賈東升，李榮喬，謝曉亮，溫春秀，崔施展，劉銘，劉靈娣（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶澄清酸棗汁工藝的研究

賈東升，李榮喬，謝曉亮*，溫春秀，崔施展，劉銘，劉靈娣
（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

優(yōu)化果膠酶澄清酸棗汁的工藝。試驗(yàn)以酸棗汁中果膠含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取酶解pH、酶解溫度、果膠酶用量以及酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化果膠酶澄清酸棗汁工藝。試驗(yàn)建立了回歸方程，即果膠含量Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+ 14.65A2+39.16B2+40.00C2+42.06D2。通過響應(yīng)面分析得到了果膠酶的最佳酶解條件：酶解pH 4.5、酶解溫度55℃、果膠酶用量0.31%、酶解時(shí)間1.5h，在此條件下，酸棗汁中果膠含量降至170.273mg/L，降解率為65.54%，與模型預(yù)測值之間具有較好的擬合性。果膠酶澄清酸棗汁效果明顯，本研究所得為酸棗汁澄清工藝提供了良好的技術(shù)參數(shù)。

酸棗汁；果膠；果膠酶；響應(yīng)面；澄清

酸棗是我國北方山區(qū)較為普遍的一種野生果樹資源，含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、多酚以及鈣、鐵等礦質(zhì)元素［1-3］，具有生津止渴、開胃健脾、養(yǎng)精益氣等功能，據(jù)中醫(yī)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，酸棗可以“安五臟，輕身延年”［4-5］。用酸棗制作的酸棗汁口感酸甜，營養(yǎng)豐富，在生產(chǎn)過程中，由于處理不當(dāng)，酸棗汁容易出現(xiàn)后渾濁和沉淀現(xiàn)象，影響了產(chǎn)品的外觀品質(zhì)并降低了其市場價(jià)值。多項(xiàng)研究表明，果汁中的果膠可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用，形成沉淀。另外，果膠類物質(zhì)的存在會使混濁粒子保持穩(wěn)定的膠體體系而不易沉降，長期放置后渾濁粒子會逐漸沉淀，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)［6］。因此在果汁加工中，應(yīng)該考慮果汁中果膠對產(chǎn)品的影響，盡量將其去除。目前果汁中果膠的去除主要包括過濾以及果膠酶酶解兩種方法［7］，由于超濾過程中果膠容易堵塞濾膜而影響過濾效率，因此果汁超濾之前會先采用果膠酶脫膠［8-10］以提高過濾效率。本研究采用果膠酶處理酸棗汁并采用響應(yīng)面試驗(yàn)［11-12］優(yōu)化果膠酶酶解工藝，以期避免酸棗汁后渾濁和沉淀現(xiàn)象的發(fā)生。

1　材料和方法

1.1儀器、材料與試劑

1.1.1儀器

752PC紫外/可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；HHW-21CU-600水浴鍋：上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；3K18離心機(jī)：Sigma。

1.1.2材料

酸棗：河北邢臺。

1.1.3試劑

果膠酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司，食品級；半乳糖醛酸：上海源葉生物科技有限公司，分析純；咔唑：上海瑞永生物科技有限公司，分析純；無水乙醇：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純；氫氧化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純；濃硫酸：北京市化學(xué)試劑公司，分析純；α-萘酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2方法

1.2.1酸棗汁制備

稱取酸棗40 g，清洗，將其破碎，破碎程度以表皮破裂而保持酸棗果體完整為度，然后在料液比為1∶20（g/mL）、浸提溫度為90℃的條件下保溫浸提2 h。雙層濾紙抽濾，冷卻。

1.2.2酸棗汁中果膠含量測定

酸棗汁中果膠含量測定采用咔唑比色法［13-14］。

1.2.2.1果膠質(zhì)的沉淀

取15 mL酸棗汁于50 mL刻度離心管中，加入95%熱（75℃）乙醇溶液25 mL，在85℃水浴中加熱10 min，充分?jǐn)嚢?，再加?5%乙醇定容至50 mL，5 000 r/min離心15 min，棄去上清，用85℃的63%乙醇洗滌沉淀，離心并棄去上清，此步驟重復(fù)操作，直至清液中不再產(chǎn)生糖反應(yīng)。

1.2.2.2果膠總量提取液的制備

將制備的果膠沉淀全部洗入100 mL容量瓶中，加入5 mL 1 mol/L氫氧化鈉并用水定容至刻度，混勻，放置15 min并不時(shí)搖蕩，過濾后濾液用于比色測定。

