黎志鋒 陳國強(qiáng) 張紅衛(wèi) 林嘉鴻

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免疫抑制劑治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)的療效觀察

黎志鋒 陳國強(qiáng) 張紅衛(wèi) 林嘉鴻

【摘要】目的 探討免疫抑制劑治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)的療效。方法 選取2014年1月至2015年7月佛山市第一人民醫(yī)院收治的60例SLE患者為研究對(duì)象，其中未治療和經(jīng)免疫抑制劑治療患者各30例，同時(shí)選取同期健康體檢者60名作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SLE組和對(duì)照組患者外周血T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）的比例，采用ELISA檢測(cè)血清干擾素-γ（IFN-γ）及白細(xì)胞介素-4（IL-4）表達(dá)水平。結(jié)果 SLE組患者CD3+CD4+Th細(xì)胞比例、Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組CD3+CD8+Ts細(xì)胞、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組相比，SLE組患者血清IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值均顯著增高，而IL-4水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；使用免疫抑制劑治療后，患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯增加，CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞比例明顯降低，Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞比值明顯高于未治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 SLE患者經(jīng)常用免疫抑制劑治療后，Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞比例得到有效調(diào)節(jié)和改變，B細(xì)胞數(shù)量下降，而且外周血淋巴細(xì)胞各亞群比例向正常方向調(diào)整，有效改善了患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)狀況。

【關(guān)鍵詞】系統(tǒng)性紅斑狼瘡；淋巴細(xì)胞亞群；干擾素-γ；白細(xì)胞介素-4

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種免疫調(diào)節(jié)紊亂的自身免疫性疾病，常累及全身多系統(tǒng)和器官，患者的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞異?；罨⒚庖吖δ苷系K的同時(shí)產(chǎn)生大量自身抗體，導(dǎo)致組織和器官受損。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有研究顯示，其與細(xì)胞因子表達(dá)紊亂和免疫復(fù)合物清除障礙有一定聯(lián)系［1］。臨床上糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑仍是治療SLE的一線藥物，常用免疫抑制劑為環(huán)磷酰胺（CTX）和嗎替麥考酚酯（MMF）。CTX主要通過阻斷快速分裂的S期細(xì)胞從而抑制T和B淋巴細(xì)胞增殖，MMF發(fā)揮免疫抑制作用是通過選擇性作用于激活的B淋巴細(xì)胞和 T淋巴細(xì)胞，然而免疫抑制劑改善患者病情是否通過影響各淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及比例目前尚未明確定論，有待進(jìn)一步研究。本研究就免疫抑制劑對(duì)SLE患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)的療效進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年7月我院收治的60例SLE患者為研究對(duì)象，其中未治療和經(jīng)免疫抑制劑治療的患者各30例，治療病例接受糖皮質(zhì)激素聯(lián)合CTX或MMF治療時(shí)間不低于2個(gè)月，均符合SLE國際臨床協(xié)作組（SLICC）2009年修訂標(biāo)準(zhǔn)［2］。另外，選取同期健康體檢者60名作為對(duì)照組。所有參與者均簽署了知情同意書，本研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)審批通過。SLE組患者中，男11例，女49例，平均年齡（37.4±2.5）歲。SLE組經(jīng)免疫抑制劑治療組患者中，男5例，女25例，平均年齡（37.2±2.7）歲；未經(jīng)免疫抑制劑治療組患者中，男6例，女24例，平均年齡（37.5±2.3）歲。經(jīng)免疫抑制劑治療組與未經(jīng)免疫抑制劑治療組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。對(duì)照組患者中，男12例，女48例，平均年齡（36.9±2.8）歲。SLE組與對(duì)照組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的試劑及耗材均購自美國BD公司。熒光染料標(biāo)記的直標(biāo)抗體包括鼠抗人 CD45-多甲藻葉綠素蛋白/CD3-異硫氰酸熒光素/CD4-別藻青蛋白/CD8-藻紅蛋白抗體和鼠抗人CD45-多甲藻葉綠素蛋白/CD3-異硫氰酸熒光素/CD16CD56-藻紅蛋白/CD19-別藻青蛋白抗體，以及FACS溶血素等其他常用試劑。使用的檢測(cè)儀器為BD 公司的 FACScalibur流式細(xì)胞儀。干擾素-γ （IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）的ELISA檢測(cè)試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 方法 測(cè)定血清IFN-γ和IL-4：收集血液后，4 ℃下以3000 rpm離心10 min，離心半徑為12.4 cm，分離得到血清，首先加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃反應(yīng)90 min后，采用磷酸緩沖鹽（PBS）溶液或Tris緩沖鹽溶液（TBS）洗板2次，加入生物素化人抗體工作液，37 ℃反應(yīng)60 min后，然后用PBS或TBS洗板3次，加入親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液，37 ℃反應(yīng)30 min后，PBS或TBS洗板5次，加入TMB顯色液，37 ℃反應(yīng)，加入TMB終止液，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定光密度（OD）值，最后計(jì)算出濃度。

