢測(cè)的出，具有的準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)，為建立乳中志賀氏菌的檢測(cè)體系提供了一種高效、便捷、可靠的新技術(shù)，擁有較高的應(yīng)用及推廣價(jià)值，該熒光定量PCR診斷方法也會(huì)在今后試驗(yàn)和應(yīng)用中不斷地得到完善。

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Establishment of Real-time PCR Method for Detection of Shigella in Milk

GUO Yu，YAO Di，HOU Ting-ting，ZHANG Wei，ZUO Zhao-hang，LIU Xin，GUO De-jun
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

For fast，effective detection of Shigella in milk，a strong specificity，high sensitivity real-time PCR method was established.The specific primers were designed according to the conserved sequence of Shigella ipaH gene published in GenBank，the extracted Shigella DNA template was amplified by PCR，the target gene was cloned and sequenced，then using the fluorescent quantitative PCR method，to detect Shigella，determine the amplification conditions.The established method specificity is high，the detected sensitivity reach 10-6ng/μL. Using the method of Shigella in milk can be detected at 28.4 cfu/mL.The method provides a reference for fast，accurate detection Shigella in milk.

Real-time PCR；Shigella；ipaH gene

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.032

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（HNK11A-10-03201410223014）

郭瑜（1993—），女（漢），本科，食品質(zhì)量與安全專業(yè)。

2015-04-12