1.2.2.3比色測定

取大試管，加入1 mL果膠提取液，再加入0.5 mL 0.1%咔唑乙醇溶液，不斷搖動(dòng)試管，再加入6 mL濃硫酸，立刻將試管放入85℃水浴中5 min，再使之冷卻15 min，然后立即用分光光度計(jì)在525 nm波長處用試劑空白調(diào)零，測定吸光值。

1.2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取半乳糖醛酸100 mg于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，并用水定容至刻度，取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL分別注入100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得1組濃度為10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按1.2.2.3方法步驟測量，以吸光值為縱坐標(biāo)、半乳糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5果膠含量與降解率計(jì)算

果膠的含量以mg/L為單位表示，分別按式（1）和式（2）計(jì)算果膠含量與降解率。

1.2.3果膠酶單因素酶解工藝

影響果膠酶澄清效果的因素主要有酶解pH、酶解溫度、果膠酶用量（以酸棗干重計(jì)）以及酶解時(shí)間，本研究選取這4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其中pH水平分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5；酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65、70℃；果膠酶用量分別為0.10%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%；酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，以酸棗汁中剩余果膠含量為指標(biāo)，篩選出各因素的較優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化果膠酶酶解工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)因素及水平，以酸棗汁中剩余果膠含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化果膠酶酶解工藝，試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels for Box-Behnken experiment

2　結(jié)果與分析

2.1果膠含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

果膠含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.009x-0.051。其中Y為吸光值，x為半乳糖醛酸濃度（μg/mL）。

2.2果膠酶單因素酶解試驗(yàn)

2.2.1pH對果膠酶酶解效果的影響

pH對果膠酶酶解效果的影響見圖1。

圖1　pH對果膠酶酶解效果的影響Fig.1　The effect of pH on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由圖1可以看出，酸棗汁中果膠含量隨果膠酶酶解pH的變化先降低后升高。pH從2.5升至4.5時(shí)，果膠水解率逐漸增強(qiáng)，酸棗汁中果膠含量逐漸降低；pH 從4.5升至9.5時(shí)，果膠水解率逐漸降低，酸棗汁中果膠含量逐漸升高；因此確定果膠酶的最適酶解pH為4.5。2.2.2酶解溫度對果膠酶酶解效果的影響

酶解溫度對果膠酶酶解效果的影響見圖2。

圖2　酶解溫度對果膠酶酶解效果的影響Fig.2　The effect of temperature on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由圖2可知酸棗汁中果膠含量隨果膠酶酶解溫度的變化先降低后升高。溫度從40℃升至55℃時(shí)，果膠水解率逐漸升高，酸棗汁中果膠含量逐漸降低；溫度繼續(xù)從55℃升至70℃時(shí)果膠水解率逐漸降低，酸棗汁中果膠含量逐漸升高，水解率逐漸降低，因此確定果膠酶的最適作用溫度為55℃。

2.2.3果膠酶用量對果膠酶酶解效果的影響

果膠酶用量對果膠酶酶解效果的影響見圖3。

由圖3可知，酸棗汁中果膠含量隨果膠酶添加量的增加逐漸降低，當(dāng)添加量達(dá)到0.3%時(shí)變化不再明顯，下降趨勢放緩，因此確定果膠酶添加量為0.3%。

2.2.4酶解時(shí)間對果膠酶酶解效果的影響

酶解時(shí)間對果膠酶酶解效果的影響見圖4。

圖3　果膠酶用量對果膠酶酶解效果的影響Fig.3　The effect of enzyme amount on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

圖4　酶解時(shí)間對果膠酶酶解效果的影響Fig.4　The effect of enzymolysis time on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由圖4可知，酸棗汁中果膠含量隨果膠酶作用時(shí)間的延長而逐漸降低，酶解1.5 h后含量變化趨勢趨于平緩，因此確定酶解時(shí)間為1.5 h。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以酸棗汁中果膠含量為響應(yīng)值，選擇酶解pH、酶解溫度、果膠酶用量以及酶解時(shí)間作為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Experiment design and results of response surface methodology

續(xù)表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2　Experiment design and results of response surface methodology

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，得到回歸方程：果膠含量Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+14.65A2+39.16B2+ 40.00C2+42.06D2。

