黃丹丹，沈 奇，朱秋勁，3，4，*，成 梅，羅自生，茅林春（.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 00；.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽 0008；3.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 00；4.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)分中心，貴州 惠水 0600；.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 3008）

?

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取迷迭香酸工藝及其抗氧化活性

黃丹丹1，沈 奇2，朱秋勁1，3，4，*，成 梅1，羅自生5，茅林春5
（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽 550008；3.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)分中心，貴州 惠水 550600；5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

探究酶法輔助對紫蘇葉中迷迭香酸提取的最佳工藝，并評價其抗氧化活性。通過單因素試驗研究纖維素酶添加量、酶解溫度、時間和pH值對迷迭香酸提取得率的影響，采用響應(yīng)面分析法和Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化纖維素酶法提取迷迭香酸的最佳工藝參數(shù)，并通過迷迭香酸對超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用來研究其抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉迷迭香酸最佳提取工藝為纖維素酶添加量3%、酶解溫度45 ℃、酶解時間12 min、酶解pH 4，此工藝條件下，迷迭香酸提取得率為0.617%，實際值與理論值0.621%不存在顯著性差異，結(jié)果合理可靠，可作為紫蘇葉迷迭香酸的最佳提取工藝條件。紫蘇葉迷迭香酸對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的抗氧化實驗結(jié)果表明，迷迭香酸有較強的抗氧化活性。

紫蘇；迷迭香酸；響應(yīng)面；酶法提??；抗氧化活性

紫蘇（Perilla frutescens L.）又名桂茬，荏子、赤蘇、香蘇等，莖呈方形，葉對稱生長，是一年生紫蘇屬唇形科的植物，可藥食兩用［1-3］。紫蘇在我國的南北各省區(qū)廣泛栽培，尤其是貴州、四川、廣東3省栽培較多，資源分布較為廣闊。據(jù)《貴州植物志·第八卷》記載，貴州產(chǎn)紫蘇1 種、2 變種［4-6］。貴州地區(qū)具有豐富的野生資源及較長的紫蘇栽培歷史，其獨特的喀斯特地貌也使紫蘇產(chǎn)生了豐富的資源。紫蘇葉中含精氨酸、紫蘇醛、薄荷酮、肉豆蔻醚等化學(xué)成分［7］。其中紫蘇葉中酸類和酚類成分是高效的抗氧化物質(zhì)，主要酸類物質(zhì)的活性成分是迷迭香酸，它具有較強的還原力，可以清除一定的自由基［8-11］，阻斷亞銷酸鹽類物質(zhì)的作用，防止脂質(zhì)過氧化，對于人類保健、抗衰老有很大的意義。

目前，從植物中提取分離迷迭香酸的方法有微波輔助提取法、溶劑提取法和熱水浸提法，張鑫等［11］分別通過熱水浸提法和溶劑提取法從紫蘇葉中提取迷迭香酸，結(jié)果表明溶劑提取法迷迭香酸提取得率較高，為2.732 mg/g，而熱水浸提法提取得率為2.105 mg/g。徐春明等［12］使用微波對紫蘇葉中迷迭香酸進(jìn)行提取，結(jié)果表明，在處理時間4.5 min、微波功率560 W、料液比1∶33時，所得迷迭香酸產(chǎn)率為2.55 g/mg。但是這些方法存在提取效率低且資源浪費嚴(yán)重的問題。酶法輔助提取是一種提取得率高和反應(yīng)時間短的高效提取方法，以添加特定的酶提高實驗的提取效率［13-15］。纖維素酶是高效的生物催化劑，可以加速植物組織結(jié)構(gòu)的崩解，有利于迷迭香酸從細(xì)胞內(nèi)溶出，從而提高了迷迭香酸的得率。本研究以酶法輔助提取紫蘇葉中的迷迭香酸，并利用響應(yīng)面統(tǒng)計法優(yōu)化迷迭香酸提取工藝，得到最優(yōu)工藝條件參數(shù)，再通過對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基清除這兩個指標(biāo)進(jìn)行分析［16-17］，研究其抗氧化活性，為紫蘇葉中迷迭香酸化合物的研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉樣品，成熟期葉片，‘奇蘇三號’品種，采摘于貴州省油菜研究所紫蘇種植基地。

