路武豪郭文濤馮 龍婁衛(wèi)華*（ 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 45005； 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 5808； 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科，河南 鄭州 450008）

感染人乳頭狀瘤病毒的人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞系的建立

路武豪1郭文濤2馮 龍3婁衛(wèi)華1*
（1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052；2 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808；3 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科，河南 鄭州 450008）

目的 建立穩(wěn)定感染人乳頭狀瘤病毒（HPV）陽性的人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞系，為體外研究下咽鱗癌提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。方?重組HPV-16 E6-E7慢病毒，并用其感染人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞。RT-PCR和Western blot檢測慢病毒穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞E6、E7 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 獲得穩(wěn)定感染重組HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu細(xì)胞。結(jié)論 成功建立人乳頭狀瘤病毒感染的人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞系。

感染；人乳頭狀瘤病毒；人喉咽鱗癌；FaDu細(xì)胞

喉鱗癌和喉咽鱗癌是HNSCC中兩種常見惡性腫瘤，多發(fā)于中老年男性，大量抽煙和（或）飲酒是其公認(rèn)的致癌因素，然而有一部分患者并無大量抽煙和（或）飲酒的病史，針對(duì)這部分患者的發(fā)病原因，研究者將目光轉(zhuǎn)向了HPV感染［1］。目前報(bào)道喉鱗癌HPV感染率的文獻(xiàn)很多，但鮮有喉咽鱗癌HPV感染情況的報(bào)道，HPV在喉咽鱗癌中的感染率及常見感染型別均不明確。為了便于體外深入研究HPV 感染的人喉咽鱗癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及HPV 與喉咽鱗癌演進(jìn)的關(guān)系，我們運(yùn)用慢病毒感染的方法建立了HPV陽性的人喉咽鱗癌細(xì)胞株，為體外研究喉咽鱗癌提供了理想的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株：人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞、人喉癌hep-2細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2 制備重組HPV-16 E6-E7慢病毒：全基因合成HPV-16 E6-E7基因，并在兩端分別加上HindIII和KpnI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，與慢病毒載體pLV-EGFP-C在T4連接酶的作用下連接，將連接體系轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑選長出的菌落進(jìn)行測序鑒定，即得到重組HPV-16 E6-E7慢病毒。

1.3 細(xì)胞分組情況：細(xì)胞共分為3組：實(shí)驗(yàn)組（重組HPV-16 E6-E7慢病毒穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞）、載體對(duì)照組（慢病毒空載體穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞）、空白對(duì)照組（未感染慢病毒的FaDu細(xì)胞）。

1.4 重組HPV-16 E6-E7慢病毒的包裝：提取HPV-16 E6-E7慢病毒質(zhì)粒。將Polyfect-V轉(zhuǎn)染試劑和慢病毒質(zhì)粒按照以下比例進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，500 g離心10 min去除細(xì)胞碎片，進(jìn)行病毒滴度測定，-80 ℃凍存。

1.5 E6、E7 DNA PCR檢測：參照QIAGEN公司基因組提取試劑盒提取慢病毒穩(wěn)定感染人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞的基因組DNA。PCR擴(kuò)增鑒定E6、E7 DNA存在情況。

1.6 RT-PCR檢測FaDu細(xì)胞中HPV-16 E6、E7 mRNA表達(dá)：Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，用AMV酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaqMan探針熒光進(jìn)行檢測各組細(xì)胞中E6/E7 mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組HPV-16 E6-E7慢病毒的制備結(jié)果：重組HPV-16 E6-E7慢病毒測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果顯示目的DNA E6-E7序列在750～1000 bp靠近750 bp處有明亮條帶，與設(shè)計(jì)分子量一致。慢病毒滴度測定結(jié)果：重組HPV-16 E6-E7慢病毒滴度為1.15×108MOI，空載體慢病毒滴度為2.09×108MOI。

2.2 HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu細(xì)胞基因組：收集細(xì)胞（約5× 106）提取基因組DNA，E6和E7基因分別PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析照相，可見474 bp的HPV-16 E6 DNA條帶和297 bp的HPV-16 E7 DNA條帶，與設(shè)計(jì)完全一致，證實(shí)HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu細(xì)胞基因組。

