王想福 孫鳳歧* 石瑞芳 王興盛 葉丙霖 范有福 楊峰

1.甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，蘭州 730050

骨質疏松作為一種常見的代謝性骨骼疾病，常見的疾病好發(fā)因素包括老化、炎癥性腸條件、甲亢以及藥物引起等[1]。國內學者調查發(fā)現(xiàn)，我國50歲以上骨質疏松約有6944萬人，40歲以上漢族人群骨質疏松癥患病率為12.4%，并且女性明顯多于男性[2-3]。國外部分學者調查發(fā)現(xiàn)，美國每年有2500萬骨質疏松癥患者，其中因骨質疏松導致骨折約為150萬人,約為6%[1]，而我國每年因骨質疏松癥導致骨折的人數(shù)卻高于10%。根據2014年我國骨質疏松診斷標準專家共識，目前國內骨質疏松患者人數(shù)仍有逐年增多趨勢，嚴重威脅著人類的健康。因此，骨質疏松的治療已成為亟待解決的社會問題。鑒于目前西藥治療的費用高、療程長、不良反應較多等弊端，大力發(fā)展其他療法治療該病顯得尤為重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路廣泛參與真核生物的細胞增殖、凋亡、分化調節(jié)等過程，并且該通路可促進前體成骨細胞系的增殖、分化等過程，并可誘導部分破骨細胞的分化[4-5]，但是目前缺乏足夠的證據證明該信號通路對成骨細胞的早期生成有直接關系。因而增加對靶向抑制PI3K的認識可對骨質疏松的治療起到重要作用。本研究觀察了靶向抑制PI3K對體外培養(yǎng)破骨細胞的影響，從而更加了解靶向抑制PI3K對骨質疏松治療的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

培養(yǎng)基 MEM，臨用時加10%小牛血清(NBS，Gibco BR)；消化酶(0.25 %胰蛋白酶，0.1 %Ⅱ型膠原酶，美國Sigma公司)；LY294002(美國Sigma公司)；D-Hanks液(美國Hyclone公司)；人重組RANKL蛋白和M-CSF蛋白；2.5%戊二醛固定液；青鏈霉素雙抗、淋巴細胞分離液等。

1.2 主要儀器及器械

二氧化碳培養(yǎng)箱，德國；純水系統(tǒng)，美國；電子天平，上海；超潔凈工作臺，蘇州；倒置相差顯微鏡 Olympus EX70，日本；光學顯微攝影系統(tǒng) Nikon E600型，日本；磁力攪拌器，上海；微量移液器，上海；RT-PCR 儀：LineGene 9600，杭州；低溫臺式高速離心機，上海；引物合成，上海生工。

1.3 實驗對象

健康志愿者外周血核細胞(所有志愿者均簽署倫理知情同意書)

1.4 細胞的培養(yǎng)

1.4.1體外破骨細胞誘導模型的復制：抽取健康志愿者外周血液共計13 ml，其中3 ml用于血常規(guī)檢查，將另外10 ml外周血加入50 ml離心管，并加入等體積的D-hanks液，混合均勻。取4 ml淋巴細胞分離液(室溫)加入15 ml無菌離心管，加入上述混合均勻的血液8ml置于淋巴細胞分離頁面上，離心并吸取含有單個核細胞的白膜層，再加入5倍體積D-hanks液，洗滌并充分離心，細胞沉淀中加入1ml含10%FBS的培養(yǎng)基，吹打均勻并計數(shù)細胞，預留活細胞率>95%，細胞數(shù)>107個的細胞懸浮液進入下一步純化。利用RANKL、M-CSF誘導單個核細胞向破骨細胞分化。接種單個核細胞并置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。將沖洗并收集的離心并用MEM洗滌2次，并將細胞沉淀中加入1 ml含10% FBS及100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，吹打并計數(shù)，預留活細胞率>95%，細胞數(shù)>107個的細胞懸浮液進入下一步培養(yǎng)。將上述細胞調整為107/ml細胞懸液，分成加入RANKL和M-CSF的兩個體系，及時換液，鋪有細胞的骨片轉移至新孔培養(yǎng)，進行TRAP染色。雙蒸水輕柔漂洗2次，加入100 μL蘇木素復染2 min，再次用雙蒸水沖洗細胞核為藍色，干燥后，采用熒光倒置顯微鏡觀察，攝像。取出骨片PBS沖洗，2.5%戊二醛固定10 min，再次PBS沖洗，去離子水超聲沖洗3 min×3次，酒精脫干并甲苯胺藍染色20 s，PBS沖洗，干燥再進行骨吸收陷窩染色觀察。