迷迭香酸標(biāo)品（純度為98%） 天津士蘭科技有限公司；纖維素酶（酶活力不小于15 000 U/g） 貴州賽蘭博科技有限公司；乙腈、磷酸、無水乙醇、鄰苯三酚等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BPCL-2-JZ-TG微弱發(fā)光儀（高壓900 V） 北京建新力拓科技有限公司；HB 3120U超聲波清洗儀 江蘇漢邦科技有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀 美國Agilent Technologies公司；TGL20M冷凍離心機 長沙邁佳儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香酸含量測定

1.3.1.1 迷迭香酸高效液相色譜的測定條件

從紫蘇中分離迷迭香酸，Model20l高效液相色譜儀，色譜柱：Welch C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：含1%磷酸的蒸餾水-乙腈（60∶40，V/V）；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：20 μL；體積流量：0.5 mL/min。

1.3.1.2 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，并用蒸餾水溶解稀釋質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 mg/L，由高效液相色譜測出迷迭香酸峰面積，并以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，迷迭香酸峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［18］。

1.3.2 工藝流程及操作要點

工藝流程：紫蘇干粉→酶解→提取→抽濾→熱回流→抽濾→殘渣提取→合并提取液。

將新鮮紫蘇葉洗凈烘干粉碎，過60 目篩，稱取1.00 g粉末樣品，置于具塞錐形瓶內(nèi)，加入一定量的纖維素酶。加入50%的乙醇溶液30 mL。調(diào)節(jié)pH值，在水浴鍋中酶解，再經(jīng)20 min熱回流提取后過濾，殘渣以同樣的方法再提取1 次，合并2 次提取液，用蒸餾水定容至100 mL［19］。用高效液相色譜法測得迷迭香酸質(zhì)量濃度，計算得率。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.3 纖維素酶法提取的迷迭香酸的單因素試驗

1.3.3.1 纖維素酶添加量的影響

固定酶解pH 3、酶解溫度40 ℃、酶解時間10 min的條件下，考察酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時提取物中迷迭香酸含量。試驗均重復(fù)3 次。其中，酶添加量計算見式（1）：

1.3.3.2 酶解溫度的影響

固定酶解pH 3、酶添加量1.5%、酶解時間10 min的條件下，考察酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時提取物中迷迭香酸含量。試驗均重復(fù)3 次。

1.3.3.3 酶解pH值的影響

固定酶解溫度 40 ℃、酶添加量1.5%、酶解時間10 min的條件下，考察酶解pH值分別為2、3、4、5、6時提取物中迷迭香酸含量。試驗均重復(fù)3 次。

1.3.3.4 酶解時間的影響

固定酶解溫度40 ℃、酶添加量1.5%、酶解pH 3的條件下，考察酶解時間分別為5、10、15、20、25 min時提取物中迷迭香酸含量。試驗均重復(fù)3 次。

1.3.4 迷迭香酸提取工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，利用Box-Behnken試驗設(shè)計，選取酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間作自變量，以迷迭香酸提取得率為為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗。優(yōu)化提取工藝，具體試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 酶法提取迷迭香酸響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平Table1 Factors and l evels used in resp on ses urface analysis for op timiz in g the enzym aticextracti on of rosema ry acid

1.3.5 抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

用無水乙醇配制1 mol/L的DPPH溶液，在2～6 ℃條件避光保存［20］。分別配制5 組不同質(zhì)量濃度的迷迭香酸提取液、VC和VE溶液。取1.0 mL 測試樣品溶液及1.0 mL DPPH乙醇溶液混勻到同一試管中，37 ℃條件下暗處靜置30 min后，測定517 nm波長處測定其吸光度A1，同時測定1.0 mL測試樣品溶液與1.0 mL無水乙醇混合后的吸光度A2，以及1.0 mL DPPH溶液與1.0 mL溶劑（無水乙醇）混合后的吸光度A3。實驗重復(fù)3 次，取平均值。DPPH自由基清除率按公式（2）進(jìn)行計算：

