李京京，孫文佳，閔偉紅，*（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118）

基礎(chǔ)研究

長白山榛子抗氧化肽制備及其活性研究

李京京1，2，孫文佳1，2，閔偉紅1，2，*
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118）

以長白山榛子分離蛋白為原料，采用堿性蛋白酶制備抗氧化肽，通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)確定最佳水解工藝條件為：酶解溫度50℃、加酶量8 000 U/g、底物濃度5.0%、pH9.5。對(duì)該條件制備的抗氧化肽進(jìn)行活性研究，結(jié)果顯示隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽在4mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基和DPPH清除率均達(dá)到100%，8mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率和總還原能力分別達(dá)到85.46%和0.859，12mg/mL時(shí)，對(duì)Fe2+螯合率達(dá)到99.3%。

榛子分離蛋白；抗氧化肽；酶解工藝優(yōu)化；抗氧化活性

人體過量積累自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織受損、糖尿病和冠狀動(dòng)脈硬化等許多慢性疾?。?-2］。與人工合成的抗氧化劑相比，植物蛋白酶解得到的抗氧化肽，因其易于人體吸收和安全無副作用更受人們的青睞［3-5］。其抗氧化機(jī)理包括：為抗氧化酶提供氫、緩沖生理pH、螯合金屬離子和捕捉自由基等［6］。

榛子（corylus heterophylla fisch.ex trantv），與扁桃、核桃、腰果并稱“四大堅(jiān)果”，在中國東北地區(qū)分布尤為廣泛。榛子仁不僅口味佳而且營養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及維生素和多種礦物質(zhì)。其中脂肪57.1%～62.1%，蛋白質(zhì)16.2%～21.12%，碳水化合物6.5%～9.3%。榛子仁除可直接食用或添加到食品中外，還可以榨油。目前國內(nèi)對(duì)榛子的研究主要集中在榛子油，榛子果奶以及榛子蛋白等方面［7］。國外對(duì)榛子的研究則集中在過敏原方面［8-10］，對(duì)蛋白和多肽的研究普遍較少。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解制備榛子抗氧化肽進(jìn)行工藝優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上研究其抗氧化活性，為榛子蛋白的充分利用和榛子多肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

榛子分離蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制。DPPH、ABTS、菲洛嗪：購于sigma公司；Alcalase 2.4L，堿性蛋白酶：購于丹麥諾維信公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津；SPECTRA-MAX190型酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；ZD-2型自動(dòng)電位滴定計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA224S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）儀器有限公司；XMTD-8222型水浴鍋：精宏儀器公司；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Z36HK型高速冷凍離心機(jī)：德國HERMLE公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1榛子抗氧化肽制備

取榛仁分離蛋白粉，加入蒸餾水配成一定底物濃度的溶液，90℃水浴10 min。冷卻后調(diào)節(jié)pH，加入堿性蛋白酶，電位滴定計(jì)滴加堿液維持溶液pH恒定。酶解一定時(shí)間后，溶液90℃滅酶20 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.0，5 000 r/min離心10 min取上清液，冷凍干燥后得到榛仁抗氧化肽。

1.3.2羥基自由基（·OH）清除能力測定

利用Fenton反應(yīng)，參照Amarowicz的試驗(yàn)方法。

1.3.3響應(yīng)面法優(yōu)化榛子抗氧化肽的酶解制備工藝

試驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件，采用響應(yīng)曲面法的中心組合設(shè)計(jì)，以羥基自由基清除能力為指標(biāo)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出影響較大的4個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，開展四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1　Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.3.4還原能力測定

參照Lin［12］的試驗(yàn)方法。

1.3.5ABTS清除作用的測定

參照Memarpoor-Yazdi［13］的試驗(yàn)方法。

1.3.6DPPH自由基清除能力測定

參照Wang［14］的試驗(yàn)方法。

1.3.7Fe2+螯合能力測定

參照Yu-Ling Lee［15］的試驗(yàn)方法。

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面試驗(yàn)

2.1.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

選取底物濃度、酶解溫度、pH、加酶量四因素，酶解時(shí)間為300 min。酶解制備榛子抗氧化肽工藝的響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Box-Behnken design and results for response surface analysis