2.3 慢病毒穩(wěn)定感染FaDu細(xì)胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表達(dá)：重組HPV-16 E6-E7慢病毒感染FaDu細(xì)胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)。慢病毒穩(wěn)定感染FaDu細(xì)胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表達(dá)，與已知整合有HPV的Hep-2細(xì)胞的表達(dá)水平一致，見圖1。

圖1 慢病毒穩(wěn)定感染FaDu細(xì)胞中E6/E7表達(dá)水平均明顯升高（A.慢病毒感染的FaDu細(xì)胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)；B.慢病毒穩(wěn)定感染FaDu細(xì)胞E6、E7 mRNA均有高水平表達(dá)，與已知整合有HPV的Hep-2細(xì)胞的表達(dá)水平一致；C.慢病毒穩(wěn)定感染FaDu細(xì)胞與已知整合有HPV的Hep-2細(xì)胞均有明顯的E6、E7 蛋白印跡條帶，而空載體對(duì)照FaDu細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的FaDu細(xì)胞則無印跡出現(xiàn)）

3 討 論

本課題所建立的HPV陽性的人喉咽鱗癌系為從分子生物學(xué)水平探討人喉咽鱗癌的發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)防提供了理想的體外模型。目前的喉癌細(xì)胞株如Hep-2細(xì)胞系，來自于高加索黑人，為表皮樣癌，能夠檢測到HPV-18 DNA的存在。國內(nèi)僅見1例喉癌細(xì)胞系建立的報(bào)道但其未進(jìn)行HPV DNA的檢測［2］。

合適的載體是將HPV-16 E6-E7基因整合入FaDu細(xì)胞中的重要環(huán)節(jié)。慢病毒載體具有操作簡便、感染效率高、可感染細(xì)胞種類多、轉(zhuǎn)移基因片段容量大、作用穩(wěn)定、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，是將基因整合入細(xì)胞的良好運(yùn)載工具［3］。本課題通過全基因合成的方法合成HPV-16 E6和E7基因，在兩個(gè)基因中間插入一段編碼10個(gè)中性氨基酸的柔性鏈，以確保E6、E7基因在整合入宿主基因組后可以獨(dú)立表達(dá)E6、E7蛋白。將合成的目的基因與慢病毒載體pLV-EGFP-C重組后測序，結(jié)果顯示目的DNA E6-E7序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，得到正確的重組慢病毒載體，對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行包裝、滴度測定，獲得可用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的慢病毒載體。將帶有目的基因的慢病毒載體和空載體轉(zhuǎn)染入人喉咽鱗癌細(xì)胞FaDu細(xì)胞中，穩(wěn)定培養(yǎng)，采用TaqMan探針熒光檢測法分別擴(kuò)增E6、E7和內(nèi)參β-actin，Western-blot檢測E6、E7蛋白，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染慢病毒載體的FaDu細(xì)胞，陽性對(duì)照為已知感染有高危型HPV的人喉癌Hep-2細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)組慢病毒載體成功將目的基因整合入FaDu細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)E6、E7蛋白。

綜上所述，HPV陽性的FaDu細(xì)胞系的建立有助于研究HPV 感染的人喉咽鱗癌，并對(duì)深入研究HPV 與喉咽鱗癌的關(guān)系也具有重要意義。

［1]吳余，崔靜，王虹，等.HPV16相關(guān)宮頸癌組織中MUC16和E6表達(dá)的關(guān)系［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，50（1）: 41-44.

［2]蔡萍，吳展元，李金榮，等.人乳頭瘤病毒陰性的喉鱗癌細(xì)胞系的建立［J］.中華病理學(xué)雜志，2005，34（8）: 533-536.

［3]劉宏俠，吳蒙，孫玉滿，等.HPV感染及P53與CdC2蛋白表達(dá)對(duì)喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值［J］.中華腫瘤防治雜志，2015，22（7）: 519-523.

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1671-8194（2016）18-0036-02

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