1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除活性的測定

依照文獻(xiàn)［21］鄰苯三酚-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的方法。出現(xiàn)峰值為E，用雙蒸水作空白對照，測定其峰值F，實驗重復(fù)3 次，按式（3）計算樣品液對超氧陰離子自由基的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出最佳酶解條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以迷迭香酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為：Y=3 799.3X+18 287（式中：X為迷迭香酸質(zhì)量濃度；Y為峰面積），R2=0.999 7。采用高效液相色譜法，根據(jù)所測得峰面積由公式算出迷迭香酸質(zhì)量濃度，得出迷迭香酸含量，進(jìn)而算出得率。

2.2 酶法輔助提取得率單因素試驗結(jié)果

圖1 酶添加量 （A ）、酶解溫度 （B ）、酶解 p H 值 （C ）、酶解時間 （D ）對迷迭香酸得率的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage （A）， hydrolysis temperature （B）， pH （C），and hydrolysis time （D） on the extraction yield of rosmarinic acid

如圖1A 所示，在酶解時間10 min、pH 3、溫度40 ℃條件下，隨著酶添加量的加大，迷迭香酸的得率逐漸提高；當(dāng)加酶量大于2%時，隨著酶添加量增加，迷迭香酸得率趨于平緩，說明在酶添加量大于2.0%后，底物已經(jīng)被完全水解，過多的酶對迷迭香酸起包埋作用，使得提取量降低。因此，纖維素酶添加量最佳為2.0%。

如圖1B所示，在pH 3、酶添加量1.5%、酶解時間10 min條件下，當(dāng)酶解溫度低于 50 ℃時，迷迭香酸得率隨著溫度的上升而顯著增加；當(dāng)溫度高于50 ℃時，迷迭香酸的得率隨溫度升高而逐漸降低。這是由于纖維素酶的最適溫度是45～55 ℃之間，溫度過低會抑制酶的催化活力，過高的溫度會導(dǎo)致酶失活。因此最佳酶解溫度為50 ℃。

如圖1C所示，在酶添加量1.5%、溫度40 ℃、酶解時間10 min條件下，pH值從2.0上升至3.0時，迷迭香酸得率隨著pH值上升而逐漸增加，但當(dāng)酶解pH高于3.0之后，迷迭香酸得率明顯下降。這是因為纖維素酶的最適pH值是4.5～6.5之間，迷迭香酸的最適pH值是2～2.5之間。因此，適宜的酶解pH值為3。

如圖1D所示，在溫度40 ℃、酶添加量1.5%、酶解pH 3條件下，迷迭香酸提取得率隨著酶解時間的延長不斷提高，但當(dāng)提取時間大于15 min 后，迷迭香酸提取得率隨著酶解時間推移而下降。說明纖維素酶需要一定時間才能破壞細(xì)胞壁，使迷迭香酸充分溶出。但酶解時間過長，酶的催化活性降低并且纖維素分解產(chǎn)物與迷迭香酸之間發(fā)生酯化反應(yīng)，使得迷迭香酸得率下降，因此迷迭香酸最佳酶解時間為15 min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Resp on se surface design with experimental and p redicted re sults of rosma r in ic acid extra cti on

利用Design-Expert 8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值與被檢變量之間的邏輯關(guān)系，由Box-Behnken試驗設(shè)計，得到了迷迭香酸提取得率（Y）對纖維素酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）和酶解時間（D）的二次多項式回歸方程：Y=0.60+0.003 92A+ 0.03B+0.015C-0.023D-0.022AB-0.003 25AC-0.005 5AD-0.009 2+BC-0.015BD+0.002 25CD-0.021A2-0.025B2-0.049C2-0.046D2。

為檢驗方程有效性，利用分析軟件對其進(jìn)一步進(jìn)行分析纖維素酶法提取迷迭香酸得率，多元回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果見表3。

表3 迷迭 香酸含量回歸方程各項方差分析Table3 Analysis of variance for theregressi on m odel describ in g rosma r in ic acid extra cti on

表4 回歸模型 可信度 分析Table 4 Reliability analysis of the regressi on m odel

根據(jù)回歸模型方差分析的結(jié)果（表3）和（表4）可以看出，P＜0.05（顯著），差擬項檢驗的P=0.063 1（不顯著），模型的相關(guān)系數(shù)R2=98.53%，調(diào)整決定系數(shù)R=95.48%，表明模型在研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)模型擬合較好且自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著［22-24］。因此，可用此模型來確定紫蘇葉中迷迭香酸的最佳提取工藝。