1.4.2PI3K調控：根據上述方法獲得破骨細胞，并分為對照組(10%FBS+MEM+100U青霉素+100 μg/ml鏈霉素+30 ng/ml RANKL、25 ng/ml M-CSF)和干預(10%FBS+MEM+100U青霉素+100 μg/ml鏈霉素+30 ng/ml RANKL、25 ng/ml M-CSF+5 mg/ml LY294002)，將最終培養(yǎng)得到的細胞進行鏡下觀察破骨細胞活性。提取RNA(均為冰上操作)，分別進行勻漿、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA定量及純度檢測、逆轉錄。PCR所需引物均有上海生工合成，以人β-actin作為內參照，進行凝膠電影檢測模板，進行RT-PCR，每個反應孔15μL體系，每個基因3個復孔，每組均設陰性對照。并進行Western-Blot檢測，具體步驟如下：收集DATS處理后的OCs細胞，冷PBS洗2次后，加入適量的細胞裂解緩沖液，于4℃裂解1 h，10 000 rpm×10 min，吸取上清液，即為細胞總蛋白， BCA法進行蛋白定量。調節(jié)每份樣品濃度，以等量的蛋白量加樣，樣品加入1∶ 4的5×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，經10%SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉至PVDF膜上，膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(封閉液1 ∶200～1 000稀釋)，室溫孵育2小時；TBST洗3次，每次10 min；加相應的辣根過氧化物酶連接的抗兔的二抗(封閉液1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次15 min；用ECL發(fā)光法檢測不同蛋白表達狀況；薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17 .0統(tǒng)計軟件對各組樣本均數(shù)行t檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LY294002對干預組和對照組破骨細胞的活性影響

細胞形態(tài)學觀察可見誘導培養(yǎng)的破骨細胞形態(tài)明顯，干預組破骨細胞樣細胞的形成減少，活性減弱，兩組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖1)。

圖1 LY294002對體外培養(yǎng)的破骨細胞活性影響(×10)Fig.1 Effect of LY294002 on the activity of osteoclasts in vitro (×10)

2.2 RT-PCR檢測c-Fos基因表達量結果

采用RT-PCR技術，對干預組破骨細胞中c-fos mRNA水平進行了檢測。由圖可見，檢測物質的溶解曲線較好，無非特異性雜帶。與對照組比較，LY294002作用的干預組c-fos的mRNA表達水平較對照組降低，有顯著性差異(P<0.01)。(如圖2)

圖2 c-fos 的mRNA表達結果Fig.2 Results of c-fos mRNA expression.注：與干預組比較，**P<0.01

2.3 采用Western-Blot檢測P38蛋白表達水平

Western -Blot檢測結果顯示干預組p-P38蛋白表達水平較對照組降低，具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。(如圖3、4)

圖3 p-p38/p38蛋白檢測結果Fig.3 Results of p-p38/p38 protein test

圖4 p-p38/p38蛋白表達結果Fig.4 Results of p-p38/p38 protein expression.注：與干預組比較，**P<0.05；

3 討論

PI3K信號通路作為細胞中常見的一種，因為該信號通路在腫瘤腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制中占據重要位置[6]。最新研究認為，IGF-1等生長因子可激活PI3K信號通路，從而促進成骨細胞分化并有效抑制其凋亡的重要作用，部分學者通過大量細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，體外破骨細胞上清液也可通過PI3K信號通路調節(jié)成骨細胞增殖和分化，但有些研究認為該信號可能產生抑制成骨細胞分化的作用[7-11]，目前關于PI3K信號通路對體外多能干細胞的分化和調控機制尚未完全闡明[12]。本研究選取健康成人外周血做為實驗對象，探索PI3K信號通路對體外破骨細胞的增殖和分化的影響。增殖和分化的進程十分復雜，并非連續(xù)不斷的過程，尚未發(fā)現(xiàn)能夠促進干細胞增殖和促進定向分化同時進行[13]。本研究通過加入PI3K特異性阻斷劑LY294002，觀察抑制PI3K信號對體外破骨細胞增殖和分化的影響，通過研究發(fā)現(xiàn)，加入PI3K特異性阻斷劑LY294002的干預組相對于對照組破骨細胞樣細胞的形成減少，活性減弱，說明LY294002可能具有抑制體外破骨細胞增殖和分化的作用。

綜上所述， PI3K信號通路參與體外破骨細胞增殖和成骨分化調控的過程。部分學者認為該信號通路可能夠通過多種途徑促進成骨細胞生成，并能夠有效抑制破骨細胞分化，進而能夠在機體雌激素缺乏時盡量減少骨質的丟失，以至提高骨密度和骨礦含量，但是具體作用機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號可能參與骨質疏松疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，并與其他信號通路之間存在共同作用從而引起骨質疏松的作用，目前臨床試驗應用PI3K特異性阻斷劑LY294002治療腫瘤疾病的部分文章已經發(fā)表，但是尚缺乏足夠有效的理論研究表明PI3K特異性阻斷劑LY294002對于人體骨質疏松的具體治療作用機制和臨床治療效果。進一步研究PI3K特異性阻斷劑LY294002對于體外、體內破骨和成骨細胞等細胞行為的具體作用機制[12]，將為基因靶向治 療和干細胞治療提供重要的理論依據和確切的臨床療效。