以·OH清除率為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達(dá)如下：

清除率/%=48.24+1.43X1-3.18X2+5.22X3-0.54X4-2.15X1X2+1.40X1X3-0.95X1X4-1.50X2X3-0.28X2X4-0.80X3X4-2.74X12-4.78X22-4.94X32-3.23X42

由表3方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.976 7修正決定系數(shù)R2Adj=0.953 3，說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對(duì)酶解條件的分析預(yù)測。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析：一次項(xiàng)X1、X2、X3極顯著，二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42極顯著。說明該模型擬合程度良好，用該模型對(duì)酶解制備榛子抗氧化肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

各因素交互作用影響·OH清除率的響應(yīng)面圖見圖1。

表3 回歸模型方差分析Table 3　Regression and the Analysis of Variance

圖1 各因素交互作用影響·OH清除率的響應(yīng)面圖Fig.1　Response surface of mutual influence on scavenging capacities of hydroxyl radical

從圖中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。

2.1.2酶解制備榛子抗氧化肽工藝條件的確定及驗(yàn)證

數(shù)據(jù)分析表明回歸模型存在最大值，酶解制備榛子抗氧化肽的最佳工藝條件為：酶解溫度52.24℃、加酶量7 741.14 U/g、底物濃度5.22%、pH 9.38。此條件下羥基自由基清除率理論預(yù)測最大值為51.74%。采用優(yōu)化后的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將條件修正為：pH9.5，溫度50℃，加酶量8 000 U/g，底物濃度5.0%，在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到清除率為50.98%，與模型預(yù)測值較為吻合。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解榛子分離蛋白工藝條件比較可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.2榛子抗氧化肽粗提物抗氧化活性測定

2.2.1ABTS自由基清除能力測定結(jié)果

榛子抗氧化肽對(duì)ABTS自由基的清除作用見圖2。

圖2 榛子抗氧化肽對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with ABTS radical

由圖2可知，酶解產(chǎn)物濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率就已經(jīng)達(dá)到96.43%。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基清除率在3 mg/mL以后保持在98%～100%，此時(shí)酶解產(chǎn)物和VC對(duì)ABTS自由基的清除率基本相同，即酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率為VC的100%。說明酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除作用，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.2.2DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

榛子抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除能力如圖3所示。

圖3榛子抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with DPPH radical

榛子抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而升高，并在2 mg/mL后逐漸穩(wěn)定，8 mg/mL時(shí)達(dá)到100%，此時(shí)酶解產(chǎn)物和VC對(duì)DPPH自由基的清除率一致，即酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率為VC的100%。說明酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.2.3·OH清除能力測定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4　榛子抗氧化肽對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.4　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with hydroxyl radical

榛子抗氧化肽對(duì)羥基自由基的清除作用隨濃度的增加而顯著提高，當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí)，清除率到達(dá)85%以上，并在24 mg/mL時(shí)達(dá)到100%。

2.2.4總還原能力能力測定結(jié)果

試驗(yàn)過程中，有還原能力的樣品能使鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），產(chǎn)物與FeCl3進(jìn)一步反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光峰的普魯士藍(lán)（Fe4［Fe（CN）6］3），因此測定700 nm處吸光值的高低可以反映樣品還原能力的大小，吸光值越大，則還原能力越強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果如5圖所示。

圖5　榛子抗氧化肽的還原能力作用Fig.5　Reducing power of hazelnut antioxidant peptide

隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽的還原能力逐漸增強(qiáng)，100 mg/mL時(shí)，A700值為1.055，能夠達(dá)到同濃度下EDTA的38.55%

2.2.5Fe2+螯合能力測定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。濃度為10mg/mL時(shí)抗氧化肽的螯合率為90.25%，12 mg/mL時(shí)達(dá)到99.30%?？梢婇蛔涌寡趸膶?duì)Fe2+有較好的螯合能力。

圖6　榛子抗氧化肽對(duì)亞鐵離子的螯合作用Fig.6　Ferrous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide

3　結(jié)論

本試驗(yàn)以長白山榛子分離蛋白為原料，用堿性蛋白酶酶解，響應(yīng)面分析法確定最佳水解工藝條件為：酶解溫度50℃、加酶量8 000 U/g、底物濃度5.0%、pH 9.5。在此條件下進(jìn)行酶解，所得得到羥基自由基清除率為50.98%。