由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可得知：酶添加量、酶解pH值、酶解溫度一次項，酶解時間、酶添加量、酶解pH值、酶解溫度的二次項的P值均小于0.01，說明對紫蘇葉中提取迷迭香酸得率的影響極顯著，而酶解時間和酶添加量交互項P值小于0.05，說明對提取迷迭香酸得率的影響顯著。對提取迷迭香酸得率的影響的主次因素依次為酶添加量＞酶解溫度＞酶解pH值＞酶解時間。

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多元擬合得出響應(yīng)面圖及對應(yīng)的等高線圖，在固定其他因素水平值的情況下觀察各因素間的交互作用對迷迭香酸提取得率（Y）的影響，所得響應(yīng)面如圖2所示。

從表3的P值和圖2a可知，酶解時間和纖維素酶添加量交互作用為顯著水平（P＜0.05），具體表現(xiàn)為等高線圖呈橢圓形，這是由于紫蘇葉的細(xì)胞壁需要纖維素酶反應(yīng)一段時間后才能充分破碎；由圖2b可知，酶解pH值不變，提取得率隨著酶解溫度的升高先增加后減小；而酶解溫度不變時，迷迭香酸提取得率隨pH值升高而增加。由圖2c可知，固定酶解溫度和酶解時間，迷迭香酸提取得率隨酶添加量增加而增大；pH 2～3之間，固定酶解溫度，迷迭香酸提取得率隨pH值增加而增大，酶解pH值大于3之后，提取得率隨pH值增加呈減小的趨勢，但不明顯。這是因為纖維素酶的最適pH值是4.5～6.5之間［25］，隨著pH值的一直升高，導(dǎo)致酶活性減弱，迷迭香酸得率下降。由圖2d酶解溫度在50 ℃之前，提取得率隨著溫度升高而增大，酶解溫度在50 ℃之后，提取得率隨溫度升高呈略微減小的趨勢。

2.3.3 驗證實驗結(jié)果

通過試驗?zāi)Ｐ头治?，得出迷迭香酸最佳提取工藝為酶解時間12 min、酶添加量3%、酶解pH 4、酶解溫度45 ℃。取1 g紫蘇葉粉末，按照上述最優(yōu)條件，重復(fù)3 次實驗，迷迭香酸平均得率為0.617%，與理論值0.621%偏差不大，且變異系數(shù)為1.88%，證明了響應(yīng)面設(shè)計的結(jié)果可靠合理。

2.4 迷迭香酸抗氧化分析

2.4.1 對DPPH自由基清除能力

圖3 迷迭香酸 、V C、V E對 DP PH 自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of rosemary acid， VC， and VE on DPPH radical

由圖3可知，清除DPPH自由基能力可阻斷脂質(zhì)過氧化的反應(yīng)［26-27］，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到150 μg/mL時，VC、迷迭香酸、VE 3 種物質(zhì)對DPPH自由基清除率均達(dá)到最高值，分別為93.12%、69.28%、57.79%；之后隨著質(zhì)量濃度的增大，3 種物質(zhì)對DPPH自由基清除率開始逐漸下降。但是在同等條件下，清除DPPH自由基能力：VC＞迷迭香酸＞VE。

2.4.2 對超氧陰離子自由基清除能力

圖4 迷迭香酸、VC、VE對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activities of rosemary acid， VC， and VE on superoxide anion radical

由圖4可知，迷迭香酸具有一定清除超氧陰離子自由基的能力，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC、迷迭香酸、VE 3 種物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的上升而增大。但溶液質(zhì)量濃度在1.5 g/L以后時，3 種物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除能力趨勢平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L時，迷迭香酸對超氧陰離子自由基清除率為61.37%，而VC的清除率為79.38%，VE的清除率為51.52%。

3 結(jié) 論

采用纖維素酶法輔助提取紫蘇葉中迷迭香酸有選擇性高、提取時間短、操作簡便的優(yōu)點，通過酶除去紫蘇葉的細(xì)胞壁，使得迷迭香酸大量溶出，顯著提高了迷迭香酸得率。利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取迷迭香酸最佳工藝條件，考察了影響迷迭香酸提取得率的因素的主次順序為酶添加量＞酶解溫度＞酶解pH值＞酶解時間。迷迭香酸最佳提取工藝：酶添加量3%、酶解溫度45 ℃、酶解時間12 min、pH 4，在此最佳條件下，迷迭香酸提取得率為6.17%。且在此條件下的迷迭香酸提取液具有一定的抗氧化作用，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基有較好的清除效果。

［1］ KIM M K， LEE H S， KIM E J.Protective effect of aqueous extract of Perilla frutescens on tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative hepatotoxicity in rats［J］.Food and Chemical Toxicology， 2007， 45（9）: 1738-1744.