外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：使用 CD3/CD8/ CD45/CD4四色方案檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和/CD4+T細(xì)胞；使用CD3/CD16+CD56/CD45/CD19四色方案檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，具體操作方法：取兩支試管分別標(biāo)記為A和B，將10 μl兩種抗體分別加入于A試管和B試管中，分別加入50 μl充分混勻的抗凝全血至試管底部，避免讓血液污染管壁，輕輕搖勻，室溫避光放置15 min，再加入500 μl的FACS溶血素，充分混勻，室溫避光孵育 15 min，漩渦混勻樣品后上機(jī)檢測(cè)。上機(jī)檢測(cè)后用MutiSET自動(dòng)分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　 SLE組與對(duì)照組患者淋巴細(xì)胞免疫表型比較（%，±s）

表1　 SLE組與對(duì)照組患者淋巴細(xì)胞免疫表型比較（%，±s）

組別 　例數(shù) 　CD3+CD4+Th細(xì)胞 　CD3+CD8+Ts細(xì)胞 　Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞 　CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞 CD3-CD19+B細(xì)胞對(duì)照組 　60 　43±63 　29±6 　1.5±0.6 　7.2±4.8 　16±5 SLE組 　60 　30±8 　42±9 　0.8±0.3 　4.0±2.1 　21±6 t值 　　10.25 　9.49 　9.03 　4.77 　5.24 P值 　　0.00 　0.00 　0.00 　0.00 　0.00

2 結(jié)果

2.1 SLE組與對(duì)照組患者淋巴細(xì)胞免疫表型比較 SLE組患者CD3+CD4+Th細(xì)胞比例、Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組CD3+CD8+Ts細(xì)胞、CD3-CD19+B細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 SLE組與對(duì)照組患者血清IFN-γ及IL-4水平比較 與對(duì)照組相比，SLE組患者血清IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值均顯著增高，而IL-4水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 常用免疫抑制劑對(duì)SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平的影響 使用免疫抑制劑治療后，患者CD3+CD4+T細(xì)胞比例明顯增加，CD3-CD19+B細(xì)胞比例明顯降低，Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞比值明顯高于未治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表2　 SLE組與對(duì)照組患者血清IFN-γ 及IL-4水平比較（±s）

表2　 SLE組與對(duì)照組患者血清IFN-γ 及IL-4水平比較（±s）

組別 　例數(shù) 　IFN-γ 　IL-4 　IFN-γ/IL-4對(duì)照組 　60 　14±3 　6.4±1.2 　2.3±1.2 SLE組 　60 　21±5 　3.6±0.6 　5.8±2.5 t值 　　8.52 　15.80 　9.79 P值 　　0.00 　0.00 　0.00

表3　 常用免疫抑制劑對(duì)SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平的影響（%，±s）

表3　 常用免疫抑制劑對(duì)SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平的影響（%，±s）

組別 　例數(shù) CD3+T細(xì)胞CD3+CD4+Th細(xì)胞Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞CD3-CD19+B細(xì)胞未治療組 　30 　68±13 　36±11 　0.7±0.3　22±6治療組 　30 　73±11 　43±13 　0.9±0.4　16±4 t值 　　1.48 　2.12 　2.73 　4.08 P值 　　0.14 　0.04 　0.01 　0.00

3 討論

SLE在世界范圍內(nèi)均有出現(xiàn)，女性發(fā)病率明顯高于男性，發(fā)病比例約為 10：1，主要發(fā)病群體為育齡期婦女，此外還包括少量老人及兒童［3］。目前，通過糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑可控制免疫炎性反應(yīng)，明顯改善預(yù)后，提高生命質(zhì)量。CD4+是輔助性T淋巴細(xì)胞表面的標(biāo)志，而CD8+是抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面的標(biāo)志，CD4+/CD8+是通過檢測(cè)兩種T細(xì)胞的數(shù)量來反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，尤其能表現(xiàn)細(xì)胞免疫狀態(tài)［4］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SLE患者由于 CD4+比例降低以及 CD8+比例增高，使CD4+/CD8+比值降低。有學(xué)者指出，SLE患者反抑制性T細(xì)胞（CD8+VV+）取代了絕大部分CD8+T細(xì)胞，使其不能顯示抑制功能，進(jìn)而阻斷了其對(duì)CD4+T細(xì)胞的抑制作用；CD4+T細(xì)胞減少是因?yàn)镃D4+T細(xì)胞亞群中的抑制誘導(dǎo)T細(xì)胞（CD4+2H4+）降低，不能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［5］。此外，其他學(xué)者研究還顯示，SLE發(fā)病過程中B細(xì)胞的自噬可能受抑制［6，7］，B細(xì)胞存在耐受失衡現(xiàn)象，自身抗原反應(yīng)性B細(xì)胞沒有死亡卻得以生存，從而使細(xì)胞比例升高，B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并分泌大量自身抗體，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生，研究顯示，其與B細(xì)胞活化、B細(xì)胞壽命及B細(xì)胞凋亡相關(guān)的各種細(xì)胞因子處于異常水平相關(guān)［2］。