對(duì)酶解制備的抗氧化肽進(jìn)行活性研究，考察了·OH、DPPH以及ABTS自由基清除率、Fe2+螯合能力和總還原能力5個(gè)指標(biāo)。結(jié)果表明，榛子抗氧化肽隨著濃度的升高，對(duì)Fe2+螯合率最高能夠達(dá)到99.3%，對(duì)·OH、ABTS的清除率及DPPH的清除率能夠達(dá)到100%。由此可見榛子抗氧化肽對(duì)幾種自由基有顯著的清除作用，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有廣闊的研究價(jià)值和市場前景。

［1］Tanzadehpanah H，Asoodeh A，Chamani J.An antioxidant peptide derived from Ostrich（Struthio camelus）egg white protein hydrolysates［J］.Food Research International，2012，49（1）：105-111

［2］He R，Ju X，Yuan J，et al.Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation［J］.Food Research International，2012，49（1）：432-438

［3］Kudo K，Onodera S，Takeda Y，et al.Antioxidative activities of some peptides isolated from hydrolyzed potato protein extract［J］.Journal of functional foods，2009，1（2）：170-176

［4］Jamdar S，Rajalakshmi V，Pednekar M，et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties，antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate［J］.Food Chemistry，2010，121（1）：178-184

［5］Zhang T，Li Y，Miao M，et al.Purification and characterisation of a new antioxidant peptide from chickpea（Cicer arietium L.）protein hydrolysates［J］.Food Chemistry，2011，128（1）：28-33

［6］Kou X，Gao J，Xue Z，et al.Purification and identification of antioxidant peptides from chickpea（Cicer arietinum L.）albumin hydrolysates［J］.LWT-Food Scienceand Technology，2013，50（2）：591-598

［7］李楊，江連洲，王勝男，等.水酶法提取榛子蛋白工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2012，33（2）：143-148

［8］Nitride C，Mamone G，Picariello G，et al.Proteomic and immunological characterization of a new food allergen from hazelnut（Corylus avellana）［J］.Journal of proteomics，2013，86（12）：16-26

［9］Costa J，Ansari P，Mafra I，et al.Development of a sandwich ELISA-type system for the detection and quantification of hazelnut in model chocolates［J］.Food chemistry，2015，173：257-265

［10］Beyer K，Grishina G，Bardina L，et al.Identification of an 11S globulin as a major hazelnut food allergen in hazelnut-induced systemic reactions［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2002，110 （3）：517-523

［11］Amarowicz R，Naczk M，Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics of canola hulls［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（7）：2755-2759

［12］Lin S，Jin Y，Liu M，et al.Research on the preparation of antioxidant peptides derived from egg white with assisting of high-intensity pulsed electric field［J］.Food chemistry，2013，139（1/4）：300-306

［13］Memarpoor-Yazdi M，Mahaki H，Zare-Zardini H.Antioxidant activity of protein hydrolysates and purified peptides from Zizyphus jujuba fruits［J］.Journal of Functional Foods，2013，5（1）：62-70

［14］Wang Q，Li W，He Y，et al.Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters（Crassostrea talienwhanensis）［J］.Food chemistry，2014，145（7）：991-996

［15］Lee Y-L，Yen M-T，Mau J-L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus［J］.Food Chemistry，2007，104（1）：1-9

Preparation and Activity of Antioxidant Peptide from Hazelnut in Changbai Mountain

LI Jing-jing1，2，SUN Wen-jia1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，hazelnut nut protein isolated was used as raw material，hydrolyzed by Alcalase to prepare antioxidant peptide.Through Box-Behnken method，the optimal hydrolysis conditions were determined as hydrolysis temperature of 50℃，Alcalase concentration of 8 000 U/g，substrate concentration of 5.0%，hydrolysis pH of 9.5.Assess the antioxidant potential，with the increasing of the peptide solution concentration，scavenging capacities against ABTS and DPPH were 100%at 4 mg/mL，scavenging capacities against hydroxyl radical and reducing power were 85.46%and 0.859 at 8 mg/mL，F(xiàn)errous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide was 99.3%at 12 mg/mL.

hazelnut protein isolated；antioxidant peptide；enzymatic hydrolysis optimization；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.001

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102206）

李京京（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。
*

閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程、糧油科學(xué)與深加工技術(shù)研究。

2015-01-22