［2］ 胡浩斌， 鄭旭東.氣相色譜-質(zhì)譜法測定超臨界流體二氧化碳萃取東紫蘇揮發(fā)油的化學(xué)成分［J］.理化檢驗: 化學(xué)分冊， 2015， 42（9）: 712-714.DOI:10.3321/j.issn:1001-4020.2006.09.006.

［3］ 馬屏南.紫蘇子鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用的藥理研究［J］.中國實用醫(yī)藥， 2015（10）: 159-160.DOI:10.3969/j.issn.1672-2981.2003.03.002.

［4］ 李會珍， 劉艷， 李曉君， 等.不同品種紫蘇種子營養(yǎng)成分及脂肪酸組分分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報， 2014（3）: 276-280.DOI:10.11924/ j.issn.1000-6850.2013-0776.

［5］ 陳謙海.貴州植物志: 第8卷［M］.貴陽: 貴州科學(xué)技術(shù)出版社， 2004: 444-447.

［6］ 陳立亞.迷迭香酸的研究概況［J］.中國藥事， 2008， 21（11）: 923-926.DOI:10.3969/j.issn.1002-7777.2007.11.023.

［7］ 呂曉玲， 姚慧， 張琳琳， 等.酶法輔助提取紫蘇中迷迭香酸條件的研究［J］.中國食品添加劑， 2010（1）: 122-127.DOI:10.3969/ j.issn.1006-2513.2010.01.021.

［8］ 姚慧.紫蘇中迷迭香酸的提取及其在肉制品中的應(yīng)用［D］.天津: 天津科技大學(xué)， 2010.

［9］ LIU J L， ZHENG S L， FAN Q J， et al.Optimisation of highpressure ultrasonic-assisted extraction and antioxidant capacity of polysaccharides from the rhizome of Ligusticum chuanxiong［J］.International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 76: 80-85.

［10］ YANG S Y， HONG C O， LEE H， et al.Protective effect of extracts of Perilla frutescens treated with sucrose on tert-butyl hydroperoxideinduced oxidative hepatotoxi-city in vitro and in vivo［J］.Food Chemistry， 2012， 133（2）: 337-343.

［11］ 張鑫， 張志軍， 李會珍， 等.紫蘇葉迷迭香酸的提取及測定［J］.食品工業(yè)科技， 2009， 30（11）: 235-236.

［12］ 徐春明， 李丹.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取紫蘇中迷迭香酸［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報， 2012， 30（1）: 26-29.DOI:10.3969/ j.issn.2095-6002.2012.01.006.

［13］ SHAO B Z， XIANG J L， QI Y L， et al.Enzymatic demulsification of the oil-rich emulsion obtained by aqueous extraction of peanut seeds［J］.Journal of the American Oil Chemists Society， 2013， 90（8）: 1261-1270.

［14］ ESCRICHE I， KADAR M， JUAN-BORRAS M， et al.Suitability of antioxidant capacity， flavonoids and phenolic acids for floral authentication of honey.Impact of industrial thermal treatment［J］.Food Chemistry， 2014， 142（2）: 135-143.

［15］ 侯學(xué)敏， 李林霞， 張直峰， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（6）: 124-128.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201306027.

［16］ 趙明慧， 呂春茂， 孟憲軍， 等.蘋果渣水溶性膳食纖維提取及其對自由基的清除作用［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（7）: 1-9.

［17］ LI X J， ZHANG Q， ZHANG A L， et al.Metabolites from Aspergillus fumigatus， an endop Hytic fungus associated with Melia azedarach and their antifungal and antifeedant activities and toxicity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60: 3424-3431.

［18］ 譚小鴻， 張援虎， 張榮祥.HPLC法測定草珊瑚中富馬酸含量的方法學(xué)研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2009， 5（8）: 43.