SLE存在T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子異常，主要是CD4+T細(xì)胞平衡失控和紊亂，細(xì)胞平衡改變導(dǎo)致產(chǎn)生的細(xì)胞因子也發(fā)生改變和偏移，進(jìn)而導(dǎo)致免疫功能異常并造成病理損傷。本研究結(jié)果顯示，SLE患者血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值較正常對(duì)照組明顯增高，而血清IL-4水平較正常對(duì)照組明顯降低。IFN-γ由Th1細(xì)胞分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用；IL-4是由Th2細(xì)胞分泌，可以促進(jìn)抗體產(chǎn)生，參與變態(tài)反應(yīng)性疾病及體液免疫性疾病的發(fā)生［8］。IFN-γ和IL-4作為Th1和Th2細(xì)胞的關(guān)鍵表達(dá)因子，它們表達(dá)異常反映了Th1和Th2細(xì)胞的紊亂，Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞數(shù)量和平衡改變參與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展。然而，SLE患者外周血 Th1類及Th2類細(xì)胞因子表達(dá)情況尚未得到統(tǒng)一的結(jié)論，不同研究人員的結(jié)果存在一定差異。

使用環(huán)磷酰胺和嗎替麥考酚酯等常用免疫抑制劑治療后，患者CD3+CD4+T細(xì)胞明顯增加，Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞升高，CD3-CD19+B細(xì)胞明顯降低，同以往研究結(jié)果［2-4］一致，猜測(cè)常用免疫抑制劑的作用機(jī)制是通過增加CD3+CD4+Th細(xì)胞，從而使SLE患者T細(xì)胞亞群趨向平衡及改善總體功能狀態(tài)，同時(shí)也可以降低患者B細(xì)胞水平，緩解由過量B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體帶來的免疫損傷和不良反應(yīng)。

綜上所述，SLE患者經(jīng)常用免疫抑制劑治療后，Th細(xì)胞/Ts細(xì)胞比例得到有效調(diào)節(jié)和改變，B細(xì)胞數(shù)量下降，而且外周血淋巴細(xì)胞各亞群比例向正常方向調(diào)整，有效改善了患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)的病況。

參考文獻(xiàn)

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佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山 528000

【中圖分類號(hào)】R593.24+1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.07.014

作者簡介：黎志鋒（1978.9-），碩士學(xué)位，主治醫(yī)師。研究方向：風(fēng)濕免疫疾病學(xué)

The Effect of Immunosuppressive Agents on Lymphocyte Subsets in Patients with Systemic Lupus Erythematosus

Li Zhifeng Chen Guoqiang Zhang Hongwei Lin Jiahong

【Abstract】Objective to investigate the effect of immunosuppressive agents on the lymphocyte subsets imbalance in patients with systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods That the July January 2014 to 2015，F(xiàn)oshan City the first people's Hospital of 60 cases of SLE patient chooses as the research object，which was not in treatment and the immune inhibitors in the treatment of patients with 30 cases in each.At the same time，the selection of healthy in the same period，60 patients as control group.The SLE cells，B cells and natural killer （NK） cells in peripheral blood were detected by flow cytometry.The expression levels of interferon gamma （IFN-γ） and interleukin 4 （IL-4） in serum were detected by ELISA.Results SLE patients CD3+CD4+Th cell ratio，Th cell /Ts cells，CD3-CD16+CD56+NK cell proportion of were significantly lower than those of the control group CD3+CD8+Ts cells，CD3-CD19+B cell ratio was significantly higher than that of the control group，differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with the control group，the SLE patients who serum IFN gamma levels，ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly increased，and the level of IL-4 decreased significantly，the differences were statistically significant（P＜0.05）；the use of immunosuppressive therapy，a marked increase in the proportion of patients with CD3+CD4+T cells，CD3-CD19+B cell ratio was significantly decreased，Th cells /Ts cell ratio significantly higher than untreated group，differences were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion SLE patients are often treated with immunosuppressive agents，effectively regulate and change th cell /Ts cell proportion and the decline in the number of B cells，and peripheral blood lymphocyte subsets in proportion to the normal direction adjustment，effectively improve the lymphocyte subsets in patients with disorders of.

【Key words】Systemic lupus erythematosus；Lymphocyte subsets；IFN-γ；IL-4