回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表3，回歸方程可信度分析見表4。

表3　回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3　Results of regression analysis

表4　回歸方程可信度分析Table 4　The credibility analysis of the regression equation

由表3和表4可知，本研究模型項(xiàng)P值＜0.001，極顯著，模型失擬項(xiàng)P值為0.069 8，不顯著，說明模型可用；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5，矯正相關(guān)系數(shù)為0.999 0，預(yù)測相關(guān)系數(shù)為0.997 4，說明僅有0.001%的變異不能由該模型解釋，模型擬合度較好；信噪比為128.270 4，大于4，說明該模型可用于優(yōu)化果膠酶的酶解工藝；變異系數(shù)為0.41%，較小，說明本研究試驗(yàn)穩(wěn)定性好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。

由表3可知，果膠酶用量、果膠酶用量與酶解時(shí)間的交互作用、果膠酶用量與酶解pH的交互作用、果膠酶用量與酶解時(shí)間的交互作用以及4個(gè)因素的二次項(xiàng)對果膠酶酶解效果影響極顯著；果膠酶酶解溫度對果膠酶酶解效果影響顯著；酶解時(shí)間、pH、酶解時(shí)間與pH的交互作用、酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用以及pH與酶解溫度的交互作用對果膠酶酶解效果無顯著影響。

各因素交互作用對果膠酶酶解效果的影響見圖5。

由圖5可知，4個(gè)因素水平選值合理，回歸模型存在最大值，最佳落點(diǎn)在試驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)。由該模型預(yù)測得到的最佳酶解工藝為：酶解pH 4.5、酶解溫度55.04℃、果膠酶用量0.31%、酶解時(shí)間1.5 h，在此工藝條件下，酸棗汁經(jīng)酶解后果膠含量為166.552 mg/L。2.4果膠酶酶解工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的可靠性，采用修正的酶解條件：酶解pH 4.5、酶解溫度55℃、果膠酶用量0.31%、酶解時(shí)間1.5 h，平行試驗(yàn)3次。3次試驗(yàn)所得果膠含量平均值為170.273 mg/L，與理論預(yù)測值非常接近，相對誤差為2.19%，較小，證明該回歸模型可靠，該模型可用于果膠酶酶解工藝的優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5　各因素的交互作用對果膠酶酶解效果的影響Fig.5　Response surfaces showing the interactive effects of factors on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

3　結(jié)論

果膠酶澄清酸棗汁工藝中，酶解pH、酶解溫度、果膠酶用量以及酶解時(shí)間均對酶解效果有影響。通過單因素以及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到了果膠酶的最佳酶解工藝條件：酶解pH 4.5、酶解溫度55℃、果膠酶用量0.31%、酶解時(shí)間1.5 h，在此條件下，酸棗汁中果膠含量降至170.273 mg/L，降解率為65.54%，效果明顯，本研究為酸棗汁澄清工藝提供了良好的技術(shù)參數(shù)。

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Optimization of Process Conditions of Wild Jujube Juice Clarification by Pectinase Using Response Surface Methodology

JIA Dong-sheng，LI Rong-qiao，XIE Xiao-liang*，WEN Chun-xiu，CUI Shi-zhan，LIU Ming，LIU Ling-di
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Medicinal Herbs Research Center，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

The study focused on the optimization of process conditions of wild jujube juice clarification by pectinase.The contents of pectin was used as response value，pH，temperature，enzyme amount，enzymolysis time were choosed as variables.According to the principle of Box-Behnken experimental design，the three variables at four selected levels were optimized by response surface methodology.A mathematical regression model was established，Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+ 14.65A2+39.16B2+40.00C2+42.06D2.Results showed that the optimum process conditions were found to be enzymolysied at 55℃with a total enzyme dosage of 0.31%and 1.5 h under the hydrolysis pH 4.5.under this condition，contents of pectin decreased to 170.273 mg/L，which was well matched with the predicted value，the degradation rates of pectin were 65.54%.Pectinase had an obvious effect on the clarification of wild jujube juice，this study provided good process parameters for the clarification of wild jujube juice.

wild jujube juice；pectin；pectinase；responsesurface methodology；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.023

河北太行山區(qū)特色功能保健食品的開發(fā)研究（11231005D）作者簡介：賈東升（1982—），男（漢），碩士研究生，主要從事中藥功能食品研究。
*

謝曉亮（1962—），男，研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究。

2015-04-05