［19］ 李志平， 張弛， 周維清， 等.巢湖藍(lán)藻酸性多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化作用［J］.食品科學(xué)， 2015， 36（5）: 7-12.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505002.

［20］ 劉傳菊.楊梅中酚類物質(zhì)的分離， 分析， 特性及應(yīng)用研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.

［21］ 鄒建國， 劉飛， 劉燕燕， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化微博輔助提取枳殼中總黃酮工藝［J］.食品科學(xué)， 2012， 33（2）: 24-28.

［22］ WU Z， LI H， YANG Y， et al.Ultrasonic extraction optimization of L.macranthoides polysaccharides and its physicochemical properties［J］.International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 74: 224-231.

［23］ 韓楓， 李穩(wěn)宏， 李冬， 等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取薯蕷皂素工藝研究［J］.食品科學(xué)， 2007， 28（7）: 96-100.DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.07.017.

［24］ 劉國榮， 張郡瑩， 王成濤， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件［J］.食品科學(xué)， 2014， 34（3）: 147-152.

［25］ 鄭林龍， 蔣劍平， 許海順， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓多糖的提取工藝及抗氧化活性研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志， 2014， 36（3）: 918-922.

［26］ 張名佳， 蘇榮欣， 齊崴， 等.不同結(jié)晶度纖維素的酶解歷程的SECMALLS研究（英文）［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2011， 19（5）: 773-778.

［27］ 彭長連， 陳少薇.用清除有機自由基DPPH法評價植物抗氧化能力［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2000， 27（6）: 658-661.

Optimization of Enzymatic Extraction of Rosemary Acid by Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity

HUANG Dandan1， SHEN Qi2， ZHU Qiujin1，3，4，*， CHENG Mei1， LUO Zisheng5， MAO Linchun5
（1.School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China； 2.Guizhou Rapeseed Institute，Guiyang 550008， China； 3.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province，Guiyang 550025， China； 4.National Beef Processing Technology Research and Detection Sub-centre， Huishui 550600， China；5.Fuli Insititute of Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

The enzyme-assisted extraction of rosemary acid from Perilla frutescens was optimized applying one-factorat-a-time method （OFAT） and response surface methodology （RSM） and the antioxidant activity of the rosemary acid was investigated.Preliminary investigations were conducted into the effect of enzyme dosage， hydrolysis temperature， time and pH on the extraction yield of rosemary acid.Furthermore， the optimization of process parameters for extracting rosemary acid by cellulase hydrolysis of Perilla frutescens was done by RSM using Box Behnken design.Meanwhile， the antioxidant activity was assessed by superoxide anion and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging assays.The optimal conditions for rosemary acid extraction were determined as follows: enzyme dosage， 3%； hydrolysis temperature，45 ℃； time， 12 min； and pH， 4.The maximum extraction yield of rosemary acid of 0.617% was obtained in experiments conducted under these optimal conditions， being not significantly different from the predicted value （0.621%）.The rosemary acid showed strong scavenging capacity on superoxide anion and DPPH radicals， thereby having potent antioxidant activity.Key words: Perilla frutescens； rosemary acid； response surface methodology； enzymatic extraction； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201614007

TS202.3

A

1002-6630（2016）14-0037-06

黃丹丹， 沈奇， 朱秋勁， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取迷迭香酸工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 37-42.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614007. http://www.spkx.net.cn

HUANG Dandan， SHEN Qi， ZHU Qiujin， et al.Optimization of enzymatic extraction of rosemary acid by response surface methodology and its antioxidant activity［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 37-42.（in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614007. http://www.spkx.net.cn

2015-10-17

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31360373）；浙江大學(xué)馥莉食品研究院資金資助項目（KY201405）；

貴州山區(qū)畜產(chǎn)品系列休閑方便肉食品產(chǎn)業(yè)化技術(shù)成熟化與示范應(yīng)用項目（700952142111）

黃丹丹（1990—），女，碩士研究生，主要從事畜產(chǎn)品加工及貯藏工程研究。E-mail：15285637566@163.com

*通信作者：朱秋勁（1969—），男，教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與安全和畜產(chǎn)品加工研究。E-mail：ls.qjzhu@gzu.edu.cn